高忠奎，蔣 菁，韓柱強(qiáng)，黃志鵬，熊發(fā)前，唐秀梅，吳海寧，鐘瑞春，劉 菁，唐榮華，賀梁瓊

（1廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基地管理處，南寧 530007；2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，南寧 530007）

0 引言

隨著測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，越來越多作物物種完成了基因組測(cè)序，單個(gè)基因功能研究以及多個(gè)基因協(xié)同調(diào)控作用研究成為新的研究熱點(diǎn)，作物育種學(xué)已經(jīng)進(jìn)入基因組輔助育種階段?；贑RISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)是近年分子生物學(xué)界的熱點(diǎn)，利用此技術(shù)進(jìn)行遺傳改良是當(dāng)前作物遺傳育種研究的最前沿，了解相關(guān)研究動(dòng)態(tài)和進(jìn)展，對(duì)遺傳育種工作者如何利用該技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)遺傳改良和品種選育具有重要意義。自1987 年石野良純?cè)诖竽c桿菌中發(fā)現(xiàn)“重復(fù)-居間序列(spacer)-重復(fù)”序列[1]，到2007 年在實(shí)驗(yàn)上首次證實(shí)CRISPR-Cas是一種細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)[2]，再到2012 年CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)基本成型[3]，短短幾十年，這一領(lǐng)域的研究發(fā)展日新月異、不斷取得新突破，使其以高效的敲除效率、簡單的操作、位點(diǎn)選擇的寬泛性、廣泛的物種適應(yīng)性及實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)，成為目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法[4]，為作物真正實(shí)現(xiàn)基因組輔助育種提供了確實(shí)有效的手段。2020年，高彩霞研究團(tuán)隊(duì)用一種優(yōu)化過的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing system,PPE)，在原生質(zhì)體中的9 個(gè)水稻位點(diǎn)和7個(gè)小麥位點(diǎn)上產(chǎn)生了所有12種類型的單堿基替換，以及多種點(diǎn)突變和小DNA 片段插入，編輯效率最高可達(dá)19.2%，成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準(zhǔn)刪除的水稻突變體植株，突變效率最高可達(dá)21.8%，這些突變均難以通過現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，這一新突破極大地?cái)U(kuò)展了植物基因組編輯范疇，為植物基因組功能解析及實(shí)現(xiàn)作物精準(zhǔn)育種提供了重要技術(shù)支撐[5]。相比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，其表達(dá)載體插入的位點(diǎn)與基因編輯的位點(diǎn)不同，外源插入質(zhì)粒待基因編輯完成后，可在后代配子形成過程中染色體分離時(shí)被去除，不需要引入外源基因，無轉(zhuǎn)基因爭議，成為近年分子生物學(xué)界的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[6]，應(yīng)用前景十分廣闊。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)已培育出具有優(yōu)良性狀的糧油作物新品系，這些性狀包括產(chǎn)量（水稻千粒重、單粒重）、品質(zhì)（水稻香型、糯性，大豆多根瘤）、抗病性（水稻稻瘟病、小麥白粉?。┑戎匾誀頪7-11]。因此，為了充分認(rèn)識(shí)CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在糧油作物中的研究進(jìn)展，本文對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基本原理、作用機(jī)制以及在糧油作物遺傳改良研究中取得的成績進(jìn)行了梳理，助力CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)在糧油作物遺傳改良和品種優(yōu)化升級(jí)中得到更好、更快的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展歷程及分類

1987年，日本科學(xué)家石野良純?cè)趯?duì)大腸桿菌的堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme, iap)進(jìn)行測(cè)序時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)終止密碼子后的非編碼區(qū)存在一些異常重復(fù)序列，這些序列在原核生物如細(xì)菌的DNA利用率較高，且具有“重復(fù)-居間序列(spacer)-重復(fù)”這一排列特征[1]。同時(shí)期西班牙莫伊察在一種嗜鹽古菌(Haloferax mediterranei)中也發(fā)現(xiàn)了具有“重復(fù)-居間序列-重復(fù)”特征的序列，莫伊察在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)這種序列在微生物中非常普遍，將其命名為短規(guī)律間隔重復(fù)(short regularly spaced repeat, SRSR)[12-13]。2002 年，荷蘭科學(xué)家詹森進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種短規(guī)律間隔重復(fù)特殊結(jié)構(gòu)存在于多個(gè)微生物（原核生物）中，不同物種的重復(fù)序列堿基數(shù)存在差異，并將這種結(jié)構(gòu)重新定義為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat, CRISPR)，他還發(fā)現(xiàn)CRISPR 序列附近還存在多個(gè)編碼序列，將其定名為CRISPR 相關(guān)基因(CRISPR- associated gene,Cas)[14]。法國微生物學(xué)家巴蘭古、霍瓦特利用P1、P2 2株噬菌體侵染鏈球菌（細(xì)菌），在實(shí)驗(yàn)上首次證實(shí)CRISPR-Cas 是一種細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)[2]。2012 年Jinek 等研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR-CasⅡ系統(tǒng)中的Cas9 是個(gè)核酸酶，這個(gè)核酸酶結(jié)合2 個(gè)RNA(crRNA，tracrRNA)便能切割雙鏈DNA[15]，并進(jìn)一步弄清了RNA 和靶DNA 配對(duì)的原則，闡明了CRISPR-CasⅡ系統(tǒng)的作用機(jī)制，至此，CRISPR/Cas9這個(gè)新型基因組定向編輯系統(tǒng)基本成型[3]（見圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展時(shí)間線

根據(jù)CRISPR-Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制將該系統(tǒng)分為3 類，即Ⅰ系統(tǒng)、Ⅱ系統(tǒng)和Ⅲ系統(tǒng)，其中Ⅰ系統(tǒng)和Ⅲ系統(tǒng)具有一定的共性：都是pre-crRNA 被特定的Cas 核酸內(nèi)切酶加工成為成熟的crRNA，crRNA 與多個(gè)Cas蛋白構(gòu)成復(fù)合體后，再對(duì)靶基因進(jìn)行剪切，實(shí)現(xiàn)基因組的定點(diǎn)編輯；在基因編輯過程中，由于需要多個(gè)Cas 蛋白參與，使得CRISPR-CasⅠ系統(tǒng)和Ⅲ系統(tǒng)極難被 應(yīng) 用。CRISPR-Cas Ⅱ系 統(tǒng) 中，pre-crRNA 在tracrRNA（trans-activating crRNA，反式激活crRNA）、Cas9 蛋白和RNA 酶III 共同參與下產(chǎn)生成熟的crRNA，tracrRNA 與crRNA 形成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)并與1個(gè)Cas蛋白構(gòu)成復(fù)合體后，對(duì)靶基因?qū)嵤┘羟?；相?duì)于Ⅰ系統(tǒng)和Ⅲ系統(tǒng)，Ⅱ系統(tǒng)在基因編輯過程中，只需要2種RNA(crRNA和tracrRNA)和1個(gè)Cas蛋白參與，系統(tǒng)更為簡單好利用[16]。

2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的作用機(jī)制及優(yōu)化

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基于Ⅱ系統(tǒng)，是目前用于基因組定向編輯的最主要類型。經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由tracrRNA、crRNA、Cas9蛋白和RNA酶III構(gòu)成的復(fù)合體以及相應(yīng)的靶基因組成，靶基因中包含1 個(gè)由幾個(gè)堿基構(gòu)成的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，用于標(biāo)記外源基因并指示系統(tǒng)的剪切位點(diǎn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制是crRNA通過堿基配對(duì)與tracrRNA 結(jié)合形成特殊的tracrRNA/crRNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)即單一向?qū)NA(small guide RNA)，sgRNA 引導(dǎo)內(nèi)切酶Cas9 蛋白形成sgRNA-Cas9 復(fù)合體，識(shí)別靶基因的PAM 序列后完成與靶基因結(jié)合，并對(duì)靶位點(diǎn)DNA實(shí)施剪切、產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂[17-18]。在修復(fù)過程中，利用細(xì)胞的非同源性末端連接(Nonhomologous end joining, NHEJ) 或 同 源 重 組(Homologous recombination, HR)修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂的DNA 進(jìn)行插入缺失(Indel)、修復(fù)(Repair)或替換(Replacement)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)、植物基因組中的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)敲除、插入、替換、點(diǎn)突變等操作[19-20]。

但由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)依賴間隔區(qū)序列與目標(biāo)基因序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別外源入侵DNA，對(duì)目標(biāo)DNA的匹配程度具有一定的容忍度，允許個(gè)別堿基錯(cuò)配。在基因編輯過程中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的這一特點(diǎn)，導(dǎo)致基因組中與目標(biāo)DNA只有較少堿基差別的其他DNA 也可能會(huì)被切割，稱為脫靶現(xiàn)象，脫靶現(xiàn)象的存在很大程度上阻礙了該技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。為了降低編輯過程中的脫靶效應(yīng)，更好的實(shí)現(xiàn)基因組編輯，科學(xué)家們對(duì)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)：（1）將sgRNA 和Cas9 蛋白構(gòu)建到同一個(gè)表達(dá)載體上，簡化并提高系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率[17-18]。（2）開發(fā)使用脫靶效應(yīng)評(píng)估方法和更優(yōu)的sgRNA設(shè)計(jì)軟件，使用精確匹配度高的sgRNA（20 個(gè)核苷酸長度）和PAM 序列，降低脫靶率[21-23]。（3）通過篩選和改造Cas9 蛋白，比如對(duì)Cas9 蛋白的HNH 和RuvC 2 個(gè)切割元件進(jìn)行優(yōu)化、使用增強(qiáng)型化膿鏈球菌Cas9蛋白突變體(eSpCas9)等，以減弱脫靶效應(yīng)、提高CRISPR/Cas9 系統(tǒng)剪切效率和精準(zhǔn)性[24-26]；比如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9 核酸酶(SaCas9)基因改造后獲得的新變體SaCas9-HF，與野生型Cas9 相比，SaCas9-HF 平均在靶編輯效率為80%，對(duì)于通常具有較少編輯失誤的基因序列，SaCas9-HF具有幾乎無法檢測(cè)到的脫靶活性[27]；Benjamin P.Kleinstiver研究團(tuán)隊(duì)對(duì)SpCas9蛋白進(jìn)行改造升級(jí)獲得的新突變體SpRY，識(shí)別的PAM 序列涵蓋NRN和NYN（Y為C/T）(NRN＞NYN)，幾乎完全放松了Cas9 對(duì)識(shí)別PAM 的要求，從而實(shí)現(xiàn)不需要特定PAM 就可結(jié)合和切割DNA 的目標(biāo)，解決了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)不能靶向不位于PAM 附近的基因位點(diǎn)這一困擾[28]。

3 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在糧油作物遺傳改良中的研究進(jìn)展

作物品種改良的關(guān)鍵是對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良以達(dá)到高產(chǎn)、高品質(zhì)、抗逆等育種目標(biāo)，通過傳統(tǒng)育種途徑改良作物品種，存在遺傳背景復(fù)雜、不良性狀連鎖、性狀穩(wěn)定速度緩慢、費(fèi)時(shí)耗力等劣勢(shì)，育種效率低；分子標(biāo)記能夠?qū)υS多控制重要農(nóng)藝性狀的基因進(jìn)行定位，相對(duì)快速的實(shí)現(xiàn)作物品種改良，但很難實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定向改造，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)卻能解決這一技術(shù)難題。隨著生物信息分析平臺(tái)和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫的廣泛建立，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)利用反向遺傳學(xué)、配合高通量測(cè)序，能有目的地選擇一些有價(jià)值的等位基因進(jìn)行高效定點(diǎn)編輯。自2013 年CRISPR/Cas9 技術(shù)被用于進(jìn)行植物基因組定點(diǎn)編輯研究以來，該技術(shù)已在水稻、小麥、大麥、玉米、大豆、油菜、花生等糧油作物突變體創(chuàng)制、性狀改良等方面得到廣泛應(yīng)用。

3.1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在糧食作物遺傳改良中的研究進(jìn)展

3.1.1 在水稻遺傳改良中的研究進(jìn)展 水稻是重要的糧食作物，也是重要的單子葉模式植物，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯改良中操作相對(duì)容易，并在水稻基因功能研究、突變體創(chuàng)制、品種遺傳改良方面表現(xiàn)出巨大的潛力。2013 年Feng 等[29]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì) 擬 南 芥BRI1、JAZ1、GAI和 水 稻 的ROC5(Rice Outermost Cell- specific gene5)、SPP(Stromal Processing Peptidase)、YSA(Youg Seedling Albino) 3 個(gè)基因?yàn)榘形稽c(diǎn)進(jìn)行編輯，均獲得了純合或雙等位基因突變體，且這些突變體之間差異顯著，這是世界上首次關(guān)于成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行基因編輯的報(bào)道，證實(shí)該技術(shù)不僅能對(duì)模式植物擬南芥、還能對(duì)其他作物如水稻的基因位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯。同年，Shan 等[30]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，也成功對(duì)水稻控制籽粒形狀和分蘗的TaGASR7、TaDEP1基因進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，并獲得純合敲除突變體，與野生型表型相比，突變體株高降低、千粒重和分蘗數(shù)明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)在水稻基因定點(diǎn)編輯方面的可行性。從此，在水稻中掀起了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的研究熱潮，并不斷獲得創(chuàng)新，使水稻成為農(nóng)作物中利用該技術(shù)的模式植物，并且，中國在這一方面已經(jīng)走在了世界前沿。

沈蘭等[7]以控制粒型基因GS3和控制每穗粒數(shù)基因Gn1a為靶基因，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)4 個(gè)優(yōu)質(zhì)水稻品種的靶基因進(jìn)行編輯，在T0代獲得gs3和gs3gn1a突變體，突變體粒長變長、千粒質(zhì)量增加，T1代突變體株系除了目標(biāo)性狀得到改良外，其他性狀未受到明顯影響；同年，又對(duì)水稻品種‘日本晴’8個(gè)農(nóng)藝性狀基因的位點(diǎn)敲除成功，獲得了具有多基因突變組合的突變體[31]。周文甲等[32]以水稻抽穗期基因Hd2、Hd4和Hd5及香味基因Bath2為靶基因，進(jìn)行定點(diǎn)編輯，在T0代便獲得編輯成功的突變植株、T1代分離出無轉(zhuǎn)基因成分且編輯成功的株系，經(jīng)田間抽穗調(diào)查和香味物質(zhì)測(cè)定，突變株系早熟且?guī)в邢阄?；邵高能等[8]也對(duì)香味基因Badh2進(jìn)行編輯，在T1代獲得香味物質(zhì)顯著增加的突變體單株，在T2代便獲得了分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率顯著差異、其他性狀沒發(fā)生顯著改變的香型株系。吳明基等[33]通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)可育水稻品種中間材料GH89的TMS5基因（tms5為溫敏不育基因）進(jìn)行編輯，獲得純合突變株和雙等位突變株，快速成功創(chuàng)制了水稻溫敏核不育系。馮璇等[34]以水稻優(yōu)良保持系209B為材料，對(duì)水稻直鏈淀粉合成主效基因Wx位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，T0代Wx位點(diǎn)純合缺失突變率達(dá)26.9%，T1代純合突變體直鏈淀粉含量顯著降低、糯性品質(zhì)優(yōu)良、其他性狀沒發(fā)生顯著改變，成功將高產(chǎn)的非糯性品系Wx209B 轉(zhuǎn)為糯性品系WX209B，并轉(zhuǎn)育糯稻不育系WX209A。王子璇等[35]對(duì)水稻成花素家族成員OsDTH11基因進(jìn)行敲除，成功獲得了該基因62 bp缺失、31 bp缺失的2種類型且能穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料。范美英等[36]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)以Wx為靶基因，遺傳改良優(yōu)質(zhì)粳稻‘秀水134’，發(fā)現(xiàn)45個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有41個(gè)株系發(fā)生靶定位置堿基修改，突變率達(dá)到91.1%，并獲得了糯稻新材料。徐鵬等[10]利用該技術(shù)對(duì)水稻稻瘟病相關(guān)基因Pita、Pi21和ERF922進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得Pi21單突變純合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突變純合株系，突變株系的稻瘟病抗性顯著提高，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的抗稻瘟病水稻材料。還有高彩霞研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9改良后的PPE 編輯系統(tǒng)，在原生質(zhì)體中的9 個(gè)水稻位點(diǎn)產(chǎn)生了所有12種類型的單堿基替換，以及多種點(diǎn)突變和小DNA 片段插入，成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準(zhǔn)刪除的水稻突變體植株[5]。

以上研究成果表明，自2013 年以來，水稻的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)已不斷趨近成熟，能夠快速、準(zhǔn)確對(duì)水稻每穗粒數(shù)基因、抽穗基因、香味基因、控制糯性基因、溫敏不育基因等各種功能性基因位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，并能在短時(shí)間內(nèi)獲得能進(jìn)行穩(wěn)定遺傳的突變植株和目標(biāo)突變株系，大大縮短了水稻育種進(jìn)程，提高了水稻育種效率，使水稻定向育種成為可能。

3.1.2 在小麥遺傳改良中的研究進(jìn)展 小麥?zhǔn)钱愒炊啾扼w，基因組龐大(17 Gb)、重復(fù)性高、遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)小麥基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯、實(shí)現(xiàn)遺傳改良相對(duì)比較困難。高彩霞課題組率先實(shí)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小麥特定基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，且在小麥基因組編輯方面一直處于國際領(lǐng)先水平。該課題組成員Shan 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)控制小麥籽粒形狀和分蘗的基因TaGASR7、TaDEP1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，原生質(zhì)體突變效率達(dá)到14.5%～38.0%，首次實(shí)現(xiàn)了該技術(shù)對(duì)小麥基因的定點(diǎn)編輯[30]。課題組成員王延鵬等報(bào)道以六倍體小麥抗白粉病相關(guān)基因TaMLO單拷貝設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)小麥原生質(zhì)體進(jìn)行定點(diǎn)編輯，成功在A基因組定點(diǎn)插入能穩(wěn)定遺傳的片段，表明該技術(shù)不僅可以同時(shí)突變多倍體小麥中的多個(gè)拷貝，也能特異突變單個(gè)基因拷貝[37]。2016 年，依然是該團(tuán)隊(duì)的Zhang 等繼續(xù)對(duì)未成熟胚細(xì)胞的TaMLO位點(diǎn)進(jìn)行編輯，T0代獲得突變體材料，并在后代分離出沒有任何轉(zhuǎn)基因成分的突變體植株；2017 年，Zhang 等又對(duì)小麥EDR1基因的3 個(gè)同源基因同時(shí)進(jìn)行敲除，在T1代便獲得了沒有任何可檢出轉(zhuǎn)基因成分的突變體材料，突變體植株對(duì)白粉病具有很好的抗性，進(jìn)一步證實(shí)了CRISPR/Cas9 技術(shù)能對(duì)多倍體小麥進(jìn)行定點(diǎn)編輯的可行性和有效性[9,38]。杜麗君等[39]以TaMOC1基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，利用農(nóng)桿菌將表達(dá)載體pBUE411-TaMOC1-Cas9 轉(zhuǎn)移到野生型小麥品種‘科農(nóng)199’的幼胚中，確定了TaMOC1對(duì)小麥分蘗的作用，并獲得TaMOC1的轉(zhuǎn)基因植株，但pBUE411-TaMOC1-Cas9 轉(zhuǎn)化效率僅為1.6‰。高彩霞研究團(tuán)隊(duì)Liang 等 利 用CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins（RNPs核糖核蛋白）技術(shù)對(duì)面包小麥的TaGW2TaGW2和TaGASR7基因進(jìn)行編輯，同時(shí)與pGE-TaGW2 技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，原生質(zhì)體突變效率從35.6%～41.2%降低到21.8%～33.4%、脫靶率從30.8%降至5.7%，未成熟胚細(xì)胞編輯效率從0.99%～1.00%降低到0.18%～0.21%、脫靶率從0.76%降至0.03%，雖然編輯效率有所降低、但同時(shí)更大幅度的降低了脫靶率；對(duì)獲得的T0代植株基因位點(diǎn)的突變率進(jìn)一步跟蹤，gw2-RNPs 與pGETaGW2 兩種技術(shù)的突變率分別為4.4%和4.7%，突變效率相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CRISPR/Cas9 RNPs 技術(shù)不僅能完全消除CRISPR/Cas9體系質(zhì)粒片段整合到目的基因，還能大幅度降低脫靶率、快速（7～9周內(nèi)）獲得不含任何外源基因的目標(biāo)突變體，從而為更有效的利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)研究小麥基因功能以及定向培育新品種提供了新方法[40-41]。2020 年，該研究團(tuán)隊(duì)用一種優(yōu)化過的CRISPR/Cas9 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing system,PPE)，在原生質(zhì)體中6個(gè)小麥位點(diǎn)上產(chǎn)生了所有12種類型的單堿基替換，以及多種點(diǎn)突變和小DNA片段插入，這些突變均難以通過現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)[5]。以上研究結(jié)果表明，因?yàn)樾←準(zhǔn)钱愒炊啾扼w（六倍體居多）、基因組龐大，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)編輯時(shí)效率很低，但隨著對(duì)系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化，使其在短時(shí)間內(nèi)成功獲得純合的、能穩(wěn)定遺傳的目標(biāo)突變株系成為可能。

表1 CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻遺傳改良中的研究進(jìn)展

3.1.3 在玉米遺傳改良中的研究進(jìn)展 在玉米方面，Liang等在玉米原生質(zhì)體中，成功利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)玉米磷酸激酶ZmIPK內(nèi)2個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行編輯，這是玉米方面利用此技術(shù)最早的報(bào)道，但未獲得 再 生 植 株[42]。2015—2016 年，Svitashev 等 利 用CRISPR/Cas9 技術(shù)，以乙酰乳酸合成酶基因ALS2為靶基因，通過基因槍轟擊法，將CRISPR-Cas9-ALS2-gRNA 復(fù)合物轉(zhuǎn)入玉米未成熟胚細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因ALS2的定點(diǎn)編輯，并指出利用該技術(shù)可以高效地獲得玉米基因編輯再生植株[43-44]。Feng 等[45]以玉米Zmzb7基因?yàn)榘谢?，利用農(nóng)桿菌將特異的CRISPRCas9-gRNA質(zhì)粒侵染轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚，實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)編輯，突變率達(dá)19%～31%。2017 年，Char 等[46]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)，成功對(duì)玉米4個(gè)基因ZmAgo18a、Zm-Ago18b、Zm-Ago a1和a4實(shí)現(xiàn)高效靶基因突變，并獲得了突變植株。Li 等[47]利用特異RNA介導(dǎo)CRISPR/Cas9誘變系統(tǒng)，對(duì)玉米無葉舌基因LG1進(jìn)行編輯，T0植株代中突變效率達(dá)到51.5%～91.2%，分別以突變體和野生型作為親本進(jìn)行雜交育種，突變體作為親本的雜交玉米葉夾角生長角度更小。Chen 等[48]報(bào)道利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯玉米雄性不育基因MS8，T0代獲得了8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，突變株系基因組分析結(jié)果表明MS8基因并沒有發(fā)生突變，而是其他位點(diǎn)發(fā)生了單堿基突變，突變性狀能穩(wěn)定遺傳給后代，獲得新的無外源轉(zhuǎn)基因污染的(Transgene-Free)的玉米雄性不育系品系。

3.2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在油料作物遺傳改良中的研究進(jìn)展

與水稻、小麥、玉米等糧食作物相比，受遺傳轉(zhuǎn)化效率低、缺乏通量載體等因素的影響，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在花生、大豆、油菜等油料作物中的研究進(jìn)展相對(duì)比較落后，特別是在花生這一作物中，相關(guān)報(bào)道很少，He 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)、以花生毛狀根為材料，對(duì)FAD2基因成功進(jìn)行了定點(diǎn)編輯，但并沒有成功獲得相應(yīng)的突變體植株[49]。

3.2.1 在大豆遺傳改良中的研究進(jìn)展Li等[50]采用粒子轟擊轉(zhuǎn)化法，將CRISPR/Cas9載體和供體DNA共轉(zhuǎn)化到大豆胚愈傷組織中，在大豆中實(shí)現(xiàn)了靶位點(diǎn)突變和基因插入，其中DD20和DD432個(gè)基因位點(diǎn)的突變頻率分別達(dá)到59%和76%，并且通過編輯大豆ALS1基因成功獲得了氯磺隆抗性轉(zhuǎn)基因大豆。Cai 等[51]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，首次應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)大豆光周期調(diào)節(jié)基因3 個(gè)不同靶位點(diǎn)進(jìn)行靶向突變，結(jié)果證實(shí)T1代大豆植株在自然光周期下發(fā)生晚花現(xiàn)象，T2代大豆純合體在長、短日照下均呈現(xiàn)出晚花表型；并從T1/T2代大豆植株中鑒定出一批不含有轉(zhuǎn)基因元件的純合突變體，成功創(chuàng)制出穩(wěn)定遺傳的大豆突變體材料，為深入研究GmFT2a基因的功能以及大豆育種提供了全新材料。以大豆子葉節(jié)為遺傳轉(zhuǎn)化體，不僅提高了獲得突變植株的幾率，還縮短了獲得突變體植株的時(shí)間，為有效利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行大豆基因定點(diǎn)編輯具有非常重要的意義，后續(xù)研究人員基本上都是用大豆子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化體進(jìn)行相關(guān)方面的研究，且成效顯著。候智紅等[52]以大豆‘華夏3號(hào)’為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶基因FAD2-1A外顯子區(qū)進(jìn)行靶向編輯，T1代獲得純合的GmFAD2-1A突變體，純合突變體種子油酸含量達(dá)23%，顯著高于‘華夏3 號(hào)’，但株高、葉形、花色、種皮色、生育期等其他性狀均無顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)FAD2-1A基因是油酸代謝過程中的關(guān)鍵基因，并獲得了穩(wěn)定純合的株型健壯、豐產(chǎn)性突出、綜合抗性好、油酸含量高的GmFAD2-1A突變體植株。吳艷等[53]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，對(duì)大豆GmSPL3家族基因進(jìn)行編輯，將pYL CRISPR/Cas9-GmSPL3-gRNA 載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，侵染大豆子葉節(jié)獲得spl3abcd突變體，并與野生型表型進(jìn)行對(duì)比，表明GmSPL3在調(diào)控大豆植株形態(tài)方面發(fā)揮重要功能。柏夢(mèng)焱等[11]為研究豆科作物結(jié)瘤自我調(diào)節(jié)機(jī)制的作用機(jī)理，運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)創(chuàng)制大豆品種‘華春6 號(hào)’超結(jié)瘤gmnark基因，獲得了超結(jié)瘤、矮小和葉片深綠的突變體材料。以往研究結(jié)果表明，雖然花生與大豆都是豆科作物和油料作物，但是相對(duì)于花生，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在大豆突變體創(chuàng)制、遺傳改良方面要成熟得多，為利用此系統(tǒng)進(jìn)行大豆定向育種提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，也為花生提供了有效的參考。

表2 CRISPR/Cas9技術(shù)在小麥和玉米遺傳改良中的研究進(jìn)展

3.2.2 在油菜遺傳改良中的研究進(jìn)展 在油菜方面，成功利用此CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因定點(diǎn)編輯的最早報(bào)道是在2017年，Yang等[54]對(duì)油菜的BnCLV基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，用不同的sgRNA 序列產(chǎn)生的突變頻率為0%～48.5%不等，證實(shí)sgRNA 對(duì)CRISPR/Cas9 編輯效率的重要性，同時(shí)也證實(shí)了BnCLV基因?qū)刂朴筒说拿壳v粒數(shù)和重量具有重要作用。Sun等[55]利用該技術(shù)對(duì)BnWRKY11的2 個(gè)位點(diǎn)和BnWRKY70的4 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行 編 輯，T0代 獲 得 的22 株BnWRKY11和8 株BnWRKY70轉(zhuǎn)化植株中，基因位點(diǎn)發(fā)生突變的分別有12株和4株，突變率分別為54.5%和50%，對(duì)T2植株繼續(xù)跟蹤，BnWRKY70位點(diǎn)發(fā)生突變的植株對(duì)菌核病的抗性增加、BnWRKY11發(fā)生突變的植株沒有明顯效果，從而推斷出BnWRKY70基因可能與調(diào)控油菜菌核病抗性有關(guān)。Zhai等[56]對(duì)油菜的BnIND和BnALC2個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，在T0代獲得的251 株BnIND和269株BnALC轉(zhuǎn)化植株中，分別有202 株和206 株的基因位點(diǎn)發(fā)生了插入突變，突變率分別為80.5%和76.6%，對(duì)純合的T2BnIND突變植株繼續(xù)研究，結(jié)果表明BnIND基因可能與油菜抗裂莢有關(guān)，獲得了能穩(wěn)定遺傳的、抗裂莢的純合突變體株系，抗裂莢一直是油菜育種的瓶頸之一，很難通過普通育種方法得到改良，利用CRISPR/Cas9技術(shù)卻在短時(shí)間內(nèi)攻克了這一困擾油菜育種多年的難題。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為油菜基因功能研究、高效定向培育新品種等方面提供了可靠而有效的新途徑。

4 小結(jié)與展望

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)原理簡單，自2013 年誕生以來便得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用，是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法，操作簡單、周期短、位點(diǎn)選擇多，并且隨著科技人員不斷努力、技術(shù)日益創(chuàng)新，如何提高編輯效率、降低脫靶率等難題也不斷得到了解決，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)水稻、小麥、玉米、大豆、油菜等糧油作物的靶基因進(jìn)行定向精準(zhǔn)編輯。此外，通過該系統(tǒng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株，通過傳代，可以分離獲得沒有轉(zhuǎn)基因片段、且能穩(wěn)定遺傳的突變株系及品種，不會(huì)產(chǎn)生類似由轉(zhuǎn)基因引發(fā)的可能影響物種進(jìn)化、食品安全等方面的不利因素，有利于利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)改良后的糧油作物品種規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)，還能高效、定向改良某些性狀（傳統(tǒng)育種方法難以改良）從而育成目標(biāo)新品種，所有這些都使該系統(tǒng)成為糧油作物及其他物種基因組編輯最熱門的新手段。但是，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在糧油作物遺傳育種上的利用效率很大程度上依賴作物本身功能基因的解碼、轉(zhuǎn)化體系的建立以及編輯效率的高低，因此，解決這些難題是加大應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行作物遺傳改良、定向育種的關(guān)鍵。

表3 CRISPR/Cas9技術(shù)在大豆、油菜和花生遺傳改良中的研究進(jìn)展