金慧，趙城，魏琳婷，鄭光明，尹怡

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(廣州)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

常見的氨氮檢測方法有納氏試劑分光光度法[8-9]、連續(xù)流動-水楊酸分光光度法[10-11]、蒸餾-中和滴定法[12-13]、氣相分子吸收光譜法[14-15]等。其中納氏試劑分光光度法中納氏試劑含有汞，會危害實(shí)驗(yàn)人員健康；連續(xù)流動-水楊酸分光光度法能實(shí)現(xiàn)自動化檢測，但是對樣品的潔凈程度要求較高，對于較渾濁的漁業(yè)水質(zhì)不能直接測定，需經(jīng)過蒸餾等前處理步驟；蒸餾-中和滴定法的樣品需經(jīng)過預(yù)蒸餾，無法實(shí)現(xiàn)自動化檢測，不利于大批量樣品的測定。氣相分子吸收光譜法由Gresser等[16]在1976年研發(fā)，1982年用于氨氮的自動測定[17]，并于2000年實(shí)現(xiàn)儀器國產(chǎn)化[18]。目前國內(nèi)該儀器生產(chǎn)技術(shù)較為成熟，檢測方法簡單、成本低、分析時(shí)間快(單個樣品2～3 min)、自動化程度高、測定準(zhǔn)確[19-21]。該方法是將氨氮置于酸性介質(zhì)中，用次溴酸鹽將氨氮氧化成等量亞硝酸鹽，通過乙醇催化產(chǎn)生NO2氣體，最終測定NO2的含量。由于該方法是測定轉(zhuǎn)化的氣體，因此水樣色度、懸浮物等干擾物對其影響基本可以忽略。

在實(shí)際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，水樣中的氨氮不穩(wěn)定，容易受到溫度、pH等因素影響。因此，需要優(yōu)化貯運(yùn)條件來確保氨氮含量穩(wěn)定。在生活飲用水、地表水和環(huán)境水樣等領(lǐng)域，該方法的樣品前處理常常被忽視，少部分研究人員直接采用SC/T 9102.1—2007、SC/T 9102.2—2007和SC/T 9102.3—2007的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[22-25]，這些標(biāo)準(zhǔn)雖然詳細(xì)規(guī)定了樣品采集的工具和方法，但對樣品的保存和運(yùn)輸條件規(guī)定不具體。因此，本研究優(yōu)化了樣品pH、運(yùn)輸條件、貯存溫度、貯存時(shí)間和樣品均勻性等貯運(yùn)條件以及樣品前處理?xiàng)l件，建立了氣相分子吸收光譜儀測定漁業(yè)水質(zhì)中氨氮的方法。同時(shí)，采用該方法對采集的漁業(yè)水源、養(yǎng)殖淡水和海水進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評估。本研究旨在獲得簡單具體的樣品貯運(yùn)條件，優(yōu)化樣品前處理步驟，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及可批量檢測的氣相分子吸收光譜法測定漁業(yè)水質(zhì)中氨氮含量方法，為漁業(yè)水質(zhì)中氨氮的快速檢測、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中水質(zhì)實(shí)時(shí)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控及漁業(yè)水生態(tài)保護(hù)提供重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

AJ-3700氣相分子吸收光譜儀(上海安杰環(huán)保科技股份有限公司)，配有自動進(jìn)樣器和自動稀釋功能；AL204分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司(上海))；超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 試劑

1 000 μg/mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB 04-2832-2011)購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；水質(zhì)氨氮環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)樣品(批號：2005120、2005122)購自環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；濃鹽酸為優(yōu)級純(廣州化學(xué)試劑廠)；濃硫酸以及無水乙醇為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)；溴酸鉀、溴化鉀以及氫氧化鈉均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為25 ℃，電阻率>10 MΩ·cm的無氨水。

6 mol/L鹽酸：將500 mL濃鹽酸緩慢倒入裝有500 mL水的1 L大燒杯中，攪拌均勻，恢復(fù)至室溫待用。

載流液：向1 L大燒杯中依次加入500 mL 6 mol/L的鹽酸，無水乙醇150 mL，水350 mL充分搖勻，靜止至常溫?zé)o氣泡，敞口放置1d后使用。

400 g/L氫氧化鈉溶液：稱取80.0 g氫氧化鈉于500 mL燒杯中，加入190 mL水，迅速攪拌溶解，待恢復(fù)至室溫，用膠頭滴管定容至200 mL，于聚乙烯瓶中密封保存，24 h后待用。

溴酸鹽混合液：稱取2.81 g溴酸鉀及30.00 g溴化鉀，加水溶解，定容至500 mL棕色容量瓶中待用，0～4 ℃避光條件下貯藏，可保存90 d。

氨氮氧化劑：在1 L棕色玻璃瓶中依次加入400 mL水，12 mL溴酸鹽混合液，24 mL 6 mol/L鹽酸，于暗處靜置5 min，加入200 mL 400 g/L氫氧化鈉溶液，充分搖勻，待小氣泡逸盡再使用。注意溶液在18～28 ℃溫度下配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確移取氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.00 mL，定容至500 mL，獲得濃度為2.00 mg/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器參數(shù)

氘燈電流：50.00 mA；測定波長：213.90 nm；載氣流量：0.197 L/min；載氣：空氣；加熱系統(tǒng)：87.5 ℃；制冷系統(tǒng)：1.8 ℃；樣品泵速：80 r/min；試劑泵速：45 r/min；氧化泵速：35 r/min。

1.4 樣品采集與保存

按照SC/T 9102.1—2007[26]、SC/T 9102.2—2007[27]和SC/T 9102.3—2007[28]規(guī)定的方法取多份水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣。水樣采集于聚乙烯瓶或玻璃瓶中，并充滿樣品瓶。水樣采集后加硫酸調(diào)節(jié)pH為1～3，采樣運(yùn)輸時(shí)間小于6 h可常溫貯運(yùn)，置于4 ℃冷藏可保存10 d。

1.5 方法優(yōu)化

1.5.1 氨氮樣品pH

采集2 L水產(chǎn)養(yǎng)殖用水平均分裝在4個500 mL棕色磨口玻璃瓶中，取其中1瓶快速測定氨氮初始含量。隨后對另外3個樣品加入1 mol/L稀硫酸調(diào)節(jié)水樣的pH分別為1、2和3，于4 ℃避光條件下保存，連續(xù)測定10 d，每次測定設(shè)置3個平行并取平均值，繪制不同pH對樣品的氨氮含量影響圖。

1.5.2 運(yùn)輸溫度

將現(xiàn)場采集并經(jīng)酸固定的樣品置于常溫環(huán)境(24±5)℃中模擬運(yùn)輸狀態(tài)，每2 h測定氨氮濃度一次，連續(xù)測定16 h。以氨氮濃度為縱坐標(biāo)，運(yùn)輸時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制常溫狀態(tài)下16 h內(nèi)樣品中氨氮含量變化圖。

1.5.3 貯存溫度

將現(xiàn)場采集并經(jīng)酸固定的樣品分裝在2個500 mL棕色磨口玻璃瓶中，分別置于4 ℃和常溫(24±5)℃2種條件下貯存10 d，連續(xù)10 d測定水樣的氨氮含量變化，繪制樣品在常溫與冷藏狀態(tài)下10 d內(nèi)的氨氮含量變化圖。

1.5.4 水樣均勻性

以4 ℃密封冷藏1 d的水樣為研究對象，分別用5 mL膠頭滴管小心吸取下層液和上層液各40 mL，然后搖勻樣品取搖勻液40 mL，測定其氨氮含量，用t-檢驗(yàn)比較之間的差異。

1.5.5 過濾

過濾是一種簡單高效的基質(zhì)除雜方法。其濾紙按材料可分為棉質(zhì)纖維濾紙、玻璃微纖維濾紙以及其他濾紙。棉質(zhì)纖維濾紙一般分為定性濾紙、定量濾紙及層析定性分析濾紙[29]?？紤]到層析定性濾紙主要用于色譜分析，本研究選擇玻璃微纖維濾紙、定性濾紙以及定量濾紙3種不同品牌的濾紙測定過濾對氨氮測定的影響。選用多個品牌的12種濾紙(6種定性濾紙、5種定量濾紙以及1種玻璃微纖維濾紙)，每種濾紙隨機(jī)抽取3張，對1 mg/L氨氮標(biāo)樣過濾后進(jìn)行測定，重復(fù)3次。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣品測定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣盤上，設(shè)置好儀器參數(shù)，啟動測試。自動進(jìn)樣器吸取氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)驗(yàn)用水，自動稀釋各標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液：0、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L，泵入氣相分子吸收光譜儀測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的氨氮濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 樣品測定

移取45 mL搖勻的樣品至50 mL樣品管中，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的步驟，進(jìn)行樣品的測定。若試樣中氨氮含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍，稀釋樣品后重新測定。

1.7 檢出限與測定下限

按照樣品分析的全部步驟，配制0.03 mg/L低濃度氨氮樣品重復(fù)測定8次，將各測定結(jié)果換算為樣品中的濃度，計(jì)算8次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按HJ 168—2010《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》[30]計(jì)算方法檢出限，測定下限為4倍檢出限。置信度為99%時(shí)的t值為2.998。

MDL=t(n-1,0.99)×S

式(1)

式中：MDL ——方法檢出限；n——樣品的平行測定次數(shù)；t——自由度為n-1，置信度為99%時(shí)的t分布(單側(cè))；S——n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品pH對氨氮測定的影響

現(xiàn)場采集水樣后，為保證樣品的穩(wěn)定，通常在水樣中加硫酸調(diào)節(jié)pH小于2[27-28]。pH計(jì)能準(zhǔn)確測定水樣的pH，但不方便攜帶。pH試紙方便攜帶，但檢測精度較低。為評估現(xiàn)場采樣時(shí)是否可使用pH試紙進(jìn)行替代，加酸調(diào)節(jié)水樣的pH，探究在4 ℃避光條件下，不同pH對實(shí)際樣品氨氮檢測結(jié)果的影響，結(jié)果如圖1。連續(xù)10 d pH為1、2和3的樣品中氨氮平均含量分別為0.46、0.47和0.47 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為 0.4%～0.8%。結(jié)果表明水樣在pH為1～3之間時(shí)，氨氮結(jié)果無顯著相關(guān)性。因此，在現(xiàn)場采樣加酸測定時(shí)，水樣pH在1～3范圍內(nèi)均可，無需精確調(diào)節(jié)pH，可使用pH試紙進(jìn)行測定。

圖1 不同pH對樣品的氨氮含量影響Fig.1 Influences of different pH values on ammonia nitrogen content of samples

2.2 樣品運(yùn)輸過程對氨氮測定的影響

將樣品置于常溫環(huán)境(24±5)℃中模擬運(yùn)輸狀態(tài)，探究常溫狀態(tài)下16 h內(nèi)樣品氨氮含量變化。由圖2可知，常溫樣中氨氮含量變化整體上呈現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢。16 h氨氮含量的總波動范圍為：3.04～3.34 mg/L，前6 h內(nèi)氨氮含量的波動范圍為：3.21～3.34 mg/L，波動小，而6 h后的波動范圍為：3.04～3.21 mg/L，波動相對較大且均分布在0 h氨氮測定值下方呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。說明氨氮樣品常溫運(yùn)輸6小時(shí)以內(nèi)，樣品氨氮測定準(zhǔn)確度較高。常溫樣品氨氮含量變化的原因可能是樣品加酸后，大部分微生物快速死亡，只有少量耐酸性硝化細(xì)菌存活，并利用水溶氧分解氨氮，使氨氮含量下降[31-32]；隨著耐酸性硝化細(xì)菌繁殖速率的降低，同時(shí)因代謝物積累產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)且抑制了其生長，氨氮含量逐漸趨于平穩(wěn)。因此，長時(shí)間常溫運(yùn)輸會影響樣品中的氨氮含量，當(dāng)運(yùn)輸時(shí)間超過6 h時(shí)，使用冷藏運(yùn)輸(0～4 ℃)來穩(wěn)定氨氮含量，可提高氨氮測量準(zhǔn)確性。

圖2 模擬常溫運(yùn)輸水樣中氨氮含量變化Fig.2 Changes in ammonia nitrogen content of water samples in the simulated state of room temperature transportion

2.3 樣品貯存溫度對氨氮測定的影響

比較了冷藏4 ℃和常溫(24±5)℃兩種貯存條件下，10 d內(nèi)水樣的氨氮含量變化。由圖3可知，10 d內(nèi)常溫樣和冷藏樣標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4%和1%，即冷藏樣相對比較穩(wěn)定。常溫樣氨氮含量整體呈上升趨勢，而冷藏樣氨氮含量相對穩(wěn)定。常溫下漁業(yè)水質(zhì)中氨氮濃度下降原因可能是樣品中微生物活性高，一開始溶氧量高，好氧性硝化細(xì)菌分解氨氮產(chǎn)生硝酸鹽與亞硝酸鹽，導(dǎo)致氨氮含量降低[33]；之后氨氮濃度上升，原因可能是隨著氧氣濃度下降，反硝化細(xì)菌等微生物利用含氮有機(jī)物合成氨氮，導(dǎo)致氨氮含量升高[34]，當(dāng)樣品中氧氣耗盡后，反硝化細(xì)菌生長更為迅速，樣品中的氨氮呈現(xiàn)不斷上升狀態(tài)，直到含氮有機(jī)物消耗完。而在冷藏時(shí)，低溫抑制了硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌對氨氮的活性作用，所以水樣中的氨氮含量相對穩(wěn)定。因此建議對樣品進(jìn)行冷藏貯存，在4 ℃下可以保存10 d。

圖3 樣品在常溫與冷藏狀態(tài)下10 d內(nèi)的氨氮含量變化Fig.3 Changes of ammonia nitrogen content of water samples in 10 days at room temperature and refrigeration

2.4 水樣均勻性對氨氮測定的影響

取4 ℃冷藏1 d的水樣下層液、上層液及搖勻液，分別測定其氨氮含量，探究水樣均勻性對氨氮測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上層液、下層液以及搖勻液的氨氮含量平均值分別為：7.99、10.50和9.39 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.01%、0.50%以及0.77%。對上層液、下層液分別與搖勻液進(jìn)行t-檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上層液與搖勻液氨氮含量差異顯著(P<0.01)，下層液與搖勻液氨氮含量也差異顯著(P<0.01)。原因是低溫靜置導(dǎo)致吸附有氨氮的雜質(zhì)(如懸浮物、生物絮團(tuán))發(fā)生物理性沉降，使得樣品中氨氮不均一。因此測定水樣前，需對樣品進(jìn)行充分搖勻，以確保樣品的均勻性。

2.5 過濾對氨氮測定的影響

在分析測定時(shí)，減少樣品基質(zhì)含量通?？梢蕴岣邫z測的靈敏度與準(zhǔn)確度。對于水樣，過濾是一種簡單、高效及易操作的去除基質(zhì)的方法。選用多個品牌的12種濾紙(6種定性濾紙、5種定量濾紙以及1種玻璃微纖維濾紙)進(jìn)行過濾實(shí)驗(yàn)，探究過濾對氨氮測定的影響，結(jié)果見表1。5種定量濾紙過濾標(biāo)樣前后的氨氮含量的相對誤差范圍為-79%～-5%，說明定量濾紙對氨氮存在一定的吸附作用，與濾紙品牌及速率無直接關(guān)系。6種不同型號的定性濾紙過濾標(biāo)樣前后的氨氮含量的相對誤差范圍為-67%～18%，說明定性濾紙對氨氮有的存在吸附作用，有的存在釋放氨氮作用，與速率無直接關(guān)系。而使用玻璃微纖維濾紙過濾后發(fā)現(xiàn)未測出氨氮含量，說明玻璃微纖維濾紙對氨氮存在較強(qiáng)吸附能力。鑒于氣相分子吸收光譜是通過將樣品氣化后檢測的[35]，對于無大顆粒的復(fù)雜水樣也能準(zhǔn)確測定，因此不建議進(jìn)行過濾操作，可直接測定。

表1 12種濾紙過濾1 mg/L氨氮標(biāo)樣后的氨氮含量Tab.1 Ammonia nitrogen content after filtering 1 mg/L standard sample with 12 kinds of filter paper n=3

2.6 方法的線性范圍與檢出限

2.6.1 方法的線性關(guān)系與線性范圍

采用自動稀釋法配制濃度分別為0、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4)。氨氮在0.1～2.0 mg/L范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r>0.999 9，曲線方程為：y=0.221 242x+0.002 250。結(jié)果表明該方法線性良好。

圖4 氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Ammonia nitrogen standard curve

2.6.2 檢出限與測定下限

對配制0.03 mg/L的氨氮樣品連續(xù)測定8次的結(jié)果計(jì)算得出方法檢出限MDL為0.003 3 mg/L，測定下限為0.013 mg/L。

2.7 方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性

2.7.1 水質(zhì)氨氮環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測

對氨氮含量分別為(1.49±0.06)mg/L以及(2.02±0.12)mg/L的水質(zhì)氨氮環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)樣品(批號分別為2005120、2015122)進(jìn)行測定，連續(xù)測定6次，測得平均值分別為(1.49±0.02)mg/L和(1.99±0.01)mg/L，相對誤差分別為0和1.49%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。

2.7.2 實(shí)際樣品的檢測

采集淡水和海水樣品，在本實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行檢測及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。淡水和海水在兩實(shí)驗(yàn)室的相對偏差為3.6%和7.4%，兩實(shí)驗(yàn)室對不同基質(zhì)的水樣測定的回收率范圍為90%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.36%～3.26%，說明該方法的重現(xiàn)性良好。因此，該方法可用于漁業(yè)水質(zhì)中氨氮的測定，滿足實(shí)際檢測的需求。

表2 漁業(yè)水質(zhì)淡水和海水3個濃度水平的回收率和重現(xiàn)性Tab.2 Recovery and reproducibility of fresh water and sea water at three concentration levels n=6

2.8 實(shí)際樣品測定及風(fēng)險(xiǎn)評估

采用本方法對隨機(jī)采集的漁業(yè)水源水、淡水以及海水進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其氨氮濃度分別為：3.23、0.57 和1.77 mg/L。漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定漁業(yè)水質(zhì)中氨氮的濃度不得超過0.02 mg/L，隨機(jī)采集的幾種漁業(yè)水質(zhì)均存在不同程度的氨氮含量超標(biāo)。因此，作為漁業(yè)水質(zhì)的重要指標(biāo)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中建議重點(diǎn)關(guān)注并做好風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。

3 結(jié)論

本研究對氨氮樣品pH、運(yùn)輸溫度、貯存溫度、貯存時(shí)間等貯藏條件和樣品前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，建立了氣相分子吸收光譜儀測定漁業(yè)水質(zhì)中氨氮的方法。樣品采集于棕色磨砂玻璃瓶中，調(diào)節(jié)pH為1～3，6 h內(nèi)可常溫運(yùn)輸，水樣4 ℃冷藏10 d測定仍準(zhǔn)確有效。樣品經(jīng)搖勻后，直接使用氣相分子吸收光譜儀測定，外標(biāo)法定量。該方法優(yōu)化了從采樣、送樣、存樣及制樣到上機(jī)測定整個漁業(yè)水質(zhì)氨氮采集測定過程，沒有使用氯化汞、三氯甲烷等危害人體健康的殺菌劑，減小了樣品中的氨氮含量波動，提高了測定的準(zhǔn)確性。同時(shí)，該方法簡單高效、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可在不同地域?qū)嶒?yàn)室或檢測機(jī)構(gòu)推廣用于漁業(yè)水質(zhì)測定。利用該方法對隨機(jī)采集的漁業(yè)水源水、養(yǎng)殖淡水以及海水進(jìn)行測定，樣品平均濃度分別為：3.23、0.57及1.77 mg/L，均超過了漁業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.02 mg/L，因此，作為漁業(yè)水質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，建議在漁業(yè)養(yǎng)殖中做好氨氮的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控及漁業(yè)水生態(tài)保護(hù)。