邱文旭，楊芳芳，賈玉萍，封金華，李健平，李維煥，蓋宇鵬，程顯好**

[1.金孢（山東）食品有限公司，山東 東營 257300；2.山東美奧生物工程有限公司，山東 東營 257300；3.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025]

蛹蟲草（Cordyceps militaris Link.）又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬真菌界（Fungi）雙核菌亞界（Bikarya） 子囊菌門 （Ascomycota） 子囊菌綱（Ascomycetes） 糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae） 肉座菌目 （Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬（Cordyceps），是我國重要的蟲草資源[1]。主要分布于我國山西、陜西、吉林、河北等省區(qū)，是極具開發(fā)價值的食藥兼用滋補(bǔ)真菌[2]。蛹蟲草的有效成分及藥理作用與冬蟲夏草相似，甚至高于冬蟲夏草，其被認(rèn)為是冬蟲夏草理想的替代品[3-5]。研究證實(shí)，蛹蟲草含有豐富的蟲草類主要活性物質(zhì)，如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷等，具有滋補(bǔ)營養(yǎng)、增強(qiáng)免疫及抗腫瘤、抑制病毒、抵抗輻射、抗菌消炎等多種營養(yǎng)、保健及藥用功效[6-7]，東亞地區(qū)將其廣泛作為食用及藥用保健佳品，我國也于2009年批準(zhǔn)其為新資源食品[8]。

目前我國蛹蟲草栽培技術(shù)已經(jīng)非常成熟，可以在人工合成培養(yǎng)基上栽培獲得蛹蟲草子實(shí)體[9]，但蛹蟲草菌株退化現(xiàn)象嚴(yán)重是產(chǎn)業(yè)發(fā)展中遇到的普遍性難題，主要表現(xiàn)為優(yōu)良菌種短期內(nèi)會出現(xiàn)不長子實(shí)體、子實(shí)體產(chǎn)量或有效成分含量嚴(yán)重下降等不良狀況[10]，此現(xiàn)象將給蛹蟲草產(chǎn)業(yè)帶來無法估計的損失[11]。

野生食用菌的馴化及單孢雜交育種是其生產(chǎn)有效的育種手段。通過采集山東省的野生蛹蟲草資源，選育性能優(yōu)良的菌株，在此基礎(chǔ)上通過單孢雜交育種進(jìn)一步提高其生產(chǎn)性能，以獲得蛹蟲草新品種，滿足企業(yè)生產(chǎn)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；磷酸二氫鉀，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；硫酸鎂，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；酵母浸出粉，成都市科隆化學(xué)品有限公司；瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；乙腈，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；均為分析純試劑。馬鈴薯、燕麥為市購。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1 g，水1 000 mL，pH自然。

栽培培養(yǎng)基：燕麥35 g、蒸餾水55 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

PR224ZH/E電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSDWX2200臥式智能精密搖床，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2D型（實(shí)用垂直新穎）雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；WND-500A型高速中藥粉碎機(jī)，浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司；H1705醫(yī)用離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-100TDB高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LC1000高效液相色譜分析儀，北京澳諾科技有限公司；DGX-9243 B-1鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 野生蛹蟲草的采集、菌種分離及栽培性能測試

在每年秋季到山東省蒙山、昆崳山等地采集野生蛹蟲草標(biāo)本。標(biāo)本帶土采集后置于標(biāo)本采集盒中，當(dāng)天或次日帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離。菌種的分離按照常規(guī)食用菌組織分離法進(jìn)行[12]。分離菌絲于PDA培養(yǎng)基25℃左右恒溫箱培養(yǎng)約20 d。后將蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于24℃～25℃、130 r·min-1搖床中培養(yǎng)9 d～10 d，獲得液體菌種。每瓶燕麥培養(yǎng)基中接入5 mL液體菌種，25℃避光培養(yǎng)10 d后，搔菌去除培養(yǎng)基表面老菌絲，移入光照培養(yǎng)室20℃培養(yǎng)，直至采收。

1.3.2 子囊孢子收集與分離

采用鉤懸法收集蛹蟲草子囊孢子。在超凈工作臺取3根～4根成熟、生長健壯蛹蟲草子實(shí)體，用無菌棉線將其懸掛于三角瓶內(nèi)，勿使其接觸三角瓶底部、四周瓶壁及瓶口，用封口膜將三角瓶瓶口密封。放入約25℃的恒溫箱中，靜置24 h后將子實(shí)體取出。向三角瓶中加入50 mL無菌水后獲得孢子液，加水稀釋1 000倍～10 000倍。取0.1 mL涂布于PDA平板上，25℃培養(yǎng)至肉眼可見菌落后，挑取單個菌落至PDA培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單孢雜交

采取兩點(diǎn)法進(jìn)行單孢雜交[13]。在超凈工作臺挑取長勢良好的蛹蟲草單孢菌絲，兩兩配對接種于9 cm平板中，2個接種點(diǎn)間相距1.0 cm～1.5 cm，共接種80個雜交平板，并進(jìn)行編號，將其放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d～9 d。培養(yǎng)后挑取2個親本結(jié)合處的菌絲，接入PDA平板中。放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20 d，觀察菌絲生長狀態(tài)，淘汰菌絲長勢差、不轉(zhuǎn)色的雜交菌株。

1.3.4 雜交菌株出菇試驗(yàn)

雜交菌株轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于24℃～25℃、130 r·min-1搖床中培養(yǎng)9 d～10 d，獲得液體菌種。子實(shí)體燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)方法參考1.3.1。并測定蛹蟲草生物轉(zhuǎn)化率，成熟后，將其子實(shí)體全部摘下，稱重記為鮮重。生物轉(zhuǎn)化率（V，%）的計算公式為：

V=（G1/G2）×100%

式中：G1為蛹蟲草子實(shí)體鮮重（g）；G2為培養(yǎng)料干重 （g）。

1.4 蟲草素和腺苷的測定

蛹蟲草供試菌株與其雜交菌株的子實(shí)體和燕麥培養(yǎng)基中蟲草素與腺苷的測定參考標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2116-2012蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法[14]。待燕麥培養(yǎng)基中蛹蟲草子實(shí)體成熟后，摘下全部子實(shí)體，將子實(shí)體和燕麥培養(yǎng)基分別放入烘干箱中，烘干后研磨備用。測定時，先將研磨樣品過80目篩，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品于100 mL容量瓶中，加水約80 mL，置于超聲波儀器中超聲提取3 h，取出后加水定容。取1 mL樣液8 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜于試管中，用LC1000型高效液相色譜分析儀測定樣品的蟲草素和腺苷。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生蛹蟲草的菌種分離及栽培性能測試

2018年～2019年，從山東的蒙山、昆崳山等地共采集到野生蛹蟲草標(biāo)本36個，并成功分離純化出菌株32株。

對32個菌株采用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行了栽培性能測試，其中出草菌株23個，其生物轉(zhuǎn)化率和蟲草素、腺苷含量見表1。

表1 野生蛹蟲草菌株的栽培性狀統(tǒng)計表Tab.1 Statistical table of cultivation characters of wild Cordyceps militaris strains

由表1所示，YC05菌株表現(xiàn)出高產(chǎn)性狀，生物轉(zhuǎn)化率到了120%以上，YC03、YC04菌株則表現(xiàn)出高蟲草素產(chǎn)量性狀，其子實(shí)體中蟲草素含量分別達(dá)到了 359.18 mg·100-1g-1和 502.38 mg·100-1g-1，遠(yuǎn)高于其他菌株。野外采集蛹蟲草標(biāo)本分離菌株在栽培性能方面表現(xiàn)出很大的差異性，符合蛹蟲草易變異的生物學(xué)特性[15]，也為育種工作提供了豐富多樣的親本材料。

2.2 子囊孢子收集

性狀最優(yōu)菌株YC03、YC04、YC05子囊孢子收集情況見圖1。

圖1 菌株子囊孢子生長情況Fig.1 Ascospores growth of strain

由圖1所示，收集菌株YC03、YC04、YC05的子囊孢子各20個，淘汰菌絲長勢差、不轉(zhuǎn)色的子囊孢子，獲得菌絲長勢較快、較濃密、轉(zhuǎn)色較為明顯的子囊孢子，菌株YC03子囊孢子8個，菌株YC04子囊孢子10個，菌株YC05子囊孢子12個。

2.3 蛹蟲草單孢雜交結(jié)果

選取菌株YC04性狀優(yōu)良的單孢分別與菌株YC03和菌株YC05單孢進(jìn)行雜交，其長勢情況見圖2。

圖2 雜交菌株生長情況Fig.2 Growth of hybrid strains

由圖2所示，挑選菌絲長勢較快、較濃密、轉(zhuǎn)色較為明顯的雜交菌株，共獲得40株性狀優(yōu)良的雜交菌株。淘汰菌絲長勢差、不轉(zhuǎn)色的雜交菌株，將優(yōu)良雜交菌株進(jìn)行編號，YC04×YC03的雜交菌株編號為YC4301～YC4316、YC04×YC05的雜交菌株編號為YC4501～YC4524。

2.4 蛹蟲草雜交菌株出菇試驗(yàn)結(jié)果

對40株性狀優(yōu)良的雜交菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 蛹蟲草雜交菌株未出菇的培養(yǎng)基Fig.3 Medium of Cordyceps militaris hybrid strain without fruiting

圖4 雜交菌株出菇情況Fig.4 Fruiting situation of hybrid strains

由圖3、圖4可知，40株優(yōu)良性狀雜交菌株中25株雜交菌株未出菇，其余15株均出菇。其中，菌株 YC4310、YC4311、YC4315、YC4518微弱出菇，生物轉(zhuǎn)化率低于20%，子實(shí)體稀疏且矮??；菌株YC4514、YC4520為畸形菇，子實(shí)體性狀參差不齊、差異較大；菌株YC4307、YC4506、YC4511、YC4523、YC4524長勢較好，生物轉(zhuǎn)化率在20%～100%，子實(shí)體較為緊密、粗壯；菌株YC4308、YC4313、YC4314、YC4521出菇旺盛，生物轉(zhuǎn)化率高于100%，子實(shí)體緊密且細(xì)長。

2.5 蛹蟲草雜交菌株農(nóng)藝性狀分析

15個出菇雜交菌株的生物轉(zhuǎn)化率、蟲草素、腺苷等參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 蛹蟲草雜交菌株的栽培性狀統(tǒng)計表Tab.2 Statistical table of cultivation characters of hybrid strains of Cordyceps militaris

由表2可知，部分雜交菌株在某些性狀上出現(xiàn)超親遺傳，菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物轉(zhuǎn)化率均高于菌株YC05的生物轉(zhuǎn)化率（120.80%），菌株YC4311、YC4315的子實(shí)體蟲草素含量高于菌株YC04的子實(shí)體蟲草素含量（502.38 mg·100-1g-1）。

蛹蟲草的生物轉(zhuǎn)化率是決定產(chǎn)量重要因素之一，結(jié)果不同的雜交菌株之間生物轉(zhuǎn)化率差異較大，生物轉(zhuǎn)化率最高為141.10%（菌株YC4308），生物轉(zhuǎn)化率最低為15.40%（菌株YC4315）。其中有3株雜交菌株的生物轉(zhuǎn)化率分別為141.10%（菌株YC4308）、132.20% （菌株 YC4313）、122.40% （菌株YC4521），均高于親本菌株的生物轉(zhuǎn)化率120.80% （菌株YC05）。

蟲草素是蛹蟲草生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是蛹蟲草的重要活性成分之一，其含量高低是衡量蛹蟲草品質(zhì)的重要指標(biāo)。菌株YC4311、YC4315的子實(shí)體蟲草素的含量高于供試菌株，其中菌株YC4315的蟲草素最高為790.96 mg·100-1g-1，但該雜交菌株的生物轉(zhuǎn)化率最低。

腺苷是蛹蟲草中除蟲草素以外的主要核苷類物質(zhì)之一，具有廣泛的藥理活性作用[10]。子實(shí)體中腺苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)基中的腺苷含量，有13個雜交菌株的子實(shí)體腺苷的含量高于菌株YC03（198.36 mg·100-1g-1），其中菌株YC4514子實(shí)體中腺苷含最高為 461.14 mg·100-1g-1。

3 結(jié)論與討論

蛹蟲草具有多種藥用功效，在醫(yī)療保健領(lǐng)域具有廣闊前景[16]，現(xiàn)在已經(jīng)有多款產(chǎn)品面市，如蛹蟲草酒、蛹蟲草復(fù)合飲品、蛹蟲草壓片糖果等[17-18]。如何選育優(yōu)良的蛹蟲草菌株仍是蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的重點(diǎn)。但蛹蟲草菌株退化現(xiàn)象嚴(yán)重，而遺傳背景和培養(yǎng)條件是造成蛹蟲草菌株退化的重要因素[19-20]，其中遺傳背景是菌株退化的主要因素[10]。食用菌品種雜交育種是通過親本遺傳物質(zhì)的交換和重組等產(chǎn)生不同于親本性狀的變異，以獲得食用菌品種新菌株[21]。目前該方法是食用菌育種中最常用的方法[22]。

研究采集野生蛹蟲草36株，通過子實(shí)體組織分離及出菇試驗(yàn)，已成功馴化23株。雜交試驗(yàn)結(jié)果表明通過蛹蟲草雜交育種可獲得性狀優(yōu)于親本菌株的新菌株。將親本菌株YC03、YC04、YC05的子實(shí)體進(jìn)行孢子分離并制成孢子懸液，通過涂布培養(yǎng)繼而獲得單孢子，單孢雜交及出菇試驗(yàn)最終獲得15株蛹蟲草出菇雜交菌株。其中菌株YC4308、YC4313、YC4521的生物轉(zhuǎn)化率分別為141.10%、132.20%、122.40%，均高于菌株YC05的生物轉(zhuǎn)化率120.80%；菌株YC4311、YC4315的子實(shí)體蟲草素含量分別為 744.66 mg·100-1g-1、790.96 mg·100-1g-1，高于菌株YC04的子實(shí)體蟲草素含量502.38 mg·100-1g-1。通過雜交育種的方式，選育出生物轉(zhuǎn)化率和蟲草素含量高于親本的蛹蟲草菌株，可促進(jìn)蛹蟲草深加工等行業(yè)發(fā)展，提高蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益