張玉萍，王 芳，史興海

（1.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太原 030031）

“科大雜優(yōu)”是廣溫型平菇（Pleurotus ostreatus）菌株，是華北地區(qū)的主栽品種之一。子實體扇形或半球形，幼時深灰色，栽培菌株原基灰黑色；子實體叢生邊緣稍向下卷，后漸灰白色，較平展；菌肉白色，肥厚；菌褶較深且延生，菌柄側(cè)生，污白色[1]。因其較耐高溫，廣受山西菇農(nóng)青睞，然而2019年山西柳林、晉中、靜樂等地在不同栽培時間段、不同栽培設(shè)施內(nèi)出現(xiàn)了病毒感染，使其品種形成了不同程度的畸形菇。為提高該菌株菇體的產(chǎn)量和質(zhì)量，將植物的脫毒技術(shù)應(yīng)用于食用菌生產(chǎn)，可有效抑制病害的發(fā)生。植物脫毒，是將植物莖尖組織進行分離，將分離組織置于特定培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，從而獲得脫離原體病毒、病菌的新生種苗。在脫毒過程中，采取一系列的高溫、低溫刺激、營養(yǎng)貧乏等技術(shù)手段，迫使菌株適應(yīng)惡劣的條件，能夠提高菌株抗性[2]，從而達到提高產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

王鋒尖等[3]采用菌絲尖端脫毒法對白色金針菇（Flammulina velutipes） 菌株脫毒復(fù)壯，經(jīng)3次～5次脫毒復(fù)壯后，菌絲體的生長速度、生長量顯著高于對照組和1次脫毒；栽培試驗表明脫毒菌株與對照菌株相比，發(fā)菌期與生產(chǎn)周期均有所縮短，差異不顯著，但生物轉(zhuǎn)化率提高了9.92%，差異極顯著。陳發(fā)川等[4]從秀珍菇（Pleurotus geesteranus） 污染菌包中分離得到的3個秀珍菇菌株為出發(fā)菌株，采用挑取尖端菌絲進行菌株復(fù)壯，結(jié)果表明可以縮短出菇周期并提高出菇產(chǎn)量。吳小平等[5]對香菇（Lentinus edodes）采用菌絲尖端挑取法對3株帶毒香菇進行脫毒，獲得1株不含ds RNA條帶的無毒菌株和一些含1條11 kb的ds RNA條帶脫毒不徹底菌株。對脫毒不徹底菌株、無毒菌株以及帶毒菌株進行了生物學(xué)特性、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶和多酚氧化酶活性的測定，結(jié)果顯示在pH為8時脫毒菌株的生長速度比帶毒菌株快，這三類菌株的子實體產(chǎn)量無顯著差異，但脫毒菌株子實體肥厚且抗污染能力強。付月月[6]采用化學(xué)藥劑進行常溫菌絲尖端處理、低溫菌絲尖端處理和高溫菌絲尖端處理的方式對牛肝菌（Boletus spp.）中的病毒菌株進行了脫毒處理，其中高溫菌絲尖端脫除處理可有效脫除牛肝菌中的病毒。

通過采用常溫尖端，常溫斷橋和高溫尖端3種方法對該平菇菌株進行脫毒復(fù)壯試驗，以期對生產(chǎn)實踐起到指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

采集山西省靜樂縣豐潤鎮(zhèn)徐家溝栽培平菇子實體。子實體為深灰色，菌蓋花邊且呈上卷狀，菌褶紋理紊亂，菌柄粗，產(chǎn)量及其商品價值均下降。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的平菇病毒主要有3種，即OMSV、OMIVⅠ、OMIVⅡ，病毒顆粒直徑分別為27 nm、34 nm、34 nm，OMSV的基因組為單鏈RNA，OMIVⅠ、OMIVⅡ的基因組為雙鏈RNA，其中OMSV和OMIVⅠ經(jīng)常共同感染寄主?；煊腥N病毒或者單個病毒引起的子實體畸形癥狀較為復(fù)雜，并未有明顯區(qū)別[7]。所采集的供試平菇菌株混有3種病毒或單個病毒。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

子實體分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水1 000 mL，pH為7。脫毒培養(yǎng)基以及活化母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蛋白胨2 g，加水1 000 mL，pH為7。原種培養(yǎng)料：棉籽皮85.9%、麩皮10%、糖1%、磷肥1%、石膏2%、尿素0.1%。出菇袋配方：玉米芯84%、麩皮10%、石膏1%、石灰3%、磷肥2%。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織分離母種

按無菌操作技術(shù)將平菇子實體撕開，在菌蓋與菌柄交界處，用滅菌小鑷子取綠豆大菌肉，接入PDA斜面培養(yǎng)基中（18 mm×180 mm），以原始分離菌株為對照組，22℃～25℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 脫毒復(fù)壯處理

1） 常溫尖端法

挑取組織分離好的母種約2 mm2菌絲塊接入18 mm×180 mm試管斜面中，放入恒溫培養(yǎng)箱22℃～25℃培養(yǎng)，當(dāng)菌絲萌發(fā)至2 cm時，用接種工具切取菌絲尖端2 mm菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面中，此為1次脫毒。如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得菌株分別標(biāo)記為處理C1、處理C2、處理C3、處理C4、處理C5。

2） 常溫斷橋法

斜面PDA培養(yǎng)基凝固后于無菌條件下，用接種耙將培養(yǎng)基斜面最前端較薄處培養(yǎng)基斷開約1 cm，把待接母種轉(zhuǎn)接至試管中間培養(yǎng)基上，22℃～25℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長到斷開處時，則會繼續(xù)伸長，穿越斷開處，長至前端分離小塊培養(yǎng)基上，待菌絲在前端培養(yǎng)基生長1 cm后，用接種工具切取菌絲尖端2 mm菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面后端培養(yǎng)基中，此為1次脫毒，如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得菌株分別記為處理D1、處理D2、處理D3、處理D4、處理D5。

3） 高溫尖端法

挑取組織分離好的母種約2 mm2菌絲塊接入18 mm×180 mm試管斜面中，培養(yǎng)箱溫度調(diào)至32℃～34℃。當(dāng)菌絲萌發(fā)至2 cm時，用接種工具切取菌絲尖端2 mm的菌絲轉(zhuǎn)接至試管斜面中，此為1次脫毒。如此循環(huán)，經(jīng)1次～5次連續(xù)脫毒所得到的菌株分別記為處理G1、處理G2、處理G3、處理G4、處理G5。

各菌株母種長好后放入4℃冰箱冷藏，備用。

1.2.3 母種菌絲生長速度測定

活化對照組和各脫毒菌株，挑取活化后各菌株2 mm2組織塊置于30 mm×200 mm平底試管斜面底部，22℃～25℃避光培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)至試管壁時開始畫線，生長5 d后再畫線，測量菌絲長度，計算菌絲日平均生長速度（cm·d-1）。每個處理5次重復(fù)，每次試驗重復(fù)3次。

1.2.4 原種菌絲生長速度測定

試驗設(shè)計既考慮了試驗梯度又兼顧工作量，將對照組母種和處理C1、處理C3、處理C5、處理D1、處理D3、處理D5、處理G1、處理G3、處理G5菌株母種制作原種，采用1.1.2原種培養(yǎng)基，常規(guī)方法拌料，料水比約為1.0∶1.5，用石灰調(diào)節(jié)pH為7，拌料均勻后裝入500 mL玻璃罐頭瓶原種瓶內(nèi)，要求邊裝料、邊壓緊，并把料面整平壓實，在中央用錐形木棒扎一洞穴，用清水洗凈瓶口，后用一層聚丙烯塑料薄膜包扎。于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌后將原種瓶移至接種室內(nèi)，待溫度降至25℃下即可接種，接種后于22℃～25℃培養(yǎng)，待菌絲生長至瓶肩，開始劃線，直至瓶底再劃線，測量菌絲長度，計算菌絲日平均生長量（cm·d-1）。每組10個重復(fù)，每次試驗重復(fù)3次。

1.2.5 產(chǎn)量測定

將1.2.4原種直接接入22 cm×48 cm聚乙烯栽培袋中，每個處理30個重復(fù)，每次試驗重復(fù)3次。因試驗屬于同一品種不同菌株，采用以時間段產(chǎn)量為測產(chǎn)依據(jù)，開始時間為2020年8月23日，截止時間為2020年10月24日。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0，Excel對測定的各菌株相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種菌絲生長速度比較

2.1.1 各菌株在不同處理方法下母種菌絲生長速度的比較

各不同處理方法的平菇菌株母種菌絲生長速度比較見表1。

表1 各菌株母種菌絲生長速度比較結(jié)果Tab.1 Comparison results of growth rate of each strains

由表1可知，常溫尖端法中處理C1、處理C3和處理C5的菌絲生長速度均高于CK，但處理C1較CK有顯著差異；常溫斷橋法中處理D1、處理D3和處理D5的菌絲生長速度均高于CK，且處理D5與CK有顯著差異；高溫尖端法中除了處理G1略高于CK外，處理G3與CK相等，處理G5低于CK，但差異均不明顯。

2.1.2 不同處理方法對各菌株母種菌絲生長速度綜合比較

不同處理各菌株母種菌絲長速多重比較結(jié)果見表2。

表2 各菌株母種菌絲長速多重比較結(jié)果Tab.2 The results of multiple comparisons of the growth rate of the female strains of the mycelium

由表2可知，高溫尖端脫毒法與對照組之間無明顯差異，常溫尖端法與常溫斷橋法母種菌絲生長速度明顯快于對照組。

2.2 原種菌絲生長速度比較

2.2.1 各菌株在不同處理方法下原種菌絲生長速度的比較

不同處理各菌株原種菌絲生長速度比較見表3。

表3 各菌株原種菌絲生長速度比較結(jié)果Tab.3 Comparison results of primary filament growth rate of various strains

由表3可知，各處理在以棉籽殼為主料的培養(yǎng)基中，除常溫尖端法處理C1菌絲生長速度明顯低于對照組外；其余各處理原種菌絲生長速度均與CK無明顯差異。

2.2.2 不同處理方法對各菌株母種菌絲生長速度綜合比較

不同處理各菌株原種菌絲長速多重比較結(jié)果見表4。

表4 各菌株原種菌絲長速多重比較Tab.4 The results of multiple comparisons of the mycelium growth rate of the original strains

由表4可知，綜合常溫尖端、常溫斷橋和高溫尖端3種處理方式，在原種中的菌絲生長速度明顯低于對照組。

2.3 產(chǎn)量比較

各處理出菇產(chǎn)量統(tǒng)計見表5，不同處理方法第一潮菇產(chǎn)量比較見圖1。

表5 各處理出菇產(chǎn)量Tab.5 Yield of fruiting body rods for each treatment

圖1 各菌株第一潮產(chǎn)量比較Fig.1 Comparison of the first-tide yield of various strains

由表4并結(jié)合圖1可以得出，各處理總產(chǎn)量大小依次為： G1>D1>C1>G3>D5>CK>D3>C3>G5>C5，處理G1總產(chǎn)量最高為15.75 kg，比對照高25%，處理D1次之（14.6 kg），比處理C高15.9%。各處理第一潮菇產(chǎn)量依次為C5>G1>C1>D3>D1=G5>G3>C>C3。由此可知，常溫尖端處理方法脫毒一次效果最好，隨著脫毒處理次數(shù)的增多，產(chǎn)量下降；斷橋尖端脫毒1次效果最好，連續(xù)處理5次產(chǎn)量無明顯變化；高溫尖端處理1次最好，隨著處理次數(shù)的增加，產(chǎn)量下降。

2.4 子實體形狀比較

科大雜優(yōu)原始菌株見圖2，常溫尖端、常溫斷橋和高溫尖端脫毒菌株分別見圖3～圖5。

圖2 平菇品種“科大雜優(yōu)”原始菌株Fig.2 Original strain of Pleurotus ostreatus‘Kedazayou’

圖3 常溫尖端處理后子實體表現(xiàn)Fig.3 Sub-entity after treatment at room temperature

圖4 常溫斷橋處理后子實體表現(xiàn)Fig.4 Sub-entity after normal temperature broken bridge treatment

圖5 高溫尖端處理后子實體表現(xiàn)Fig.5 Sub-entity after high temperature tip treatment

由圖2～圖5可知，畸形菇子實體經(jīng)過組織分離以及常溫尖端、常溫斷橋和高溫尖端脫毒后，重新制種進行栽培，子實體外形有所改觀，花邊，粗柄現(xiàn)象消失，但菌褶紊亂經(jīng)過3種方法脫毒處理，表現(xiàn)不同。經(jīng)過常溫尖端處理，隨著脫毒次數(shù)增多，菌褶有所改善；斷橋尖端處理5次后，菌褶紋理有序；高溫尖端脫毒后，隨著脫毒次數(shù)增加，菌褶紊亂度下降。

3 討論

目前，我國己經(jīng)成為世界上最大的食用菌生產(chǎn)國，人工栽培的食用菌種類最多。菌種在食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起著重要且不可替代的作用，菌種的優(yōu)劣決定栽培的成敗[8-10]。因此，分離培育優(yōu)良菌種對食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展十分重要。在日常生產(chǎn)中，經(jīng)常會出現(xiàn)菌株退化，菌種老化等現(xiàn)象，而簡單、易操作的脫毒、復(fù)壯方法，對于菌株的提純復(fù)壯，預(yù)防菌種的老化具有非常重要的實踐意義[11-12]。

從各菌株母種生長狀況看，常溫尖端、常溫斷橋處理對菌絲有很好的復(fù)壯、純化作用，處理C1生長速度最快，隨著處理次數(shù)的增多，菌絲生長速度下降，對涉及母種轉(zhuǎn)接的生產(chǎn)科研工作具有重要指導(dǎo)意義。常溫斷橋處理，隨著處理次數(shù)增多，母種菌絲生長速度增加，處理D5生長速度最快。

從原種菌絲生長速度來看，各處理菌株相較對照而言，均有所下降，并存在顯著差異，但隨著處理次數(shù)的增加，菌絲生長速度有所回升，但處理次數(shù)何時可以達到或者超過對照組，有待進一步研究。

試驗采用常溫尖端法、常溫斷橋法、高溫尖端法對攜帶病毒（菌） 的平菇畸形菌株脫毒（菌） 處理，從子實體形態(tài)看，采用3種脫毒分離方法，子實體外形均有所改觀，菌柄粗細適中，菌蓋大小勻稱，邊緣整齊，對菇體的商品價值有所提升。常溫尖端，高溫尖端法隨著處理次數(shù)的增多，其子實體菌褶紋理逐漸整齊，常溫斷橋處理方法對子實體形狀起到了很好的修復(fù)作用，而且處理D5表現(xiàn)最好，常溫斷橋處理應(yīng)不少于5次。

4 結(jié)論

衡量一個菌株的優(yōu)劣，產(chǎn)量是必不可少的重要指標(biāo)。從各處理菌株總體產(chǎn)量看，高溫尖端處理對產(chǎn)量的提高效果最為顯著，常溫斷橋處理次之。平菇品種“科大雜優(yōu)”作為廣溫偏高型菌株，能搶季上市非常重要，因此第一潮產(chǎn)量較為關(guān)鍵。從第一潮菇產(chǎn)量，處理C5表現(xiàn)最為突出，第一潮產(chǎn)量達10.70 kg，比對照的第一潮產(chǎn)量提高100%；處理G1第一潮菇產(chǎn)量比對照高出61.7%。這些結(jié)果對工廠化栽培，增加單位時間內(nèi)茬數(shù)并獲得更高產(chǎn)量，大幅度提高廠房利用率，降低生產(chǎn)成本，增加收益有重要意義[13]。

綜合所有因素，對于科大雜優(yōu)帶病毒（菌） 菌株，使用常溫斷橋方法連續(xù)5次處理對菌絲的長速有促進作用，且該方法對菇型的改善和產(chǎn)量的提高均有很大作用，因此常溫斷橋法是提純復(fù)壯科大雜優(yōu)帶病毒（菌）菌株的最佳方法。