劉雙慶 車德海 綜述 孟慶威 審校

表觀遺傳學(xué)是指不改變DNA序列的條件下發(fā)生的影響表型或基因型的穩(wěn)定可遺傳的基因修飾，是調(diào)控基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)[1]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最為廣泛研究的機(jī)制之一。主要通過(guò)改變DNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子的結(jié)合能力發(fā)揮表觀調(diào)控作用[2]。在基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控中，胞嘧啶甲基化產(chǎn)物5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)可去甲基化形成胞嘧啶，其中間產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine，5-hmC)被稱作高等生物基因組的“第六堿基”[3-4]。5-hmC是一種穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)修飾[5]。生理狀態(tài)下，5-hmC在胚胎植入[6]、神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)控[7]等方面發(fā)揮作用。在腫瘤中，5-hmC能作為疾病診斷、療效預(yù)測(cè)的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

在腫瘤中，5-hmC總體呈減少趨勢(shì)。腫瘤細(xì)胞全基因組5-hmC水平的降低最早發(fā)現(xiàn)于血液系統(tǒng)腫瘤[4]，而后在宮頸癌[10]、前列腺癌[11]、黑色素瘤[12]、肝癌[13]等腫瘤組織及細(xì)胞系中，均觀察到5-hmC總體水平的改變和5-hmC在基因上的重新分布。作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要分子，5-hmC能通過(guò)參與Wnt等信號(hào)通路的調(diào)控[14]、影響組蛋白修飾[15]，與miRNA相互作用[16]等途徑影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤中5-hmC的動(dòng)態(tài)變化可能是多種因素作用的結(jié)果，主要機(jī)制包括DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)5-hmC的丟失[8]；TET酶的下調(diào)或突變[12，16]；IDH的下調(diào)或突變[17]；維生素C的減少[18]；5-hmC清除酶的增多[8]等。隨著表觀遺傳學(xué)研究的逐漸深入，5-hmC作為腫瘤標(biāo)志物的潛能逐漸受到重視，5-hmC在時(shí)間和空間上動(dòng)態(tài)變化的機(jī)制也引起研究者的廣泛關(guān)注。

1 5-hmC概述

5-hmC是5-mC去甲基化的重要中間產(chǎn)物和參與因子，5-mC的去甲基化包括主動(dòng)去甲基化(De novo methylation or Active DNA demethylation)和被動(dòng)去甲基化(Maintenance methylation or passive DNA demethylation)兩種機(jī)制，5-hmC主要參與主動(dòng)去甲基化[4]。TET1(Ten-eleven-translocation 1)酶在5-mC第五位碳原子的甲基上添加一個(gè)羥基，使5-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC。這一過(guò)程稱為羥甲基化，是5-mC主動(dòng)去甲基化的啟動(dòng)過(guò)程[3，19]。TET家族酶還能進(jìn)一步將5-hmC的羥基氧化為醛基形成5-甲?；奏?5-formyl cytosine，5-fC)，氧化為羧基形成5-甲羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5-caC)。5-fC和5-caC能被TDG(Thymine-DNA glycosylase)識(shí)別并切除，再通過(guò)BER(Base excision repair)途徑轉(zhuǎn)化為胞嘧啶完成5mC的主動(dòng)去甲基化[3-4](圖1)。

圖1 胞嘧啶甲基化與5-mC主動(dòng)去甲基化Figure 1 The cycle of DNA methylation and active demethylation

2 腫瘤中5-hmC的特點(diǎn)與作用

2.1 腫瘤中5-hmC表達(dá)水平的改變

關(guān)于腫瘤中5-hmC的水平的改變，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了多項(xiàng)研究。與成熟黑色素細(xì)胞和黑色素痣相比，黑色素瘤細(xì)胞中5-hmC水平較低。且分期晚的黑色素瘤5-hmC水平較早期更低[12，20-21]。早期肝細(xì)胞癌中即發(fā)現(xiàn)全基因組5-hmC水平的減少，且5-hmC的減少與肝癌的分期晚、侵襲性強(qiáng)、AFP水平高、肝功能受損及腫瘤負(fù)荷大相關(guān)[13，16，22-23]。在宮頸癌[10]、前列腺癌[11]等實(shí)體瘤中也有類似發(fā)現(xiàn)。因此在實(shí)體瘤中，5-hmC可以作為惡性腫瘤的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，具有一定的診斷和判斷預(yù)后的價(jià)值。然而，在肺癌患者的cfDNA監(jiān)測(cè)中，兩個(gè)不同的研究得出了截然相反的結(jié)果。Song等[24]的研究結(jié)果顯示肺癌患者cfDNA中5-hmC水平較健康人低，且分期越晚的患者cfDNA中5-hmC水平越低，與前人在實(shí)體瘤中的結(jié)論相似。Zhang等[25]卻發(fā)現(xiàn)NSCLC患者cfDNA中5-hmC較健康人增多，且5-hmC富集區(qū)域(5-hmC-enriched regions，hmRs)的分布更廣泛。因此僅測(cè)量cfDNA中5-hmC水平的改變可能無(wú)法作為可靠的腫瘤標(biāo)志物。應(yīng)該結(jié)合5-hmC的調(diào)控功能進(jìn)一步探討5-hmC的分布情況。盡管不同研究得出了不同結(jié)論，但并不影響5-hmC作為腫瘤標(biāo)志物的潛力。

2.2 腫瘤中5-hmC分布的改變

除了5-hmC總體水平的改變，在基因?qū)用妫?-hmC可以分布在基因的CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、外顯子等區(qū)域[9]?；蝮w(Gene body)的5-hmC增多常提示基因活躍，TSS(Transcription start site)的5-hmC增多則與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)[5]。在肝癌中，研究者認(rèn)為5-hmC多聚集在CpG島岸(CGI shores)，即CpG島上游距離不超過(guò)2kb的區(qū)域，并呈雙峰分布。5-hmC在空間上的這種改變可能通過(guò)影響增殖及分化相關(guān)基因的表達(dá)水平參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。5-hmC在基因上的分布特點(diǎn)與5-hmC發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控的方式是分不開的，因此研究者將目光轉(zhuǎn)向探索5-hmC在腫瘤中的作用機(jī)制。

2.3 5-hmC參與腫瘤表觀遺傳學(xué)調(diào)控的機(jī)制

5-hmC可能參與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。在胰腺癌組織中，5-hmC和TET1水平均有降低，且二者表達(dá)量呈正相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TET1時(shí)，Wnt/β-catenin通路中的CTNNB1、FZD7、GSK-3β、Cyclin D等分子下調(diào)，磷酸化的GSK-3β升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路受抑制。因此推測(cè)TET1酶可能通過(guò)調(diào)控5-hmC水平抑制Wnt/β-catenin通路進(jìn)而阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)[14]。

對(duì)于肝細(xì)胞癌和正常肝細(xì)胞的研究顯示，5-hmC主要聚集在轉(zhuǎn)錄活躍基因的CpG島岸區(qū)域，且5-hmC的分布形成一個(gè)雙峰。人干細(xì)胞和腦組織中的5-hmC分布也具有同樣特點(diǎn)。結(jié)合組蛋白修飾的研究，發(fā)現(xiàn)H3K4me1在轉(zhuǎn)錄活躍基因的CpG島岸周圍也呈基本一致的雙峰分布，提示H3K4me1與5-hmC之間可能有潛在的交叉作用[15]。另有研究顯示5-hmC的分布與H3K4Me2、H3K4Me3等組蛋白修飾相關(guān)。這些結(jié)果提示5-hmC可能與組蛋白修飾相互作用，參與CpG島岸對(duì)基因的調(diào)控[26]。

除了上述調(diào)控機(jī)制，5-hmC還可以通過(guò)調(diào)節(jié)染色體空間結(jié)構(gòu)的形成和重構(gòu)來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。例如，5-hmC能抑制MeCP2(Methyl-CpG-binding protein 2)、MBDs(Mehyl-CpG-binding domain proteins)等與甲基化的CpG的結(jié)合能力，以此抑制5-mC對(duì)基因的調(diào)控作用[9]。5-hmC也可能參與EMT[14，27]，而EMT能參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[28]。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是復(fù)雜而精密的，5-hmC在腫瘤中的作用機(jī)制僅僅露出冰山一角。闡明5-hmC在腫瘤基因中的分布情況，探索5-hmC在腫瘤表觀調(diào)控中的作用機(jī)制，將為5-hmC作為腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

3 腫瘤中5-hmC表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控

3.1 DNA復(fù)制時(shí)的5-hmC丟失

腫瘤細(xì)胞增殖速度較快，研究者在鼠胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了5-hmC在DNA復(fù)制過(guò)程中的被動(dòng)丟失。在腫瘤細(xì)胞中，雖然DNA損傷能夠?qū)е?-mC向5-hmC轉(zhuǎn)化，但DNA復(fù)制頻率的增加會(huì)導(dǎo)致5-hmC的丟失。同樣的，在腦部腫瘤中，復(fù)制水平較高的細(xì)胞5-hmC水平較低[8]。

3.2 TET酶的下調(diào)或突變導(dǎo)致腫瘤中5-hmC水平降低

TET水平的下調(diào)也能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中5-hmC水平的降低[16]，在前列腺癌、乳腺癌、直腸癌和肝癌中均得到證實(shí)。在黑色素瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中，TET2的表達(dá)量也有降低，同時(shí)5-hmC水平下調(diào)[12]。將乳腺癌和肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞對(duì)比，研究者還發(fā)現(xiàn)TET3表達(dá)量的降低也與5-hmC水平的降低有關(guān)，此外，TET3水平的降低與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[29]。

3.3 IDH的下調(diào)或突變導(dǎo)致腫瘤中5-hmC水平降低

異檸檬酸脫氫酶(Isocitrated dehydrogenase，IDH)的突變也是腫瘤中5-hmC減少的可能機(jī)制。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑色素瘤中均發(fā)現(xiàn)IDH1和(或)IDH2的突變。突變的IDH能阻斷TET共同作用分子αKG的產(chǎn)生，并產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑2HG，從而削弱TET的作用。故IDH突變至少能部分解釋腫瘤中5-hmC水平的降低[17]。

3.4 腫瘤組織中維生素C的減少導(dǎo)致腫瘤中5-hmC水平降低

腫瘤組織中維生素C的減少也是5-hmC丟失的機(jī)制之一。體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，維生素C能通過(guò)TET途徑促進(jìn)5-hmC生成。研究者發(fā)現(xiàn)維生素C能增多Fe3+向Fe2+的轉(zhuǎn)換加強(qiáng)TET活性。維生素C的減少則與轉(zhuǎn)運(yùn)體SVCT2減少、氧化應(yīng)激的增加等因素相關(guān)[18，30]。

3.5 5-hmC清除酶的增多導(dǎo)致腫瘤中5-hmC水平降低

5-hmC清除相關(guān)酶的增多也能導(dǎo)致5-hmC減少，如在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，觀察到AID/APOBEC家族蛋白和BER糖基化酶等酶的過(guò)表達(dá)[8]。

腫瘤中5-hmC的減少可能是上述機(jī)制共同作用的結(jié)果，TET酶對(duì)5-mC、5-hmC等底物的催化具有選擇性，其機(jī)制仍需探究[7]。在復(fù)雜但嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋碛^遺傳學(xué)調(diào)控中，決定基因表觀修飾狀態(tài)的具體調(diào)控機(jī)制更需要一步步探索。

4 腫瘤中5-hmC的臨床價(jià)值

5-hmC在腫瘤組織及cfDNA中的水平及不同基因位點(diǎn)的分布可作為實(shí)體瘤診斷及預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。但不可忽視的是，5-hmC的檢測(cè)方法尚不統(tǒng)一，為提高5-hmC作為腫瘤預(yù)測(cè)因子的準(zhǔn)確性，需要推出廣泛認(rèn)可的檢驗(yàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)流程。

5-hmC也可作為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，急性粒細(xì)胞性白血病治療藥物HHT(Homeharringtonine)能夠降低TET表達(dá)進(jìn)而減少5-hmC發(fā)揮抗白血病作用[31]。在膀胱癌[18]、白血病[32]、腎癌[33]中均發(fā)現(xiàn)了維生素C能上調(diào)5-hmC并抑制腫瘤增殖。壓力、飲食運(yùn)動(dòng)等外界因素也與5-hmC水平相關(guān)[7]。因此以5-hmC為靶點(diǎn)藥物的研究具有潛在的臨床意義，生活方式的改善對(duì)5-hmC及腫瘤的潛在影響也待探究。但由于TET的復(fù)雜調(diào)控，通過(guò)靶向TET調(diào)節(jié)5-hmC的治療方法應(yīng)用前景很難預(yù)測(cè)。

5 小結(jié)與展望

在腫瘤中，5-hmC作為一種穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在復(fù)雜的調(diào)控和反饋機(jī)制下，5-hmC水平處于動(dòng)態(tài)平衡中。對(duì)5-hmC的分布情況及調(diào)控機(jī)制的研究有助于發(fā)掘5-hmC的臨床應(yīng)用潛力。5-hmC在腫瘤組織及cfDNA中的水平及不同基因位點(diǎn)的分布可作為實(shí)體瘤診斷及預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)，5-hmC也有望成為抗腫瘤治療靶點(diǎn)。除5-hmC外，5-fC、5-caC也能參與DNA的表觀遺傳學(xué)調(diào)控并影響甲基化去甲基化的動(dòng)態(tài)進(jìn)程。相信在不久的未來(lái)，關(guān)于胞嘧啶及其修飾產(chǎn)物，以及TET家族酶作用機(jī)制的研究，會(huì)迎來(lái)更多引人矚目的進(jìn)展。