王強(qiáng)， 林飛， 胡召錕， 林錦源， 黃冰， 潘靈輝

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科(廣西南寧 530021)

急性肺損傷(ALI)是臨床上急性呼吸衰竭的重要病因，可由感染性和非感染性等方面因素引起，ALI可導(dǎo)致肺泡上皮、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和肺血管通透性增加，它的特征是嗜中性粒細(xì)胞大量涌入，肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷導(dǎo)致間質(zhì)性水腫和呼吸功能受損[1-2]。ALI的危險(xiǎn)因素眾多，ALI動(dòng)物模型是研究 ALI 發(fā)病機(jī)制和探索其治療方法的重要手段。雖然沒有任何一個(gè)動(dòng)物模型能完全復(fù)制人類ALI的所有特征，但脂多糖(LPS)誘導(dǎo)ALI被認(rèn)為是理想的動(dòng)物模型之一，能夠較好復(fù)制ALI的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后[3-4]。來自革蘭陰性細(xì)菌外膜的LPS在ALI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中通過產(chǎn)生活性氧(ROS)和炎癥反應(yīng)來增強(qiáng)氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激在LPS誘導(dǎo)的ALI的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用[5-6]。目前ALI的治療尚無特效藥，一般是找出病因，然后對(duì)原發(fā)病進(jìn)行針對(duì)性治療， ALI的常規(guī)治療藥物和方法主要包括機(jī)械通氣療法、舒血管藥、表面活性劑、抗氧化劑、糖皮質(zhì)激素、抗炎藥等。最近，許多學(xué)者開始研究具有抗氧化或抗炎特性的Maresin以及化學(xué)異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)Maresin-1(MaR1)在體內(nèi)、離體實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛞种浦行粤＜?xì)胞的浸潤、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化和表型轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其吞噬功能、刺激組織再生、控制疼痛，從多個(gè)環(huán)節(jié)減輕炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，促進(jìn)炎癥消退，有望成為調(diào)控炎癥反應(yīng)的治療靶點(diǎn)[7]。但有關(guān)MaR1在ALI模型上抗炎效果和作用機(jī)制鮮有報(bào)道研究。因此，本研究收集自2018年1月至2019年8月MaR1治療小鼠ALI模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以探討MaR1治療LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中炎癥的效果以及其潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ALI模型制備 雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠45只，體重20～25 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。2%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。通過氣管內(nèi)滴注LPS(3 mg/kg)誘導(dǎo)小鼠ALI模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均隨機(jī)分為3組。對(duì)照組：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入生理鹽水，1 h后尾靜脈注射生理鹽水。LPS組：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS(3 mg/kg)，1 h后尾靜脈注射生理鹽水。MaR1組：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS(3 mg/kg)，1 h后尾靜脈注射MaR1(1 ng/只)。所有小鼠在氣管給予LPS 24 h后處死。

1.2 小鼠肺組織病理學(xué) 處死小鼠解剖肺組織，并固定在10%中性甲醛緩沖溶液中。將固定的組織包埋在石蠟中，切成4 μm的厚度，去石蠟，然后重新水化。肺損傷程度通過HE染色進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于每個(gè)載玻片，每張載玻片都用光學(xué)顯微鏡以全盲方式手動(dòng)檢查，所有病變均以完全不可見的方式使用10倍和20倍物鏡。主要的組織學(xué)損害包括白細(xì)胞浸潤和肺泡壁增厚，分為以下等級(jí)：0分=無損害，1分=輕度，2分=適中，3分=嚴(yán)重。

1.3 免疫印跡 在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Thermo Scientific)的T-PER組織蛋白提取試劑(Thermo Scientific，美國)中將肺組織勻漿(1/10，W/V)。使用Bradford試劑時(shí)確定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。通過4%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的總蛋白(30 μg)，然后轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上，將膜與封閉液孵育，然后與以下一級(jí)抗體和稀釋液在4℃過夜孵育：Erk，p-Erk，JNK，p-JNK，p38MAPK，p-p38MAPK，p65NF-κB，p-p65NF-κB，β-肌動(dòng)蛋白(1∶1 000稀釋)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，Nrf2，HO-1，NQO1和TNF-α。將膜用含0.05%Tween 20(TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌3次，然后與1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h在室溫下。再次用TBST將印跡洗滌3次。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒形成蛋白條帶，一式兩份測(cè)量每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)。使用化學(xué)發(fā)光掃描儀(LI-COR，美國)確定每個(gè)蛋白條帶的光密度分析。

1.4 氧化應(yīng)激標(biāo)記分析 收集的上清液用于測(cè)定氧化應(yīng)激水平，通過測(cè)定脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物硫代巴比妥酸反應(yīng)性物(TBARS)和谷胱甘肽(GSH)的含量來進(jìn)行。將200 μL組織裂解液與500 μL三氯乙酸混合，并在10 min內(nèi)孵育。在4℃下測(cè)定TBARS。孵育后，將樣品以3 000×g離心10 min。在4℃下。收集上清液并與0.025 mol/L TBA混合并溫育45 min。在65℃下。使用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光度，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(范圍0～20 μmol/L)將其轉(zhuǎn)換為μmol。樣品中的TBASRS水平表示為nmol/mg蛋白。將50 μL肺組織裂解液與350 μL 5%偏磷酸混合，然后渦旋20 s。確定谷胱甘肽濃度。將樣品以3 000×g離心10 min。在4℃下。將上清液與作為顯色劑的5，5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)混合，并添加谷胱甘肽還原酶，并孵育5 min。在室溫下孵育后，將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)加入樣品中，并使用酶標(biāo)儀在415 nm下測(cè)定吸光度。通過在標(biāo)準(zhǔn)曲線上外推計(jì)算GSH的含量，并表達(dá)nmol/mg蛋白。稱重的肺組織用玻璃珠和冰冷的PBS(pH=7.4)研磨，得到1∶9(W/V)的完整勻漿。將勻漿以11 000×g離心15 min。在4℃時(shí)丟棄細(xì)胞碎片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，3組之間差異采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)，然后使用LDS的多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織損傷評(píng)分比較 對(duì)照組肺組織損傷評(píng)分0分，LPS組肺組織損傷評(píng)分(2.81±1.35)分，MaR1組肺組織損傷評(píng)分(1.24±0.73)分。MaR1組與LPS組肺組織評(píng)分之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.96，P=0.000)。經(jīng)LPS誘導(dǎo)ALI的小鼠表現(xiàn)出明顯的組織病理學(xué)變化，包括肺泡壁增厚，支氣管周圍和血管周圍白細(xì)胞浸潤浸潤。用MaR1治療可減少炎癥細(xì)胞的浸潤并減少肺組織中肺泡壁的增厚，見圖1。

注：A：對(duì)照組小鼠肺組織未見損傷表現(xiàn)；B：LPS組小鼠肺泡壁增厚，支氣管周圍和血管周圍白細(xì)胞浸潤浸潤；C：MaR1組小鼠肺泡壁增厚，支氣管周圍和血管周圍白細(xì)胞浸潤浸潤治療后較前好轉(zhuǎn)

2.2 各組小鼠肺組織MAPKs、NF-κB和炎癥介質(zhì)活化比較 與對(duì)照組比較，LPS組肺組織MAPKs蛋白(JNK、Erk和p38MAPK)表達(dá)不同程度上調(diào)(P<0.05)，與LPS組比較，MaR1組治療小鼠肺組織中JNK、Erk、p65NF-κB和p38MAPK的磷酸化顯著下降(P<0.05)。與對(duì)照組比較，LPS組肺組織NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。與LPS組比較，MaR1組治療小鼠肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。與LPS組比較，MaR1治療小鼠的肺組織中iNOS和TNF-α表達(dá)水平顯著減低(P<0.05)，見圖2和表1。

表1 3組ALI小鼠MAPK、p65NF-κB和炎癥介質(zhì)活化結(jié)果對(duì)比

2.3 各組小鼠肺組織Nrf2、抗氧化酶表達(dá)和TBARS GSH比較 與對(duì)照組比較，LPS組Nrf2、抗氧化酶表達(dá)和TBARS GSH之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與LPS組比較，MaR1組小鼠在肺組織中的Nrf2核易位顯著增加(P<0.05)，MaR1組肺組織HO-1和NQO1的表達(dá)水平增加(P<0.05)，MaR1組小鼠顯示出TBARS水平的顯著升高和GSH含量的顯著降低(P<0.05)，見圖3和表2。

表2 3組ALI小鼠肺組織Nrf2表達(dá)、抗氧化酶以及TBARS GSH結(jié)果對(duì)比

3 討論

革蘭陰性細(xì)菌感染居ALI高危因素的首位，LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵成分，也是其致病成分，能誘發(fā)巨噬細(xì)胞活化和釋放炎癥介質(zhì)。當(dāng)其暴露于動(dòng)物和人類中時(shí)，LPS導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌和釋放的一系列炎癥因子(如TNF、IL-1、IL-6)，顯示出微血管肺損傷的主要特征，包括肺組織中的白細(xì)胞積聚、肺水腫、嚴(yán)重的肺部炎癥和病死率[8-9]。LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物模型可重現(xiàn)肺部上皮和內(nèi)皮屏障的急性損傷以及氣隙中的急性炎癥反應(yīng)。因此，LPS誘導(dǎo)的損傷是理想的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，非常類似于ALI/ARDS。LPS誘導(dǎo)ALI給藥途徑包括鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)或通過LPS兩次打擊方法(即小鼠腹膜內(nèi)注射小劑量的LPS，然后氣管滴注中劑量的LPS)等，有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)PS兩次打擊模型似乎更穩(wěn)定和可靠，更接近于人類ARDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但也有學(xué)者研究表明LPS在鼻內(nèi)或氣管內(nèi)給藥后24 h對(duì)小鼠造成ALI，而靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥并未導(dǎo)致組織特異性或類似程度的肺損傷[10-11]。

本研究是小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS，LPS暴露促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成肺組織直接損失，建立了ALI模型。盡管肺損傷的機(jī)制因病因而異，血管通透性增加，細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，白細(xì)胞集聚和表面活性劑功能障礙等上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的損害，從而導(dǎo)致間質(zhì)和肺泡肺水腫，肺泡塌陷和低氧血癥，但當(dāng)前沒有針對(duì)ARDS的特定有效療法。特異性促炎癥消退介質(zhì)是一系列非不飽和脂肪酸合成的脂質(zhì)介質(zhì)，它們具有抗炎和促炎癥消退的作用，主要包括脂氧素(lipoxins，LXs)、消退素(resolvins，Rvs)、保護(hù)素和Maresins等，其中，Maresins是由巨噬細(xì)胞合成的二十二碳六烯酸衍生的促炎癥消退介質(zhì)家族[7]。在炎癥刺激下，二十二碳六烯酸在14-脂肪氧化酶催化下合成中間代謝產(chǎn)物14S- HpDHA，進(jìn)一步在13/14-環(huán)氧化酶的作用下縮合生成Maresin。MaR1是最早發(fā)現(xiàn)的Maresin的化學(xué)異構(gòu)體，能夠抑制中性粒細(xì)胞的浸潤、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化和表型轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其吞噬功能、刺激組織再生、控制疼痛，從多個(gè)環(huán)節(jié)減輕炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，促進(jìn)炎癥消退。

注：3組小鼠肺組織的MAPKs、p65NF-κB、iNOS和TNF-α的蛋白水平表達(dá)情況，β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)參抗體

注：3組小鼠組織的Nrf-2、HO-1和NQO1的蛋白質(zhì)水平表達(dá)情況，β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)參抗體

本研究發(fā)現(xiàn)MaR1治療LPS誘導(dǎo)的ALI模型能夠抑制p65NF-κB的磷酸化并減少促炎介質(zhì)，表明MaR1可能通過抑制NF-κB活化來抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子的抑制。因?yàn)長(zhǎng)PS可以通過與TLR4結(jié)合來激活免疫細(xì)胞，從而觸發(fā)TRIF或MyD88依賴性途徑。這些途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)MAPK和NF-κB的激活。在MAPK家族中，JNK、Erk和p38MAPK等一系列蛋白激酶參與多種細(xì)胞反應(yīng)，包括炎癥相關(guān)途徑[12-13]。這些MAPKs被細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活，繼而促進(jìn)炎癥過程中早期促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有學(xué)者研究表明LPS誘導(dǎo)的ALI模型中MAPK信號(hào)通路被激活，與本研究結(jié)果類似。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MaR1治療可有效抑制LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中JNK、Erk和p38MAPK的磷酸化，表明MAR1治療通過阻斷MAPK的活化有效地抑制了炎癥反應(yīng)。NF-κB是各種炎癥介質(zhì)/細(xì)胞因子的上游調(diào)節(jié)劑，在調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。在NF-κB信號(hào)通路中，IκB激酶可以使IκB磷酸化，然后將p65-p50二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，并與DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)iNOS和TNF-α等促炎性基因的表達(dá)[14-15]。LPS可以通過激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)來誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放，MaR1治療能抑制NF-κB可以減弱LPS誘導(dǎo)的ALI。

本研究發(fā)現(xiàn)MaR1治療后肺組織中HO-1和NQO1的表達(dá)水平高于LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠，表明MaR1可能通過HO-1和NQO1的上調(diào)而促進(jìn)Nrf2的核易位。氧化應(yīng)激在ALI的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，氧化應(yīng)激特征是ROS的積累促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和促炎細(xì)胞的浸潤而加劇了炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致ALI[16-18]。MaR1有效減弱了脂質(zhì)過氧化作用，表明MaR1具有強(qiáng)效的抗氧化特性。 Nrf2在許多與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中起著至關(guān)重要的作用，其通過ARE介導(dǎo)的HO-1和NQO1等多種抗氧化酶保護(hù)ROS免受各種組織和細(xì)胞的損傷[19-20]。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，隨后與ARE結(jié)合，從而導(dǎo)致HO-1和NQO1的表達(dá)。它提供了抗氧化應(yīng)激的宿主防御機(jī)制，并有助于抗炎活性，增強(qiáng)Nrf2激活可以減弱LPS誘導(dǎo)的ALI[21]。故認(rèn)為MAR1對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI的氧化應(yīng)激的保護(hù)作用機(jī)制可能是通過Nrf2的激活及其有效的抗氧化活性相關(guān)。

綜上所述，MaR1治療能有效抑制MAPK和p65NF-κB的磷酸化，達(dá)到ALI模型小鼠炎性細(xì)胞向肺組織的浸潤，Nrf2通過ARE介導(dǎo)的HO-1和NQO1等多種抗氧化酶保護(hù)ROS免受各種組織和細(xì)胞的損傷。MaR1治療對(duì)炎癥內(nèi)源性調(diào)控的作用， 它將有望成為ALI調(diào)控炎癥反應(yīng)的治療靶點(diǎn)。