張余霞，譚定淵，史朝暉

(海南碧凱藥業(yè)有限公司，?？?570311)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平提高以及生活方式的改變，胃腸道疾病的發(fā)病率越來(lái)越高。2015年在我國(guó)城市醫(yī)院住院患者前10位疾病構(gòu)成中，消化系統(tǒng)疾病位列第2(占10.14%)，而在縣級(jí)醫(yī)院中比例達(dá)11.10%[1]。消化性潰瘍發(fā)病原因與胃黏膜屏障受損、黏膜防御/修復(fù)機(jī)制失衡等因素有關(guān)。消化性潰瘍?cè)谇治g胃黏膜血管后，會(huì)造成消化道出血或穿孔甚至危及生命[2]。上消化道出血的最常見(jiàn)病因是消化性潰瘍，消化性潰瘍出血占全部上消化道出血病因的47.43%[3]。

右蘭索拉唑?yàn)樘m索拉唑的右旋單一光學(xué)異構(gòu)體，屬于質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)，具有生物活性，為抑制胃酸分泌的新型藥物。其結(jié)構(gòu)為苯并咪唑類衍生物，作用于二硫鍵與質(zhì)子泵(H+-K+-ATP)酶，阻斷H+的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少胃酸分泌。主要用于非糜爛性胃食管反流病(non-erosive reflux disease，NERD)的“燒心”癥狀的控制、各種程度的糜爛性食管炎(erosion esophagitis，EE)和糜爛性食管炎愈合期的維持治療。質(zhì)子泵抑制劑是目前抑制胃酸分泌強(qiáng)效藥物[4]。

2009年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)日本武田制藥公司研發(fā)的右蘭索拉唑緩釋膠囊上市[5](商品名為Dexilant?)。2016年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)武田制藥美國(guó)有限公司的右蘭索拉唑緩釋口服崩解片上市[6](商品名為Dexilant Solutab)。

右蘭索拉唑制劑的質(zhì)量控制相關(guān)方法的報(bào)道較少。曾垂宇等[7]建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定右蘭索拉唑緩釋膠囊的含量測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)。對(duì)含量和有關(guān)物質(zhì)的分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果提示右蘭索拉唑與有關(guān)物質(zhì)分離度良好，且空白輔料不干擾檢測(cè)。郭俊平[8]采用反相高效液相色譜法對(duì)右旋蘭索拉唑控釋膠囊中左旋和右旋異構(gòu)體進(jìn)行拆分并測(cè)定其中左旋異構(gòu)體含量，驗(yàn)證結(jié)果顯示該方法可用于右旋蘭索拉唑控釋膠囊中左旋異構(gòu)體的含量測(cè)定。張莉華等[9]采用正相高效液相色譜法測(cè)定注射用右旋蘭索拉唑中左旋異構(gòu)體的含量，結(jié)果提示其方法學(xué)驗(yàn)證可行。

本研究在注射用右蘭索拉唑處方工藝的基礎(chǔ)上，參考《歐洲藥典》蘭索拉唑有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法[10]，建立了注射用右蘭索拉唑的高效液相色譜法。

1 材料

1.1 藥品與試劑

注射用右蘭索拉唑(海南碧凱藥業(yè)有限公司，批號(hào)20160601，規(guī)格15 mg，純度99.8%)；右蘭索拉唑?qū)φ掌?加拿大TRC公司，批號(hào)2-DXX-95-1，規(guī)格100 mg，純度99.6%)；雜質(zhì)A～E對(duì)照品(LGC英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：30193、33121、11914、37957、35254，規(guī)格100 mg，純度98.7%、98.4%、95.8%、99.9%、99.9%)；三乙胺(羅恩試劑，色譜純，規(guī)格500 ml，純度99.0%)；乙腈(ThermoFisher公式，色譜純，規(guī)格4 L，純度99.9%)；磷酸(廣州化學(xué)試劑廠，色譜純，規(guī)格500 ml，純度85.0%)。

1.2 儀器

LC-20AT液相色譜儀(日本島津儀器設(shè)備有限公司，PDA檢測(cè)器)；XS205DU電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：三乙胺-水(用磷酸調(diào)節(jié)至pH 6.2)-乙腈(1∶60∶40)；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；流速：1.2 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取注射用右蘭索拉唑適量，精密稱定，用稀釋劑[三乙胺-水(用磷酸調(diào)節(jié)至pH 10.5)-乙腈(1∶60∶40)]溶解并稀釋制成每1 ml中含右蘭索拉唑1 mg的溶液，作為供試品溶液。

自身對(duì)照品溶液：精密量取供試品溶液適量，用稀釋劑定量稀釋制成每1 ml中含右蘭索拉唑2 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取右蘭索拉唑、雜質(zhì)B對(duì)照品適量，精密稱定，加稀釋劑超聲溶解并稀釋制成每1 ml中含右蘭索拉唑1 mg及雜質(zhì)B 40 μg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成份峰保留時(shí)間的3倍。右蘭索拉唑峰與雜質(zhì)B峰之間的分離度應(yīng)>3.0。見(jiàn)圖1。

1：右蘭索拉唑；2：雜質(zhì)B圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1空白輔料干擾試驗(yàn)

精密稱取空白輔料適量，置于10 ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl注入液相色譜儀?？瞻纵o料溶液在保留時(shí)間3 min后無(wú)色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。見(jiàn)圖2。

圖2 空白輔料色譜圖

2.4.2供試品溶液

取注射用右蘭索拉唑適量，精密稱定，用稀釋劑溶解并稀釋制成每1 ml中含右蘭索拉唑1 mg的溶液，作為供試品溶液。在“2.1”的色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。見(jiàn)圖3。

圖3 注射用右蘭索拉唑供試品圖譜

2.4.3已知雜質(zhì)對(duì)照品混合溶液

精密稱取右蘭索拉唑、起始物料(氯化物，見(jiàn)圖4“6”注釋)、雜質(zhì)A～E對(duì)照品適量，分別加少量稀釋劑超聲溶解并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液；精密移取各儲(chǔ)備液1 ml置同一10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液，取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各雜質(zhì)峰、起始物料峰、右蘭索拉唑峰之間的分離度均>1.5，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求。見(jiàn)圖4。

1：雜質(zhì)D；2：雜質(zhì)E；3：雜質(zhì)A；4：右蘭索拉唑；5：雜質(zhì)B；6：氯化物[2-氯甲基-3-甲基-4-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-吡啶鹽酸鹽]；7：雜質(zhì)C圖4 混合對(duì)照品溶液色譜圖

2.5 檢測(cè)限和定量限

分別取右蘭索拉唑與雜質(zhì)A～E對(duì)照品適量，精密稱定，用稀釋劑超聲溶解并用稀釋劑稀釋制成一定濃度的溶液作為儲(chǔ)備液。采用逐步稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，以信噪比不小于10為定量限，信噪比不小于3為檢測(cè)限。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 線性和范圍

精密稱取雜質(zhì)A～E、右蘭索拉唑?qū)φ掌犯骷s10 mg，分別置于50 ml量瓶中，精密稱取雜質(zhì)B約10 mg，置于20 ml量瓶中，加稀釋劑適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別作為雜質(zhì)A～E、右蘭索拉唑?qū)φ掌返膬?chǔ)備液；分別精密量取雜質(zhì)A、C、D、E、右蘭索拉唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液1 ml，雜質(zhì)B對(duì)照品儲(chǔ)備液2 ml，置同一10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用稀釋劑稀釋成溶液雜質(zhì)A～E 20、40、20、20和20 μg/ml，分別精密量取上述溶液各 10 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)量峰面積。以峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度x為橫坐標(biāo)，做線性回歸曲線(線性回歸時(shí)以定量限結(jié)果為線性起始點(diǎn))。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2～3。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 n=6

表3 雜質(zhì)的校正因子

校正因子=Slope主藥/Slope雜質(zhì)

結(jié)果可知，雜質(zhì)B～D的校正因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，可以用主成份自身對(duì)照法計(jì)算含量；雜質(zhì)A和E的校正因子分別為0.60和0.34，可用加校正因子的主成份自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)A和E的含量。

采用主成份自身稀釋對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量，計(jì)算公式：

總雜質(zhì)計(jì)算公式：總雜質(zhì)(%)=雜質(zhì)A(%)+雜質(zhì)B(%)+雜質(zhì)C(%)+雜質(zhì)D(%)+雜質(zhì)E(%)+其他雜質(zhì)(%)

其中，AX：供試品中雜質(zhì)的峰面積；AR：對(duì)照品溶液中主峰的峰面積。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱定雜質(zhì)A～E對(duì)照品各適量，用稀釋劑分別溶解并稀釋，制成雜質(zhì)A、C、D、E濃度為200 μg/ml的溶液，雜質(zhì)B為400 μg/ml的溶液，搖勻，作為各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8、1和1.2 ml，置于10 ml量瓶中，同時(shí)精密量取供試品適量(相當(dāng)于右蘭索拉唑10 mg)，分別置于上述10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，作為80%、100%和120%回收率樣品溶液；每個(gè)濃度平行制備3份。精密量取雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

分別取上述雜質(zhì)對(duì)照品溶液、供試品溶液及回收率樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)回收率。回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4～8。

表4 雜質(zhì)A回收率測(cè)定結(jié)果 n=9

表5 雜質(zhì)B回收率測(cè)定結(jié)果 n=9

表6 雜質(zhì)C回收率測(cè)定結(jié)果 n=9

表8 雜質(zhì)E回收率測(cè)定結(jié)果 n=9

結(jié)果顯示，各雜質(zhì)的回收率均符合要求，準(zhǔn)確度良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

2.8.1重復(fù)性

取注射用右蘭索拉唑10瓶，取出內(nèi)容物，混勻，精密稱定粉末(相當(dāng)于右蘭索拉唑10 mg)，加適量稀釋劑溶解，并稀釋制成每1 ml含右蘭索拉唑約 1 mg 的溶液，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取適量，用稀釋劑稀釋成每1 ml中含右蘭索拉唑 2 μg 的溶液作為對(duì)照品溶液，平行配制6份。取上述方法制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算雜質(zhì)含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果 %

ND:未檢出。下表同。

結(jié)果顯示，本方法的重復(fù)性良好。

2.8.2中間精密度

由不同分析人員在不同日期、不同儀器上測(cè)定同一批注射用右蘭索拉唑樣品雜質(zhì)的含量，考察中間精密度。見(jiàn)表10。

表10 中間精密度測(cè)定結(jié)果 %

中間精密度：儀器二、分析人員B

結(jié)果顯示，12個(gè)樣品的雜質(zhì)A均未檢出；雜質(zhì)B的平均值為0.28%，RSD為2.3%；雜質(zhì)C的平均值為0.04%，RSD為3.0%；雜質(zhì)D的平均值為0.06%，RSD為2.5%；雜質(zhì)E的平均值為0.01%，RSD為3.0%；總雜質(zhì)的平均值為0.39%，RSD為2.3%。表明本方法中間精密度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性第1份樣品，作為供試品溶液；精密量取適量，用稀釋劑稀釋制成每1 ml中含右蘭索拉唑2 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。在室溫條件下放置0、2、4、6和8 h，分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，計(jì)算雜質(zhì)含量。見(jiàn)表11。

結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下放置8 h，穩(wěn)定性良好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取注射用右蘭索拉唑10瓶，取出內(nèi)容物，混勻，精密稱定粉末(相當(dāng)于右蘭索拉唑10 mg)，加適量稀釋液，超聲溶解后，用稀釋溶液稀釋成每1 ml含右蘭索拉唑約1 mg的溶液，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取適量供試品溶液，用稀釋溶液稀釋成每1 ml中含右蘭索拉唑2 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。分別考察乙腈比例變化±2%，流速變化±0.1 ml/min，流動(dòng)相pH±0.2，柱溫變化±5 ℃及不同品牌色譜柱條件下，雜質(zhì)B與主峰的分離度。見(jiàn)表12。

表12 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，各條件下主成份峰與雜質(zhì)B峰分離度均>3.0。表明該方法的耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取3批注射用右蘭索拉唑(批號(hào)20160601、20160602、20160701)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。見(jiàn)表13。

表13 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 %

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，有關(guān)物質(zhì)的檢查方法可行。

3 討論

本研究建立了HPLC法測(cè)定注射用右蘭索拉唑有關(guān)物質(zhì)的方法，確定色譜條件并進(jìn)行了方法學(xué)考察。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，表明方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適用于注射用右蘭索拉唑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

有關(guān)物質(zhì)分析方法考慮的雜質(zhì)間及與主峰間分離度需達(dá)到有關(guān)要求，通過(guò)系統(tǒng)的方法開(kāi)發(fā)，考慮到雜質(zhì)B與右蘭索拉唑主峰的相對(duì)保留時(shí)間較為接近，故系統(tǒng)適用性溶液以右旋蘭索拉唑與雜質(zhì)B的分離度應(yīng)>3.0作為系統(tǒng)通過(guò)的判定條件。

取適量注射用右蘭索拉唑用稀釋液溶解并稀釋成含右蘭索拉唑10 μg/ml的溶液，在紫外200～400 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，其在210及285 nm附近均有最大吸收，但在285 nm波長(zhǎng)處時(shí)，供試品檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)及量均高于210 nm，且制劑中其他輔料峰位于低紫外210 nm波長(zhǎng)處干擾明顯高于285 nm波長(zhǎng)，所以最終285 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)的控制檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相參考《中國(guó)藥典》[11]蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)，選擇水及乙腈作為主要溶劑，通過(guò)加入三乙胺及磷酸調(diào)節(jié)pH來(lái)控制供試品中各物質(zhì)存在的離子形式，避免峰型拖尾，確保積分準(zhǔn)確。