陳建軍 王振軍 趙寶成 李竹林

黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)作為組成炎癥小體的一種關(guān)鍵蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。編碼AIM2的基因位于1q21，在惡性黑色素瘤中作為一種抑癌基因[1]。有研究指出，在多種實體腫瘤中AIM2的表達存在差異[2-6]。Dihlmann 等[7]通過組織芯片(TMA)技術(shù)分析了414例國外結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織和癌旁組織，結(jié)果顯示腫瘤組織與癌旁組織相比AIM2基因表達降低。但Liu等[8]使用QRT-PCR技術(shù)研究了40例中國病人，他們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌病人的腫瘤組織與癌旁組織中AIM2的表達無明顯差異。我們使用熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)來明確結(jié)直腸癌組織中AIM2的表達水平，分析AIM2的蛋白水平與結(jié)直腸癌病人的臨床病理特征之間是否存在相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

2015年6月～2016年6月間我院經(jīng)手術(shù)治療的原發(fā)性結(jié)直腸癌病人標本，其中包括64例新鮮冰凍組織標本，68例石蠟標本。入組條件：(1)均為原發(fā)性結(jié)直腸癌病人；(2)術(shù)前未接受放、化療及其他新輔助治療；(3)具有完整的臨床病理結(jié)果；(4)標本采集均通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會鑒定同意。分別留取病人腫瘤組織及距腫瘤組織3～5 cm處的癌旁組織標本。

二、方法

1.熒光定量PCR驗證AIM2的表達：新鮮冰凍樣品進行研磨裂解后，提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，采用的內(nèi)參基因為GAPDH，目的基因AIM2的上游引物序列為GCAAGATATTATCGGCACAG，下游引物序列為GAGTTTGAAGCGTGTTGATC，熒光定量PCR的結(jié)果采用相對定量法2-ΔΔCt進行分析。

2.免疫組化：將固定后的組織石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)過抗原修復(fù)、清除內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉后，采用1∶500濃度的Anti-AIM2抗體進行一抗孵育，后滴加酶標抗鼠/兔聚合物，并通過DAB顯色及復(fù)染后完成免疫組織化學(xué)染色。使用免疫反應(yīng)評分(imunoreactivity sore,IRS)來進行半定量分析AIM2蛋白的表達水平。AIM2免疫組化陽性信號定位于細胞漿和/或細胞核著色呈棕黃色。著色細胞數(shù)評分按AIM2陽性細胞百分率計算，陽性細胞1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，81%～100%記為4分。表達強度則以陰性記為0分，弱陽性記為1分，陽性記為2分，強陽性記為3分，著色細胞數(shù)得分乘以著色強度得分為最終得分。隨機選擇5個高倍鏡(×400)視野進行計數(shù)，每個視野計數(shù) 100個細胞。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織AIM2的mRNA水平的相對表達的差異采用配對樣本t檢驗；蛋白水平的差異采用t檢驗；AIM2免疫染色評分水平與其他臨床病理因素的相關(guān)性分析及其他計數(shù)資料用多因素方差分析。P<0.05為差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

熒光定量PCR提示結(jié)直腸癌腫瘤組織中AIM2的mRNA水平降低。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在64例腫瘤組織標本中，AIM2相對表達水平2-ΔΔCt為0.65±0.62，而癌旁組織的2-ΔΔCt為3.19±3.13。結(jié)直腸癌腫瘤組織中AIM2的mRNA表達水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中AIM2表達水平比較(aP<0.05)

68例石蠟標本的免疫組化的結(jié)果顯示，AIM2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達顯著低于癌旁組織。AIM2蛋白主要位于細胞質(zhì)中，陽性染色為棕黃色或褐色(圖2)。綜合考慮免疫反應(yīng)評分及染色陽性率來判定AIM2的表達情況，68例結(jié)直腸癌組織中，免疫反應(yīng)評分為4.53±3.43，染色陽性表達率為75.00%(51/68)；癌旁組織的免疫反應(yīng)評分為7.76±3.38，染色陽性表達率為95.59%(65/68)，免疫反應(yīng)評分及染色陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化結(jié)果提示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中的AIM2蛋白表達水平要低于癌旁組織，這與熒光定量PCR的結(jié)果相符合。

A：AIM2陽性表達(HE，×200)；B：AIM2陰性表達(HE，×200)

研究的臨床指標包括病人的年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處 轉(zhuǎn)移及TNM分期。結(jié)果顯示，AIM2的蛋白水平與結(jié)直腸癌的分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)，即腫瘤分化越差時AIM2蛋白的表達水平越低，而與其他臨床指標未見明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中AIM2的蛋白水平與各臨床病理特征的關(guān)系

討論

結(jié)直腸癌是嚴重危害人類健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2020年美國有147 950例新發(fā)病例，在男性和女性腫瘤中均排在第3位[9]。有數(shù)據(jù)顯示，在中國人群中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率也處于較高水平[10]。由于病人的早期癥狀不明顯，沒有早期診斷的特異性標志物，很多病人確診時已發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌治療后5年生存率為50%～60%。尋找合適的標志物，有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌并明確高風(fēng)險的病人。

AIM2是一種潛在的腫瘤標志物，在多種腫瘤組織中存在表達異常。AIM2蛋白屬于干擾素誘導(dǎo)的PYHIN蛋白家族(或稱為p200蛋白家族)的一員[11],作為固有免疫中的一個重要組成部分，AIM2在多種細胞中存在表達，在多種皮膚疾病的角質(zhì)細胞中可觀察到固有免疫細胞中外源性雙鏈DNA通過AIM2激活炎性小體[12]。除了固有免疫細胞，有研究證實了血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中的AIM2也可感受外源性雙鏈DNA，而在脾臟、小腸、外周血白細胞中也發(fā)現(xiàn)有AIM2的mRNA表達。提示在多種細胞中，AIM2是普遍的危險感應(yīng)器。在腫瘤組織中，AIM2的表達會發(fā)生異常改變，研究指出在前列腺癌組織，膠質(zhì)瘤組織中AIM2的表達減少[13-14]，而在皮膚鱗狀細胞癌和肺腺癌中AIM2的表達會增加[4，15]，提示在不同的腫瘤組織中，AIM2發(fā)揮的作用也存在差異。目前，國內(nèi)外報道中關(guān)于AIM2在結(jié)直腸癌中的表達水平存在矛盾。

本研究通過熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測了64例結(jié)直腸癌病人的新鮮冰凍組織標本和68例石蠟標本及對應(yīng)的癌旁組織標本，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中的AIM2的mRNA水平和蛋白水平均低于相應(yīng)的癌旁組織，此結(jié)果與Dihlmann等[7]結(jié)果相一致。

為了進一步了解AIM2與結(jié)直腸癌病人不同臨床病理特征之間是否存在聯(lián)系，我們對腫瘤組織中AIM2的蛋白水平與病人的臨床病理參數(shù)進行了分析。結(jié)果顯示，AIM2的表達水平與腫瘤的分化程度有關(guān)，腫瘤分化程度越低，AIM2蛋白水平越低。腫瘤分化程度是影響腫瘤病人生存期及預(yù)后的重要因素，因此AIM2蛋白的表達情況可能是結(jié)直腸癌重要的預(yù)后預(yù)測因子，而其相關(guān)機制仍需要進一步研究。