楊 晴，馮承濤

(安徽理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，安徽淮南 233100)

肝臟因具有較多的代謝酶而附有解毒和代謝等功能，是脊椎動(dòng)物的主要代謝器官，參與物質(zhì)代謝過程。細(xì)胞色素P450 酶(CYP450)存在于肝微粒體中，對(duì)體溫調(diào)節(jié)有重要影響，同時(shí)在藥物代謝的過程中起關(guān)鍵作用。CYP450亞家族種類繁多，

CYP3A4

是亞家族種類之一。

CYP3A4

是一種含有附帶一個(gè)鐵原子的亞鐵血紅素基團(tuán)的蛋白，也是參與黃曲霉毒素代謝的主要I 相代謝酶，在人體肝臟中含量豐富，具有致癌活性的AFB18、9-環(huán)氧化合物就是在該酶的作用下由黃曲霉毒素B1(AFB1)活化而成的。Ng等測(cè)量了肝癌患者、其他慢性肝病患者和健康對(duì)照者的CYP3A4酶活性，以尿中的6β-羥基氫化可的松為研究指標(biāo)，結(jié)果顯示：健康對(duì)照和其他慢性肝病患者尿中的6β-羥基氫化可的松水平明顯低于肝癌患者；肝癌的危險(xiǎn)性與CYP3A4酶活性有一定的關(guān)系。楊立群等研究表明：相較于正常肝，肝炎后肝硬化患者

CYP3A4

的P450 含量幾乎沒有變化，其微粒蛋白也無明顯改變；但其蛋白表達(dá)與活性明顯下降，基因表達(dá)也有所下降。生物信息學(xué)是一門集生命科學(xué)及相關(guān)學(xué)科交叉融合的前沿科學(xué)，可依托蛋白質(zhì)和基因組學(xué)序列信息分析序列的結(jié)構(gòu)功能。伴隨著計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存的快速發(fā)展，大數(shù)據(jù)及相關(guān)軟件和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫在生命科學(xué)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。鑒于此，綜合利用生物信息學(xué)方法，選用DNASTAR、ProtParam、SignalP5.0、MEGA 等生物信息學(xué)平臺(tái)，進(jìn)一步探究人源肝臟細(xì)胞色素代謝酶

CYP3A4

基因的生物學(xué)特性，以期為肝癌、肝炎等疾病機(jī)制及其藥物研發(fā)提供參考。

1 資料和方法

1.1 資料

在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI 基因序列數(shù)據(jù)庫中檢索序列信息，下載人源肝臟細(xì)胞色素代謝酶

CYP3A4

基因的mRNA 序列(登錄號(hào)：NM_001202855.3)及其編碼的蛋白質(zhì)序列(登錄號(hào)：NP-001189784.1)，備用。

1.2 方法

1.2.1 基因編碼區(qū)堿基序列組成和蛋白理化特性分析

用DNASTAR 系統(tǒng)的EditSeq 模塊，以及ExPASy 數(shù)據(jù)庫中的ProtParam(http://www.exPasy.org/tools/protparam)分別對(duì)人源

CYP3A4

基因編碼區(qū)堿基序列組成和蛋白理化特性進(jìn)行分析。

1.2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA 軟件分析人源CYP3A4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)軟件構(gòu)建蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 蛋白親/疏水性分析

用Protscale(https://web.expasy.org/protscale)軟件預(yù)測(cè)人源CYP3A4蛋白的親/疏水性。

1.2.4 蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析

分別用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0)軟件對(duì)人源CYP3A4蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)分析

用NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc 1.0)和NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos 3.1)分別預(yù)測(cè)人源CYP3A4蛋白的N-糖基化位點(diǎn)及其磷酸化位點(diǎn)。

1.2.6 B細(xì)胞抗原表位分析

用IEDB(http://www.iedb.org/)提供的蛋白質(zhì)抗原表位在線分析工具預(yù)測(cè)人源CYP3A4 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位。

1.2.7 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及通路分析

主要通過String 數(shù)據(jù)庫完成有關(guān)CYP3A4 蛋白信號(hào)通路分析，以排列靠前10 位蛋白交互內(nèi)為檢索條件，構(gòu)建蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。選擇homo sapiens，將閾值調(diào)至高置信度0.700。

1.2.8 蛋白氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

選用MEGA5.0 軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)

CYP3A4

氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建與之同源性相關(guān)聯(lián)的不同物種的

CYP3A4

氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中自展值(Bootstrap)設(shè)為1 000 次。選用DNASTAR 軟件中的MegAlign 模塊(Jotun Hein 法，PAM 設(shè)為250)分析人源

CYP3A4

氨基酸序列和其他相關(guān)物種與人源

CYP3A4

氨基酸序列的同源性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP3A4基因序列

人源

CYP3A4

基因mRNA 序列的編碼區(qū)長為1 509(位于104～1 612 處)，共編碼502 個(gè)氨基酸。人源

CYP3A4

基因編碼區(qū)的A，G，T，C 體積分?jǐn)?shù)分別為29.16%，21.80%，27.24%，21.80%，其中A+T 體積分?jǐn)?shù)(56.40%)高于C+G體積分?jǐn)?shù)(43.60%)。

2.2 CYP3A4蛋白理化性質(zhì)

經(jīng)ProtParam軟件分析人源CYP3A4蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示CYP3A4 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為57 256.10，分子式為CHNOS，理論等電點(diǎn)為8.27，脂肪系數(shù)為95.86，平均親水系數(shù)為-0.038(親水)，不穩(wěn)定系數(shù)為41.25，略高于閾值40，CYP3A4 蛋白在體外不穩(wěn)定。序列N-末端是甲硫氨酸，在酵母和大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)半衰期分別為20，10 h，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h。CYP3A4蛋白氨基酸組成如表1。由表1可看出：CYP3A4蛋白氨基酸組成中，色氨酸(Trp)占比最低(占0.8%)，亮氨酸(Leu)占比最高(占11.8%)；帶正電荷的氨基酸(精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys))殘基數(shù)為60 個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu))殘基數(shù)為57個(gè)。

表1 CYP3A4蛋白氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of CYP3A4 protein

2.3 CYP3A4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，人源CYP3A4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包 含223 個(gè)α 螺 旋(占44.42%)、27 個(gè)β 轉(zhuǎn) 角(占5.38%)、72 個(gè)延伸鏈(占14.34%)和180 個(gè)無規(guī)卷曲(占35.86%)。經(jīng)程序分析人源CYP3A4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果完全一致。

2.4 CYP3A4蛋白親/疏水性

人源CYP3A4 蛋白的親/疏水性結(jié)果如圖1。由圖1 可看出：人源CYP3A4 蛋白疏水性最強(qiáng)位于第18 位點(diǎn)處，得分為3.156；在第420，421 位點(diǎn)處親水性最強(qiáng)，得分為-2.744。通過比較疏水性和親水性區(qū)域可知，人源CYP3A4蛋白為一種親水性蛋白質(zhì)。

圖1 CYP3A4蛋白疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity analysis of human CYP3A4 protein

2.5 CYP3A4蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)

人源CYP3A4信號(hào)肽的酶切位點(diǎn)是根據(jù)綜合剪切位點(diǎn)分值的最大值來判斷的，信號(hào)肽分值可用于辨別有無蛋白分泌。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：CYP3A4 蛋白信號(hào)肽的酶切位點(diǎn)位于第28～29 bp處；CYP3A4蛋白存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。

2.6 CYP3A4糖基化和蛋白磷酸化位點(diǎn)

人源CYP3A4 蛋白N-糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果如圖2。由圖2 可得，人源CYP3A4 蛋白分別在第360 和461 處含有2 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。蛋白磷酸化位點(diǎn)結(jié)果顯示，人源CYP3A4 蛋白含47 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為19 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(位于27，42，92，103，136，138，166，171，187，207，263，283，309，322，362，408，432，470和 498 處)、22 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(位于18，29，119，131，134，139，186，188，251，258，277，280，285，290，311，314，397，419，463，477，494和500處)和6 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)(位于68，75，346，406，429和431處)。

圖2 CYP3A4蛋白N-糖基化位點(diǎn)分析Fig.2 N-glycosylation sites analysis of CYP3A4 protein

2.7 B細(xì)胞抗原表位

CYP3A4

基因的B 細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果如圖3。由圖3 可看出，該基因B細(xì)胞抗原表位有20 處，分別位于37～45 位氨基酸(aa)，75～84 aa，88～89 aa，106～109 aa，120～126 aa，137～140 aa，162～171 aa，195～205 aa，258～265 aa，278～287 aa，307～309 aa，323～331 aa，337～347 aa，400～402 aa，404～413 aa，418～429 aa，431～440 aa，467～471 aa，482～485 aa和487 aa處。

圖3 CYP3A4蛋白B細(xì)胞抗原表位分析Fig.3 Epitopes analysis CYP3A4 protein B cell antigen

2.8 CYP3A4基因GO富集和KEGG通路

人源CYP3A4 的相關(guān)蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖4。由圖4 可得：CYP3A4 蛋白與尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)、尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A8(UGT1A8)、尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7(UGT2B7)等10 個(gè)蛋白構(gòu)成交互網(wǎng)絡(luò)；PPI 網(wǎng)絡(luò)共有11個(gè)節(jié)點(diǎn)，10條邊。經(jīng)進(jìn)一步分析可知其平均節(jié)點(diǎn)度和聚類

P

值分別為4.91和7.76E-06。

圖4 CYP3A4相互關(guān)聯(lián)蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.4 CYP3A4 interrelated protein network map

對(duì)

CYP3A4

生物學(xué)過程(biologiccal process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)及KEGG 通路進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2 可看出：CYP3A4 蛋白主要涉及聯(lián)苯分解、膽紅素結(jié)合、黃酮代謝、單帖代謝、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)控等系列生物過程，據(jù)文獻(xiàn)[14-15]可知中藥黃酮類成分具有廣泛的藥理及生物活性，很多中藥黃酮提取物及黃酮單體化合物對(duì)CYP3A4 酶具有明顯的抑制作用或誘導(dǎo)作用；CYP3A4蛋白在咖啡因氧化酶活性、N，N-二甲基苯胺單氧酶活性、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性、類固醇羥化酶活性等方面發(fā)揮重要作用；細(xì)胞組分主要集中在膜、質(zhì)膜和細(xì)胞體中；蛋白網(wǎng)絡(luò)主要涉及的KEGG 信號(hào)通路包括抗壞血酸和阿爾尿酸代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、視黃醇的新陳代謝和膽汁分泌等。該結(jié)果也在一定程度上印證了細(xì)胞色素P450體系是藥物氧化代謝的核心體系，其中含量最豐富的是CYP3A亞家族，該酶系能催化大多數(shù)的處方藥、環(huán)境致癌物、類固醇激素等的代謝。

表2 CYP3A4及相關(guān)基因GO功能注釋和KEGG通路富集Tab.2 GO functional annotation and KEGG pathway enrichment of CYP3A4 and related genes

續(xù)表2

2.9 CYP3A4蛋白系統(tǒng)進(jìn)化和同源性

構(gòu)建的不同種屬

CYP3A4

氨基酸序列進(jìn)化樹如圖5。由圖5可得，人源CYP3A4蛋白與同屬靈長類的Pan troglodytes(黑猩猩)處在同一個(gè)分支，其親緣關(guān)系最近，其次是Macaca mulatta (獼猴)、Macaca fascicularis (食蟹猴)、Papio anubis (東非狒狒)，與Xenopus tropicalis (熱帶爪蟾)、Gallus gallus (雞)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度整體高。

圖5 CYP3A4蛋白進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CYP3A4 protein

由DNASTAR 軟件中的MegAlign 模塊對(duì)選取的9個(gè)物種進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比分析，結(jié)果如圖6。

圖6 人和其他物種CYP3A4蛋白的氨基酸序列同源性分析Fig.6 Amino acid sequence homology of CYP3A4 protein of homology with other species

由圖6 可看出，人源CYP3A4 蛋白(NP_001189784.1) 與獼猴(NP_001035504.1)、食蟹猴(NP_001271463.1)、黑 猩 猩(NP_001116247.1)、東 非 狒 狒(XP_003895805.1)、牛(NP_024840513.1)、狗(XP_038524063.1)、雞(NP_001316437.1)、熱帶爪蟾(NP_001015786.1)的氨基酸序列同源性分別為93.4%，93.6%，98.6%，94.4%，76.9%，80.1%，60.0%和60.5%。由此可知：人源CYP3A4 蛋白在不同物種中同源性較高，在進(jìn)化中則比較保守，該結(jié)果由CYP3A4蛋白氨基酸序列得到；人源CYP3A4蛋白氨基酸序列與熱帶爪蟾和雞的同源性最低，狗和牛次之，在黑猩猩、東非狒狒、食蟹猴、獼猴中同源性最高，與進(jìn)化樹比對(duì)結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

利用生物信息學(xué)的方法探究人源

CYP3A4

基因的生物學(xué)特性，得到如下主要結(jié)論：1)人源

CYP3A4

基因的編碼區(qū)長1 509 bp，編碼502個(gè)氨基酸，CYP3A4蛋白分子式為CHNOS，相對(duì)分子質(zhì)量為57 256.10，脂肪系數(shù)為95.86，CYP3A4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋(44.42%)、β 轉(zhuǎn)角(5.38%)、延伸鏈(14.34%)和無規(guī)卷曲(35.86%)構(gòu)成，該蛋白存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽位于第28～29 bp處，是親水性蛋白，有2個(gè)N—糖基化位點(diǎn)和47個(gè)磷酸化位點(diǎn)，存在20個(gè)B細(xì)胞抗原表位。

2)通過String數(shù)據(jù)庫得到人源CYP3A4蛋白相關(guān)功能和通路，CYP3A4蛋白在聯(lián)苯分解、黃酮代謝、葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性的負(fù)調(diào)控、視黃醇的新陳代謝和膽汁分泌等系列信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，是藥物氧化代謝的核心體系。

3)經(jīng)同源性分析和進(jìn)化樹顯示，黑猩猩、東非狒狒和獼猴與人源CYP3A4 蛋白相似性最高，親緣關(guān)系最近。