王洪伸, 林涌鵬, 尹萌辰, 常君麗, 陳博來△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨傷一科(廣東廣州 510120)； 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 2骨傷科, 3上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所(上海 200032)

骨肉瘤是起源于骨間葉細(xì)胞的原發(fā)惡性骨腫瘤，約占惡性骨腫瘤的20%，其發(fā)病年齡呈雙峰狀，75%發(fā)生于兒童和青年為原發(fā)性；25%發(fā)生于中老年為繼發(fā)性[1-3]。首次確診后轉(zhuǎn)移患者5年生存率低于30%，具有極高危害性[4]。因此尋找有效的藥物治療靶點臨床迫切需要，而DNA損傷與修復(fù)途徑一直是關(guān)注靶點。骨肉瘤DNA損傷后無法及時修復(fù)，將逐步導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化失控，誘發(fā)惡性增殖[4-5]；而DNA損傷修復(fù)功能過強，將導(dǎo)致細(xì)胞修復(fù)加速，增加腫瘤發(fā)生率或耐藥性和抵抗力[5]。DOT1L催化H3K79甲基化促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、端粒酶沉默[6]。有腫瘤細(xì)胞測序報道和CBioPortal腫瘤數(shù)據(jù)庫表明，DOT1L在部分肉瘤中呈高表達(dá)[7]；而SIRT1在骨肉瘤中呈現(xiàn)促癌基因高表達(dá)特性[8-9]，參與DNA雙鏈損傷修復(fù)[8]，能夠與DOT1L相互作用，增強H3K79甲基化的分布和活性。因此推測DOT1L可能通過DOT1L/H3K79me2-SIRT1及下游途徑調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。為驗證上述科學(xué)假設(shè)，2019年1月至2020年9月，本研究首次采用shRNA敲減骨肉瘤細(xì)胞DOT1L基因，觀察MG63細(xì)胞增殖、遷移、DNA損傷的影響，探討DOT1L成為骨肉瘤治療新靶點的具體機制與潛能。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購自上海中科院細(xì)胞庫；MEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，DOT1L抗體(ab64077)、XPA抗體(ab85914)、XPC抗體(ab155025)、H3K79me2(ab3594)、Histone H3抗體(ab1791)、β-actin抗體 (ab8227)均購自美國Abcam公司，SIRT1抗體(#8469)購自美國Cell Signaling Technology公司。hDOT1L shRNA TRC系列質(zhì)粒購自美國GE Healthcare Dharmacon公司。RIPA裂解液、SDS緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus試劑盒、TUNEL試劑盒、DAPI等均購自上海碧云天公司，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒均購自Invitrogen公司；EMLBSLR顯微鏡購自日本Leica公司、BH-20光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱來自美國賽默飛科技公司、CKX31普通光學(xué)顯微來自日本奧林巴斯公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 MG63細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長融合至70%～80%進(jìn)行傳代。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的方法，將hDOT1L-shRNA及其陰性對照(shRNA-Scramble)轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞，定義為hDOT1L-shRNA組和Scramble組；培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，嘌呤霉素篩選收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR檢測MG63細(xì)胞中DOT1L mRNA的表達(dá) 用RNA提取試劑盒分別提取各組細(xì)胞中的總RNA，將提取的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用RealtimePCR檢測各組細(xì)胞中DOT1L水平。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 7.2 μL，SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10.0 μL，10 μmol/L前后引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，終體積為20 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性10 min(94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s)40個循環(huán)。DOT1L PCR引物序列：正向引物為：5′-GAAGAGCAGTGAGAAGGGC-3′，反向引物為：5′-TTTTCAAGTGTGGACGAGG-3′，GAPDH 正向引物為：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向引物為：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，采用2-△△CT法分析內(nèi)參對照組和目的基因組之間的表達(dá)差異。實驗重復(fù)3次。

1.4 MTT法及檢測MG63細(xì)胞的增殖能力 轉(zhuǎn)染完成后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104·mL-1，接種至96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24、48、72 h后在避光環(huán)境下每孔加入5 mg/mL MTT(10 μL/孔)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)避光孵育3～4 h，棄去上清液，加入200 μL DMSO，室溫于搖床振蕩10 min，用酶標(biāo)儀492 nm波長測出同一時間點OD值，用測得的OD值進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

1.5 劃痕實驗檢測MG63細(xì)胞的遷移能力 取3.5 cm直徑培養(yǎng)皿背側(cè)均勻劃橫線，間隔0.5～1 cm，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105·mL-1，接種于3.5 cm培養(yǎng)皿(2 mL/皿)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后采用Lipofectamine 2000制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去上清液，200 μL槍頭垂直于背側(cè)橫線劃痕，PBS清洗脫落細(xì)胞并棄除上清液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于倒置顯微鏡下記錄0、48 h的細(xì)胞遷移，根據(jù)距離計算細(xì)胞遷移率。實驗重復(fù)3次。

1.6 TUNEL法檢測細(xì)胞DNA損傷 收集對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，Lipofectamine2000與hDOT1L-Scramble、hDOT1L-shRNA質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每孔質(zhì)粒2.5 μg，轉(zhuǎn)染6 h后，更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行檢測，封片拍照。

1.7 彗星實驗檢測細(xì)胞DNA損傷 收集對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板(2 mL/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，制備Lipofectamine2000與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每孔加入質(zhì)粒2.5 μg，轉(zhuǎn)染6 h后更換新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞。彗星實驗采用三層凝膠結(jié)構(gòu)，第1層為正常熔點瓊脂糖，第2層為低熔點瓊脂糖和細(xì)胞核懸浮液的混合層，第3層為低熔點瓊脂糖。裂解時移去每組細(xì)胞蓋玻片，浸入細(xì)胞裂解液，4℃裂解90 min，然后在堿性電泳緩沖液中堿解旋20 min。繼續(xù)進(jìn)行單細(xì)胞電泳，調(diào)整電壓為25 V、電流300 mA，電泳10～15 min結(jié)束后，每片載玻片上滴加100 μL 30 μg/mL的溴化乙錠溶液，避光染色10 min后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算拖尾率。利用Comet Assay Software Pect(CASP 1.2.3 beta 1)圖像分析軟件對彗星圖像進(jìn)行分析。根據(jù)拖尾細(xì)胞中彗星尾部DNA含量(Tail DNA%)，將細(xì)胞DNA損傷程度分為5級。0級：無損傷(正常細(xì)胞)及細(xì)胞損傷率<5%；1級：低度損傷，5%～20%；2級：中度損傷，～40%；3級：高度損傷，～90%；4級：重度損傷，>95%。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析法檢測MG63細(xì)胞DOTL1/SIRT1/XPA軸蛋白表達(dá) 實驗分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法同前，轉(zhuǎn)染48 h后。收集細(xì)胞按照裂解液提取總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取100 μg蛋白加入5×SDS煮沸變性。丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE，根據(jù)目的蛋白制作10%～15%丙烯酰胺凝膠分離膠和5%濃縮膠)，室溫封閉2 h，分別加入一抗(DOT1L、SIRT1、XPA、H3K79me2、Histone H3、β-actin，稀釋比例均為1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌，滴加ECL顯色、定影、掃描免疫印跡。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后MG63細(xì)胞中DOT1L mRNA表達(dá)水平 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組的DOT1L mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示hDOT1L-shRNA轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗。見表1。

表1 RT-PCR法分析兩組MG63細(xì)胞中DOT1L mRNA表達(dá)量

2.2 敲減DOT1L對MG63細(xì)胞的增殖能力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組MG63細(xì)胞24、48、72 h時的OD值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 MTT法檢測兩組MG63細(xì)胞不同時間點的增殖抑制情況

2.3 細(xì)胞劃痕實驗檢測敲減DOT1L對MG63細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組MG63細(xì)的遷移率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、表3。

圖1 DOT1L對MG63細(xì)胞遷移能力的影響

表3 細(xì)胞劃痕實驗檢測兩組MG63細(xì)胞遷移率

2.4 TUNEL法檢測敲減DOT1L對MG63細(xì)胞DNA損傷的影響 TUNEL檢測結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組MG63細(xì)胞的DNA損傷熒光強度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表4。

圖2 敲減DOT1L對MG63 DNA損傷的影響(TUNEL)

表4 TUNEL法檢測兩組細(xì)胞DNA損傷凋亡情況

2.5 彗星實驗檢測下調(diào)DOT1L對MG63細(xì)胞DNA損傷的影響 彗星實驗結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組MG63細(xì)胞DNA損傷率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 DOT1L對MG63 DNA損傷的影響(彗星實驗)

表5 彗星實驗檢測兩組MG63細(xì)胞DNA損傷

2.6 DOT1L對MG63細(xì)胞DOT1L/H3K79me2-SIRT1L-XPA相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與Scramble組相比，hDOT1L-shRNA組MG63細(xì)胞中DOT1L、SIRT1、XPA、H3K79me2蛋白表達(dá)均降低，組蛋白H3表達(dá)總量不變。見圖4。

圖4 下調(diào)DOT1L對MG63 細(xì)胞DOT1L/H3K79me2-SIRT1L-XPA相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨肉瘤因其高惡性度、高致殘率、高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，耐藥性強的等因素導(dǎo)致死亡率居高不下，因此其新藥物靶點開發(fā)一直是研究熱點。最近研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在骨肉細(xì)胞中異常表達(dá)或基因突變，與細(xì)胞周期、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞凋亡多種機制密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)G9a、EHZ2、NSD家族、PRMT1、PRMT4/CARM1、PRMT6等，主要通過調(diào)控組蛋白H3不同位點甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控骨肉瘤進(jìn)展[10]。

DOT1L能催化染色質(zhì)組蛋白H3K79一、二、三甲基化影響轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，具有維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定的重要功能[6，9]。DOT1L在白血病、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等中呈現(xiàn)抑癌/促癌的不同特性[9，11]，但骨肉瘤中尚未研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)敲減DOT1L可抑制MG63細(xì)胞增殖和遷移，延遲DNA損傷修復(fù)。

SIRT1去乙?；痯53、FoxO3a、Ku70、WRN、NBS1等多個DNA雙鏈損傷相關(guān)蛋白，影響其穩(wěn)定性及活性[12-13]。骨肉瘤中SIRT1基因表達(dá)增高，參與骨肉瘤EMT介導(dǎo)的細(xì)胞遷移[8]，調(diào)控SIRT1可改善骨肉瘤的化療后耐藥性[14]。小鼠腎內(nèi)髓質(zhì)上皮細(xì)胞mIMCD3中SIRT1蛋白與DOT1L相互結(jié)合，促進(jìn)DOT1L對H3K79甲基化[15]，表明SIRT1可能參與了DOT1L催化H3K79雙甲基化促進(jìn)DNA修復(fù)。

XPA基因是核苷酸切除修復(fù)(NER)過程必須，其缺失將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NER進(jìn)程阻滯、突變積累，基因組穩(wěn)定性下降，最終導(dǎo)致癌癥發(fā)生或復(fù)發(fā)，提示XPA可能是NER過程的限速酶之一[16]。此外，XPA基因突變導(dǎo)致XPF和XPG在DN中結(jié)合方式改變，由持續(xù)變?yōu)殚g斷機制，酶活性受到限制，抑制NER途徑修復(fù)[17]。在UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中，SIRT1通過調(diào)控XPA乙?；?去乙?；?，并與乙酰化XPA形成蛋白復(fù)合體[18]。

綜合上述分析得到科學(xué)假設(shè)：DNA損傷后啟動修復(fù)中，DOT1L、SIRT1、XPA形成級聯(lián)調(diào)節(jié)。具體機制是：DOT1L催化H3K79 me2交聯(lián)與核小體上，繼而招募SIRT1蛋白與DOT1L蛋白形成復(fù)合體，再招募乙?；疿PA蛋白相互結(jié)合，即DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA級聯(lián)調(diào)節(jié)。

本研究通過敲減DOT1L發(fā)現(xiàn)H3K79me2、SIRT1、XPA蛋白降低，提示DOT1L可能通過本信號級聯(lián)調(diào)節(jié)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和DNA損傷。但上述蛋白的相互結(jié)合，應(yīng)通過免疫共沉淀研究證實，是本研究未完善之處。此外，本研究中未設(shè)空載質(zhì)粒對照對照組，系因項目組shRNA TR系列質(zhì)粒購自美國GE公司，含Scramble質(zhì)粒1個，載shRNA質(zhì)粒5個，未提供空載質(zhì)粒，本研究經(jīng)PCR驗證敲除效率選取效率最佳者進(jìn)行后續(xù)研究，對照組僅使用對照更加嚴(yán)格的Scramble亂序?qū)φ眨ＷC實驗結(jié)果可靠性。

綜上所述，敲減DOT1L基因表達(dá)，可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力，誘導(dǎo)DNA損傷加劇，其機制是通過調(diào)控DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA信號通路實現(xiàn)，但這一作用機制有待進(jìn)一步通過免疫共沉淀等技術(shù)，以及在體內(nèi)和體外實驗證明，這是本研究尚需完善之處。