胡瑞財(cái)，汪忠華，胡華斌，藍(lán)春寶

（浙江省龍游縣林業(yè)技術(shù)推廣站，浙江 龍游 324400）

靈芝（Ganoderma lucidum） 隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporals） 多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma），被譽(yù)為百草之王，是中國(guó)名貴傳統(tǒng)中藥材，在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的功效[1-2]?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)研究證明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神經(jīng)衰弱、降血糖等功效[3-4]。關(guān)于靈芝的研究目前主要集中在化學(xué)成分、栽培、藥理及臨床應(yīng)用等方面[5]。我國(guó)在20世紀(jì)50年代首次成功栽培靈芝并逐漸實(shí)現(xiàn)了靈芝規(guī)?；a(chǎn)，現(xiàn)已成為靈芝主要的栽培和加工國(guó)[6]。浙江靈芝商品化生產(chǎn)始于20世紀(jì)70年代，已成為全國(guó)靈芝及孢子粉的主產(chǎn)區(qū)，主要集中在龍泉、慶元、蓮都、武義等生態(tài)環(huán)境優(yōu)越的山區(qū)[7]。

目前，我國(guó)靈芝栽培主要以袋料栽培和段木基質(zhì)栽培為主[6-7]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)靈芝產(chǎn)品的需求呈日益增加的趨勢(shì)。隨著靈芝需求量的提高，栽培場(chǎng)地的不斷擴(kuò)大，新型栽培模式也在不斷探索。林下仿野生栽培，將菌絲袋料或段木覆土于遮陽(yáng)較好的樹林下培育出芝，可有效克服栽培場(chǎng)地短缺、連作障礙等問題[8]，并具有產(chǎn)量高、生物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，已在浙江、福建、四川等山區(qū)林地得到推廣和應(yīng)用[9-10]。林下栽培靈芝作為市場(chǎng)獲取靈芝商品原材料的主要方式之一，較其他方式栽培靈芝的優(yōu)勢(shì)在于較少人工干預(yù)和環(huán)境無(wú)污染的條件下自然生長(zhǎng)，且品質(zhì)好[11-12]。

多糖具有豐富的生物活性，是細(xì)胞的重要組成成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝子實(shí)體多糖在增強(qiáng)免疫、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等方面有功效[13]。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，篩選出以熱水浸提法優(yōu)化多糖提取的最佳工藝參數(shù)，為林下仿野生栽培靈芝產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支撐。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

靈芝子實(shí)體為浙江省龍游縣竹林下栽培的靈芝；葡萄糖、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

20B中藥粉碎機(jī)，南京邦斯特制藥設(shè)備有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；PL602-S電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝子實(shí)體多糖的提取

靈芝子實(shí)體原料經(jīng)干燥、粉碎后過篩（60目）。熱水浴90℃提取1次，轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1離心10 min。取上清液濃縮至原體積的1/4后將上清液用95%乙醇醇沉 12 h，5 000 r·min-1離心 10 min。從水溶性糖溶液中分離出的多糖即為粗多糖。

1.3.2 提取條件的單因素試驗(yàn)

分別稱取適量干燥粉碎后的靈芝子實(shí)體5 g。1） 固定溫度為80℃的條件下，分別在料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的條件下提取 1 h，研究液料比對(duì)多糖提取率的影響。2）固定液料比1∶25，提取溫度設(shè)置為 60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取1 h，研究提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。3） 固定料液比為1∶25，提取溫度為80℃，分別 提取 60 min、75 min、90 min、105 min、120 min，研究提取時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)

運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素的水平范圍，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 水平因素表Tab.1 Table of the factors and levels

1.3.4 分析方法

采用苯酚-硫酸比色法[14]進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，多糖得率（Y，%） 計(jì)算公式為：

Y=c×v/m×100

式中：c為稀釋樣的多糖含量（g·mL-1）；v為稀釋體積（mL）；m為樣品干重（g）。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行分析和處理[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同料液比對(duì)靈芝多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖1可知，開始隨著料液比的逐漸升高，多糖提取率持續(xù)上升，于1:30時(shí)達(dá)到峰值；之后隨著料液比繼續(xù)增加，提取率下降。由于料液比過大，使得濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，多糖損失率增大，導(dǎo)致得率降低。因此，最佳料液比應(yīng)為1:30。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響Fig.2 Effects of different extraction time on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖2可知，提取時(shí)間在60 min～90 min，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率呈現(xiàn)相應(yīng)的增長(zhǎng)趨勢(shì)，在提取時(shí)間為90 min時(shí)靈芝多糖的提取率達(dá)到峰值，之后提取率趨于穩(wěn)定并略有下降。因此最佳提取時(shí)間為90 min較為合適。

2.1.3 提取溫度對(duì)靈芝多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取溫度對(duì)靈芝多糖損失率的影響Fig.3 Effects of different extraction temperature on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖3可知，當(dāng)提取溫度在60℃～90℃，隨著提取溫度升高，提取率不斷提高，在90℃時(shí)達(dá)到峰值；之后隨著提取溫度升高，提取率下降。這是由于提取溫度升高導(dǎo)致多糖分子劇烈運(yùn)動(dòng)，加快了多糖的溶出，因此升高提取溫度有利于提高提取率。然而，溫度升高到90℃后，不僅會(huì)加快提取液的損耗，且高溫可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)。因此，最佳提取溫度應(yīng)為80℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

三因素選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C），設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)Tab.2 Experiment of response surface analysis

如表2所示，通過分析獲得多元二次回歸方程，其回歸模型為：

對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

由表3可知，模型的決定系數(shù)R2為0.976 9，說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好；P值均＜0.000 1，說明以多糖提取率為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果達(dá)到極顯著水平；模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.947 2，說明該模型符合試驗(yàn)要求。結(jié)果中模型失擬項(xiàng)P值為0.061 5，大于0.050 0，說明模型的失擬項(xiàng)不顯著。根據(jù)顯著性分析結(jié)果，料液比（A）、提取溫度 （C） 對(duì)響應(yīng)值影響顯著 （P＜0.05），AA、BB、CC以及BC、AB的交互項(xiàng)對(duì)多糖提取率率的影響極顯著（P＜0.01）。各個(gè)因素對(duì)多糖提取率影響大小依次為：提取時(shí)間（B） ＞料液比（A） ＞提取溫度（C）。

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

分析了靈芝多糖提取率的影響因素，分別以一個(gè)因素為0水平，得到另外2個(gè)因素的交互影響效果。響應(yīng)面及其等高線見圖4～圖6。

圖4 提取時(shí)間和料液比交互影響多糖提取率的曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction time and solid-liquid ratio

圖5 提取溫度和料液比交互影響多糖提取率的曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction temperature and solid-liquid ratio

圖6 提取時(shí)間和提取溫度交互影響多糖提取率的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction temperature and extraction time

由圖4～圖6可知，對(duì)靈芝多糖提取率的影響最顯著因素為提取溫度（C），其次是料液比（B），而提取時(shí)間（B）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明其對(duì)響應(yīng)值影響較小。料液比（A） 與提取時(shí)間（B） 相互之間，提取時(shí)間（B） 提與取溫度（C） 相互之間對(duì)多糖提取率有交互作用的影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)所得的結(jié)果以及二次多項(xiàng)回歸方程，確定最佳提取條件為：提取時(shí)間68.3 min，提取溫度84.6℃，料液比34.5，多糖提取率理論值可達(dá)1.94%。隨后進(jìn)行了靈芝子實(shí)體中多糖提取率的驗(yàn)證試驗(yàn)。在料液比、提取時(shí)間、提取溫度分別選取34.5 mL·g-1、68.3 min、84.6℃的條件下進(jìn)行 3次平行試驗(yàn)，測(cè)得多糖提取率達(dá)到1.88%、1.85%、1.90%。實(shí)際多糖提取率平均值為1.88%，達(dá)到了回歸模型預(yù)測(cè)理論值96.91%。說明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)靈芝子實(shí)體多糖提取率。

3 結(jié)論

以林下栽培的靈芝子實(shí)體為試驗(yàn)原料，考察熱水浸提法中提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)靈芝子實(shí)體多糖提取率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法以及Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)對(duì)林下栽培靈芝多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝子實(shí)體中多糖的最佳提取條件為：提取時(shí)間 68.3 min，提取溫度 84.6℃，料液比34.5 mL·g-1，此條件下的多糖提取率可得1.88%，結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)，說明響應(yīng)面分析得到的優(yōu)化條件可靠。采用林下栽培靈芝，對(duì)于耕地少的山區(qū)開展林下栽培具有重要推廣意義。