周龍艷 李秀明 付世建

(重慶師范大學(xué)進(jìn)化生理與行為學(xué)實驗室,重慶市動物生物學(xué)重點(diǎn)實驗室, 重慶 401331)

近幾十年來, 氣候變化和人為活動對水體環(huán)境產(chǎn)生了劇烈影響, 進(jìn)而導(dǎo)致漁業(yè)資源的顯著降低[1—3]。增殖放流是重要的魚類保護(hù)措施之一, 在恢復(fù)或維持魚類自然種群規(guī)模方面產(chǎn)生了良好的效果[1,4—7]。不過, 人工養(yǎng)殖的增殖放流個體通常比野生同類個體在自然水生生境中表現(xiàn)出更高的死亡率, 這可能是由于其較弱的運(yùn)動能力和反捕食技巧的缺乏等原因[1,5,8]。一些近期的研究發(fā)現(xiàn), 通過對人工養(yǎng)殖的個體在增殖放流前進(jìn)行生態(tài)鍛煉能夠在一定程度上提高其運(yùn)動能力和反捕食能力[1,9—12]。比如有大量的研究發(fā)現(xiàn), 放流前的鍛煉能夠提高魚類逃避捕食者的能力, 進(jìn)而提高其生存的可能性[1,5,11,13]。這可能與生態(tài)鍛煉的魚類個體提高了游泳能力、增加了隱蔽場所利用等行為的改變、提高了警戒水平及縮短了避敵反應(yīng)時滯等相關(guān)[1,10—17]。

捕食馴化(鍛煉)通常是將魚類個體在增殖放流前直接或間接地與捕食者共同放置在同一水體中一段時間[1]。增殖放流效果可能與捕食馴化制度(如捕食者種類和密度選擇、馴化歷時、馴化設(shè)備等)密切相關(guān)。不合適的捕食馴化制度可能導(dǎo)致魚類免疫能力下降、生長緩慢和存活能力的降低, 這可能與魚類在捕食者存在條件下降低攝食量、增加皮質(zhì)醇水平和提高心率等相關(guān)[1,19—21]。不過, 適當(dāng)?shù)牟妒绸Z化制度將有利于魚類增殖放流效果的改善[1,17—18]。魚類如何在捕食者存在條件下調(diào)節(jié)其行為特征和生理狀態(tài)是其在進(jìn)化過程中適應(yīng)生存環(huán)境捕食壓力的結(jié)果, 與其被捕食經(jīng)歷、個性特征、逃避敵害能力和能量儲備高低等生理狀況密切相關(guān), 同時還取決于魚類生存環(huán)境中被捕食風(fēng)險高低及可預(yù)測性等因素[1,10,22—26]。此外魚類的應(yīng)激反應(yīng)水平、抗氧化和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力及其與行為和生理的關(guān)聯(lián)對魚類面對捕食脅迫時的表現(xiàn)也十分關(guān)鍵[1,27—30]。在維持機(jī)體基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面皮質(zhì)醇起著重要的作用[1,31]。首先, 當(dāng)魚類在捕食者脅迫時其皮質(zhì)醇水平會顯著上調(diào), 這將有利于動員能量[1,26,32]; 其次, 由于應(yīng)激條件下皮質(zhì)醇水平的增加和各種病原體的侵入, 特異性的免疫球蛋白M(IgM)和非特異的溶菌酶含量也可能隨之增加, 進(jìn)而提高其免疫功能; 另外, 在應(yīng)激條件下器官抗氧化物質(zhì)儲存的減少和活性氧自由基增加, 可能導(dǎo)致魚類組織超氧化物歧化酶(SOD)含量的增加, 使機(jī)體免受自由基影響而發(fā)生各種病變[1,33,34]。

本研究為了考察捕食馴化對不同魚類生理特征、行為表現(xiàn)和免疫功能的影響并探討其內(nèi)在聯(lián)系, 選取胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)和中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)作為研究對象。這2種魚類都曾經(jīng)是長江上游重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 但是目前自然種群數(shù)量稀少, 都是增殖放流的重要魚種[1,4]。本研究測定了捕食馴化和急性捕食者暴露條件下兩種魚類的游泳能力、IgM、溶菌酶、SOD、血漿皮質(zhì)醇、魚群自發(fā)游泳行為等指標(biāo), 探討其行為和生理機(jī)制及其內(nèi)在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果不僅能夠豐富魚類生理生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的理論, 同時還能夠為水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐和漁業(yè)資源保護(hù)提供重要的參考資料, 具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 實驗魚的馴養(yǎng)與捕食馴化處理

本研究從重慶市永川區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖場購得胭脂魚和中華倒刺鲃幼魚, 每種實驗幼魚各270尾。實驗幼魚馴養(yǎng)于重慶師范大學(xué)進(jìn)化生理與行為學(xué)實驗室自凈化循環(huán)控溫水槽中, 歷時2周, 馴養(yǎng)期間每天用商品飼料飽足投喂2次(09:30和17:00), 實驗幼魚攝食后1h清除糞便和殘餌。實驗用水是經(jīng)過充分曝氣后的自來水, 水體溫度控制在(25±1)℃, 控制水體溶氧水平在90%飽和溶氧以上[1,35]。

在2周的馴養(yǎng)期結(jié)束后, 將每種實驗幼魚隨機(jī)分為對照組和捕食馴化組, 每組各135尾, 測量其初始體重和體長[(胭脂魚: (4.78±0.11) g, (6.33±0.05) cm;中華倒刺鲃: (7.62±0.06) g, (7.24±0.02) cm]。為了消除養(yǎng)殖單元的差異對實驗處理可能產(chǎn)生的影響,將每組實驗幼魚分別放在3個養(yǎng)殖單元中進(jìn)行處理。用2尾烏鱧(體重: 200—300 g, 體長: 25—29 cm)作為捕食者放置在3個捕食馴化組單元外的養(yǎng)殖水體里, 對照組養(yǎng)殖水體中沒有放置捕食者烏鱧[1,36]。

在1周捕食者馴化結(jié)束后測定實驗幼魚體重、體長和相關(guān)生理、行為和免疫等指標(biāo), 取樣和測定的具體方法見后。其中血漿皮質(zhì)醇水平和集群行為特征的取樣和測定分別在有捕食者急性暴露和沒有捕食者急性暴露2種條件下進(jìn)行[1]。急性捕食者暴露測定時, 實驗幼魚測定裝置水體與放置捕食者的水體通過透明隔板的小孔交換, 捕食者無法直接接觸到實驗幼魚[1,37]。在集群行為測定結(jié)束后,取有急性捕食者暴露和無急性捕食者暴露實驗幼魚各6尾用于血漿皮質(zhì)醇水平測定。所有實驗幼魚在取樣前都禁食24h, 以便消除消化活動對指標(biāo)測定的影響[1]。

1.2 最大均加速游泳速度(Maximum acceleration swimming speed, Ucat)的測定

Ucat的測定設(shè)備采用Blazka式魚類游泳測定儀。設(shè)備結(jié)構(gòu)見文獻(xiàn)[34]。將每組9尾實驗幼魚放置到測定儀器中馴化適應(yīng)1h, 適應(yīng)過程中儀器流速為6 cm/s。馴化結(jié)束后測定實驗幼魚Ucat, 測定方法詳見文獻(xiàn)[1, 35]。

1.3 免疫球蛋白(IgM)的測定

采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定實驗幼魚IgM水平。測定原理為“酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)”。兩種實驗幼魚的測定樣本都為6尾(每個養(yǎng)殖單元隨機(jī)選取2尾), 測定方法詳見文獻(xiàn)[1]。

1.4 溶菌酶的測定

采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定實驗幼魚溶菌酶含量。2種實驗幼魚的測定樣本都為6尾(每個養(yǎng)殖單元隨機(jī)選取2尾), 測定方法詳見文獻(xiàn)[1]。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定實驗幼魚SOD活性。2種實驗幼魚的測定樣本都為6尾(每個養(yǎng)殖單元隨機(jī)選取2尾), 測定方法詳見文獻(xiàn)[1]。

1.6 皮質(zhì)醇的測定

采用Cayman試劑盒(Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA)測定實驗幼魚皮質(zhì)醇水平,測定原理為“酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)”。2種實驗幼魚的測定樣本都為6尾(每個養(yǎng)殖單元隨機(jī)選取2尾), 測定方法詳見文獻(xiàn)[1]。

1.7 集群行為的測定

采用自主設(shè)計的由機(jī)玻璃板組成的長方形水槽(長×寬×高: 0.700 m×0.375 m×0.350 m)測定實驗幼魚集群行為。隨機(jī)選取每種實驗幼魚各20尾(分為5組, 每組4尾)測定魚群的自發(fā)游泳行為。具體測定方法和參數(shù)計算方法詳見文獻(xiàn)[1, 38—39]。

1.8 統(tǒng)計分析

本研究實驗數(shù)據(jù)都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE),P＜0.05為顯著水平。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 2.0軟件進(jìn)行。采用t檢驗分析比較實驗幼魚體長和體重的差異。采用雙因素協(xié)方差分析種類(胭脂魚vs.中華倒刺鲃)和實驗處理(對照組vs.捕食馴化組)對游泳能力、免疫和抗氧化等指標(biāo)的影響, 采用體長作為Ucat分析的協(xié)變量, 采用體重作為其余指標(biāo)分析的協(xié)變量。采用三因素(協(xié))方差分析種類(胭脂魚vs.中華倒刺鲃)、實驗處理(對照組vs.捕食馴化組)和急性捕食者暴露(急性暴露vs. 非暴露)對皮質(zhì)醇水平和集群行為指標(biāo)的影響, 如方差分析差異顯著, 采用t檢驗對種類間、對照組和捕食馴化組及急性暴露和非暴露之間的差異進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 捕食馴化對兩種魚類魚體大小的影響

胭脂魚對照組體重顯著低于捕食馴化組(P=0.032), 對照組的體長與捕食馴化組差異不顯著(表 1)。中華倒刺鲃對照組和捕食馴化組之間的體重和體長差異都不顯著(表 1)。

表1 捕食馴化對胭脂魚和中華倒刺鲃魚體大小的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=135)Tab. 1 The body length and body mass of two fish species in the present study (Mean±SE, n=135)

2.2 捕食馴化對兩種魚類游泳速度、血漿免疫指標(biāo)和抗氧化酶活性的影響

胭脂魚的Ucat顯著低于中華倒刺鲃(P＜0.001),捕食馴化對胭脂魚和中華倒刺鲃的Ucat都沒有顯著的影響(表 2, 圖 1A)。捕食馴化和種類對實驗幼魚的血漿IgM水平都有顯著性影響(P＜0.001): 胭脂魚血漿IgM水平顯著低于中華倒刺鲃; 胭脂魚和中華倒刺鲃的血漿IgM水平在捕食馴化后顯著提高, 相比于中華倒刺鲃, 胭脂魚上升幅度較低(交互作用:P=0.003; 圖 1B)。

表2 種類和捕食馴化對實驗參數(shù)的雙因素協(xié)方差統(tǒng)計分析表Tab. 2 The effect of species and predation acclimation on the measured variables based on a two-way analysis of covariance (ANCOVA)

捕食馴化導(dǎo)致2種實驗幼魚的血漿溶菌酶含量都顯著提高(P＜0.001), 但是血漿溶菌酶含量在種間沒有顯著性的差異(圖 1C)。血漿超氧化物歧化酶活性在種間沒有顯著性差異, 也沒有受到捕食馴化的顯著影響(圖 1D)。

圖1 捕食馴化對胭脂魚和中華倒刺鲃游泳速度、血漿免疫和抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 游泳速度: n=9; 其他; n=6)Fig. 1 Effect of predation acclimation on variables of Chinese sucker and Qingbo (Mean±SE, n=9 for swimming speed and n=6 for other variables)

2.3 捕食馴化和急性捕食者暴露對兩種魚類血漿皮質(zhì)醇和集群行為指標(biāo)的影響

胭脂魚血漿皮質(zhì)醇水平顯著低于中華倒刺鲃(P＜0.001; 表 3, 圖 2A); 捕食馴化和急性捕食者暴露均導(dǎo)致兩種實驗幼魚血漿皮質(zhì)醇水平的提高, 相對于胭脂魚, 急性暴露對中華倒刺鲃的影響更加顯著(交互作用:P=0.001)。

表3 種類、捕食馴化和急性捕食者暴露對血漿皮質(zhì)醇水平和自發(fā)游泳行為參數(shù)的三因素協(xié)方差分析表Tab. 3 The effect of species, predation acclimation and predator exposure on plasma cortisol level and variables of spontaneous shoaling behavior based on a three-way ANCOVA in the present study

胭脂魚的運(yùn)動時間比(P＜0.001)和游泳速度中值(P=0.023)均顯著低于中華倒刺鲃, 但2種實驗幼魚的運(yùn)動時間比和游泳速度中值都沒有受到捕食馴化和急性捕食者暴露的顯著影響(圖 2B和2C)。胭脂魚個體間距離顯著短于中華倒刺鲃(P＜0.001);在胭脂魚和中華倒刺鲃各自對照組中, 急性捕食者暴露個體間距離顯著短于非急性捕食者暴露, 在胭脂魚和中華倒刺鲃各自捕食馴化組中, 急性捕食者暴露對個體間距離沒有顯著影響(交互作用:P=0.038；圖 2D)。

圖2 捕食馴化和急性捕食者暴露對胭脂魚和中華倒刺鲃運(yùn)動能力和自發(fā)游泳行為的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 血漿皮質(zhì)醇: n=6或自發(fā)行為: n=5)Fig. 2 Effect of predation acclimation and acute predator exposure on variables of Chinese sucker and Qingbo(Mean±SE, n=6 for plasma cortisol level and n=5 for other variables)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn), 長江流域兩種魚類(胭脂魚和中華倒刺鲃)的行為特征和生理功能基礎(chǔ)水平具有明顯的種間差異, 對捕食馴化和急性捕食者暴露都具有大體相似的響應(yīng)趨勢。不過, 二者在反應(yīng)的幅度上存在明顯的種間差異?？傮w而言, 捕食者脅迫導(dǎo)致2種魚類通過應(yīng)激反應(yīng)增加血漿皮質(zhì)醇水平, 進(jìn)而促進(jìn)魚體特異性免疫和非特異性免疫功能的提高, 相比于胭脂魚, 中華倒刺鲃表現(xiàn)得更加顯著。

3.1 兩種魚類對捕食馴化的行為和生理響應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn), 中華倒刺鲃的Ucat、集群自發(fā)運(yùn)動的PTM、自發(fā)游泳速度和個體間的距離比起胭脂魚分別高出80%、50%、20%和30%。由此表明,中華倒刺鲃比胭脂魚具有更高的游泳能力和更為活躍的習(xí)性, 這種結(jié)果與以往的研究一致[1,40—41];此外, 中華倒刺鲃的血漿皮質(zhì)醇和IgM水平都比胭脂魚更高, 這可能是因為維持較高的生理功能狀態(tài)更有利于其在激流生境中生存[1,41—42]。

有研究發(fā)現(xiàn), 具有被捕食經(jīng)歷的魚類個體可能對隱蔽場所的利用率更高, 其自發(fā)游泳行為顯著性降低[43]; 也有研究發(fā)現(xiàn), 相比于對照組, 經(jīng)過捕食馴化的魚類個體的自發(fā)活動和偵查行為更為活躍[36]。本研究發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過捕食馴化的中華倒刺鲃的游泳速度、PTM和ⅡD與對照組都沒有顯著性差異。這種結(jié)果在鳊(Parabramis pekinensis)的相關(guān)研究中也被發(fā)現(xiàn)[17]。這些結(jié)果暗示不同魚類對捕食者脅迫的行為響應(yīng)模式可能不盡相同[1]。值得注意的是,捕食馴化組胭脂魚的游泳速度中值和PTM都小于其對照組, 并且捕食馴化組的ⅡD比起對照組也顯著縮短。這些結(jié)果表明, 經(jīng)過捕食馴化的胭脂魚可能降低了其自發(fā)活動, 并增加了其群體的凝聚力[1]。這可能是由于胭脂魚群體內(nèi)個體間個性差異導(dǎo)致不同個體在捕食馴化后采取截然不同的應(yīng)對策略(比如降低活躍程度或者增加偵查行為), 因而相互抵消對自發(fā)游泳的影響[1,16,25]。

Ucat是魚類無氧運(yùn)動能力的重要評價指標(biāo)之一, 與其避敵和穿越激流等活動有關(guān)[29,35]。因此,捕食馴化能夠顯著提高魚類的Ucat。不過, 本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過捕食馴化后的胭脂魚和中華倒刺鲃幼魚的Ucat并沒有顯著增強(qiáng)。這可能是由于魚類的游泳能力受到眾多因素的影響, 因此2種魚類的Ucat很難在短期內(nèi)(本研究的捕食馴化歷時僅為1周)得到改善。此外, 我們以往的研究發(fā)現(xiàn), 魚類可能并不僅僅通過游泳能力的改善來提高反捕食能力, 縮短逃避敵害反應(yīng)速度也可能是提高其反捕食能力的方式之一, 即通過增加糖皮質(zhì)激素分泌水平, 使機(jī)體隨時處于警戒狀態(tài)[1,10,26]。

本研究發(fā)現(xiàn), 捕食馴化導(dǎo)致胭脂魚和中華倒刺鲃的血漿皮質(zhì)醇水平含量上升, 這種結(jié)果與大多數(shù)研究報道相似[1,25，26]。這可能是由于機(jī)體處于捕食脅迫的應(yīng)激狀態(tài)下, 通過“下丘腦-垂體-腎上腺”功能軸的調(diào)控, 增加了機(jī)體皮質(zhì)醇分泌水平, 進(jìn)而活化免疫反應(yīng)通路和動員能量以維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[27—28]。本研究發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過捕食訓(xùn)練后的胭脂魚和中華倒刺鲃特異性免疫指標(biāo)(IgM)和非特異免疫指標(biāo)(溶菌酶)含量都有所增加。這可能有利于魚體面對捕食脅迫導(dǎo)致的病原體侵入時, 可以更快的得以康復(fù)[1,44—47]。有趣的是, 捕食馴化導(dǎo)致胭脂魚的血漿皮質(zhì)醇水平和IgM含量的上升程度都沒有中華倒刺鲃顯著。

通常認(rèn)為, 由于機(jī)體內(nèi)抗氧化因子的快速消耗,在應(yīng)激脅迫狀態(tài)下機(jī)體SOD的表達(dá)和活性也會隨之增加[32,48]。不過, 本研究發(fā)現(xiàn)胭脂魚和中華倒刺鲃SOD活性在捕食馴化后與對照組無顯著性差異(盡管在數(shù)值上有所提高)。此外, 盡管捕食馴化后胭脂魚和中華倒刺鲃表現(xiàn)出明顯的免疫指標(biāo)變化和應(yīng)激反應(yīng), 但相比于對照組, 捕食馴化組魚體大小并未顯著降低(甚至捕食馴化組胭脂魚的體重還顯著大于其對照組)。由此表明, 短期捕食馴化并未對2種魚類的生理機(jī)能產(chǎn)生負(fù)面影響, 這種馴化方式可以作為兩種魚類在增殖放流之前適合的生態(tài)鍛煉手段[1]。

3.2 急性暴露對兩種魚類生理和行為響應(yīng)的影響

本研究發(fā)現(xiàn), 不管是對照組還是捕食馴化組,急性捕食者暴露都會促使其血漿皮質(zhì)醇水平的增加, 相比于胭脂魚, 中華倒刺鲃血漿皮質(zhì)醇水平上升得更為加顯著。以往的研究發(fā)現(xiàn), 捕食經(jīng)歷通常會降低魚類的應(yīng)激反應(yīng)[26]。與以往的研究結(jié)果不同的是, 本研究發(fā)現(xiàn)對照組和捕食馴化組對急性捕食者暴露的應(yīng)激反應(yīng)并沒有明顯的差異。值得注意的是, 對照組胭脂魚和中華倒刺鲃的ⅡD在急性捕食者暴露的條件下都顯著縮短, 而捕食馴化組的2種魚類的ⅡD卻沒有受到急性捕食者暴露的顯著影響。此外, 對照組的2種魚類的PTM和游泳速度中值在捕食者暴露條件下都呈現(xiàn)下降趨勢(盡管差異不顯著)。這些結(jié)果表明, 魚類對捕食者存在的行為反應(yīng)模式可能受到短期捕食馴化的顯著影響[1]。這可能顯著影響著增殖放流魚類個體在自然生境中的存活率, 相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

綜上所述, 本研究考察了捕食馴化對長江流域兩種重要增殖放流魚類(胭脂魚和中華倒刺鲃)的行為和生理影響。本研究發(fā)現(xiàn), 中華倒刺鲃具有更強(qiáng)的游泳能力和特異性免疫水平, 比胭脂魚更加活躍;2種魚類的血漿皮質(zhì)醇、特異和非特異免疫水平在短期捕食馴化后都上升, 并且中華倒刺鲃比胭脂魚表現(xiàn)的更加顯著; 2種魚類的抗氧化應(yīng)激水平、游泳能力和群體自發(fā)游泳行為在短期捕食馴化前后都無顯著差異, 這可能與個體針對捕食脅迫采用的不同行為調(diào)節(jié)策略相關(guān)。本研究結(jié)果表明, 短期捕食馴化可以作為胭脂魚和中華倒刺鲃幼魚增殖放流前適合的生態(tài)鍛煉手段。