錢偉東，溫小慶，張 雪，張翠羽，于泓漪，邵 廣，鄒云福，張洪友，夏 成*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.安達市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江 安達 151400；3.綏化市裕達牧業(yè)有限公司，黑龍江 綏化 152000；4.安達市澳森牧業(yè)有限公司，黑龍江 安達 151400）

泌乳初期的高產(chǎn)奶牛攝入的營養(yǎng)物質(zhì)多被用來供應泌乳需求，因此奶牛機體本身普遍處于能量負平衡狀態(tài)，各種微量元素消耗則隨之增大[1]。維生素E（VE）參與機體營養(yǎng)調(diào)控，在奶牛養(yǎng)殖中扮演重要角色。奶牛在泌乳時，VE 是必需的脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)、主要的抗氧化劑，能緩解細胞氧化應激，對奶牛的繁殖、免疫等都具有重要的作用。

牛場通常會在奶牛日糧中添加VE 以補充VE缺乏，但高產(chǎn)奶牛泌乳早期VE 亞臨床缺乏現(xiàn)象仍然普遍。代謝組學可通過定性和定量分析機體內(nèi)所有代謝物，對研究生物體系整體變化非常有效[2-3]。核磁共振（nuclearmagnetic resonance，NMR）技術(shù)應用比較方便，樣品不需復雜處理，又不會破壞樣品的原有組成，具有無偏向性等優(yōu)點，是最能反應生物體自身代謝物變化的一項技術(shù)[4-5]。本試驗采用核磁共振氫譜（1H-NMR）技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析進行分析，目的是獲得與VE 亞臨床缺乏關(guān)系密切的差異代謝物，探究泌乳早期高產(chǎn)奶牛VE 亞臨床缺乏的代謝物變化，為奶牛VE 營養(yǎng)需要和缺乏的新機制以及奶牛VE 亞臨床缺乏癥的監(jiān)測與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

試驗在綏化市某集約化牛場進行，隨機選取產(chǎn)后30 d內(nèi)，體況、胎次、年齡相近的健康經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛為試驗動物，檢測血漿VE 濃度結(jié)合血液生化指標及患病信息，確定對照組（VE含量為4 μg·mL-1以上）和VE亞臨床缺乏組（VE含量為2～3 μg·mL-1）[6-7]，每組14 頭，組內(nèi)能量代謝、肝功、維生素含量、氧化應激等指標無差異。

從奶牛分娩至產(chǎn)后第30 天，奶牛飼喂TMR 全混合日糧，每天投料3 次。TMR 日糧組成：青貯25.37 kg，水5.47 kg，高產(chǎn)濃縮料4.09 kg，苜蓿2.50 kg，壓片玉米2.00 kg，大豆皮1.50 kg，豆粕1.30 kg，籽1.03 kg，燕麥草0.50 kg，糖蜜1.00 kg，玉米3.00 kg，利乳寶1.20 kg。

牛場采用阿菲金管理軟件（Afimilk?3.076，以色列）收集試驗奶牛的基本信息（年齡、胎次、體況）等。

1.2 主要儀器

全自動生化分析儀（HITACHI 7170）、-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Scientific）、超速離心機（Thermo Multifuge X3R）、多功能酶標儀（光柵型，Tecan Infinite?200 Pro,M200 PRO,Austria）、低速離心機（型號為TDL80-2B），上海安亭科學儀器公司提供。

1.3 血液樣品采集

清晨空腹采集奶牛的尾靜脈血液，每頭牛采集20 mL，分裝在10 mL 肝素鈉抗凝管中，在4 ℃條件下3 000 r·min-1離心10 min，取上清液進行二次離心。將分離的血漿上清液置于1.5 mL 離心管中，再進行5 min 高速（12 000 r·min-1）離心，將上清液置于1.5 mL離心管中，于-80 ℃凍存，待測。

1.4 生化指標檢測

能量代謝：β-羥丁酸（BHBA）采用雙抗體夾心法測定，游離脂肪酸（NEFA）采用分光光度法測定，血漿中葡萄糖（Glu）采用改良氧化酶法測定。

脂質(zhì)代謝：采用自動生化分析儀檢測總膽固醇（TG，比色法）、高密度脂蛋白（HDL，直接法，即兩點終點法）、低密度脂蛋白（LDL，直接法即兩點終點法）等生化指標；采用高效液相色譜法檢測VE、VA 和VC。自動生化分析儀檢測所用試劑盒為上海爾丙生物科技有限公司產(chǎn)品。

氧化應激：生化分析儀分析總超氧化物歧化酶（T-SOD，比色法）、總抗氧化能力（T-AOC，微量法）、丙二醛（MDA，微量法）、過氧化氫酶（CAT，比色法）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，比色法）。

肝功：生化分析儀分析谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，速率法）、白蛋白（ALB，比色法）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，速率法）。

1.5 1H-NMR 檢測

室溫下解凍血漿樣本200 μL，置于1.5 mLEP管中，并加入400 μL緩沖液（45 mmol·L-1NaH2PO4/K2HPO4，50% D2O，0.9% NaCl；pH 值為 7.4），混勻之后4 ℃下16 099 r·min-1離心10 min，將550 μL上清液轉(zhuǎn)移至5 mm 核磁管待檢。使用1H 共振頻率599.93 MHz 的超導核磁共振譜儀（Varian Inova 600 MHz Agilent）。

橫向弛豫加權(quán)試驗：用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gil（lCPMG）序列（弛豫延遲2.0 s，采集時間1.5 s，溫度25 ℃，譜寬12 000.0 Hz），總回波時間100 ms，累加次數(shù)64次。

1.6 1H-NMR圖譜數(shù)據(jù)處理

通過傅立葉變換、基線校正等處理圖譜，采用Mestrenova 軟件（V9.0.1）。為提高信噪比，譜圖乘上增寬因子為1 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進行傅立葉變換。

譜圖處理過程相關(guān)系數(shù)：血液核共振譜圖（積分區(qū)間0.6～9 ppm，積分間距0.002 ppm，去掉包含殘余的水峰及其影響的區(qū)域5.601～6.400 ppm）。

1.7 多元統(tǒng)計分析

使用 SIMCA V 15.0 軟件（MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden）對數(shù)據(jù)進行UV 格式化處理，然后進行自動建模分析。在獲得整理好的數(shù)據(jù)之后，先進行主成分分析（PCA）。PCA可以揭示數(shù)據(jù)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好地解釋數(shù)據(jù)變量關(guān)系。能夠提供一幅較低維度的圖像（二維或三維），僅僅通過少量的主成分即可降低數(shù)據(jù)的維度。再將所得結(jié)果采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）的統(tǒng)計方法進一步分析，可以更高效地區(qū)分組間差異情況。結(jié)合這兩種方法可提高模型的有效性和解釋性，更加完善了分組效果，且代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量被過濾掉（并對非正交變量和正交變量分別分析），進而確保代謝物的組間差異和使試驗組的相關(guān)程度信息相對可靠[8-9]。

1.8 篩選差異表達代謝物

對得到的積分段所代表的代謝物進行確定不同組間差異性代謝成分（OPLS-DA）。根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)確定相關(guān)系數(shù)（r）。通過數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換（每一個變量的標準偏差的平方根值與其Loading值相乘），再比對相應的相關(guān)系數(shù)臨界值，最后得到差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶?；拘畔⒓把荷笜?/h3>

VE 亞臨床缺乏組奶牛與對照組奶牛相比血漿中 NEFA（P=0.017）和 LDL（P=0.004）水平顯著升高，MDA（P=0.01）水平顯著降低，T-AOC（P=0）和HDL（P=0.004）的水平顯著升高，見表1。

表1 試驗?；拘畔⒓把荷笜耍ㄆ骄怠罉藴什睿?/p>

2.2 血漿1H-NMR譜圖

試驗奶牛血漿樣本具有代表性的1H-NMR圖譜見圖1。與0.5～6.0 ppm內(nèi)區(qū)域相比，將6.5～9.5 ppm的區(qū)域放大了32倍，以便清楚觀察。

圖1 500 MHz條件下VE缺乏組和對照組組奶牛1H-NMR典型譜圖

2.3 PLS-DA和OPLS-DA模型驗證結(jié)果

PCA 分析結(jié)果見圖2（A），顯示出兩組樣品存在一定的分離趨勢。為更加清楚準確的研究兩組奶牛代謝組差異。對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA 分析（使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行分析），結(jié)果見圖2（B），VE亞臨床缺乏組和對照組奶牛明顯分開，說明兩組間差異顯著。OPLS-DA 模型的置換檢驗結(jié)果見圖2（C），R2余Q2均接近1。說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況（原模型可以很好地詮釋兩組樣本間的差異）。

圖2 PLS-DA和OPLS-DA 模型驗證結(jié)果

血漿載荷見圖3，能準確描述組間差異代謝物的上調(diào)下調(diào)情況，預示著VE亞臨床缺乏使奶牛體內(nèi)發(fā)生了明顯變化。

圖3 VE亞臨床缺乏組與對照組的OPLS-DA載荷圖

2.4 差異代謝物的篩選

通過單變量分析和多元統(tǒng)計分析，最終篩選出差異代謝物25種，見表2。

表2 血漿中差異代謝物一覽表

3 討 論

當前核磁共振技術(shù)應用于奶牛體液差異代謝物譜分析十分廣泛，但是國內(nèi)外應用此技術(shù)對奶牛VE亞臨床缺乏的研究還未見報道。

本試驗本著采用成熟的領(lǐng)先技術(shù)來解決獸醫(yī)臨床上重點問題的原則，得到了健康奶牛和VE 亞臨床缺乏奶牛全景的代謝圖譜，力求全面描述發(fā)生VE 亞臨床缺乏奶牛體內(nèi)的代謝物變化。試驗奶牛血液生化指標結(jié)果表明，VE 亞臨床缺乏組奶牛血清中NEFA 和BHBA 的濃度均高于對照組，NEFA濃度顯著高于對照組；VE亞臨床缺乏組血清中T-AOC 濃度極顯著低于對照組，MDA 濃度顯著高于對照組；VE亞臨床缺乏組血清中HDL極顯著低于對照組，LDL含量極顯著高于對照組。這些結(jié)果表明VE 亞臨床缺乏組奶牛機體處于能量負平衡狀態(tài)，機體脂質(zhì)代謝增強，發(fā)生代謝應激。

同樣的，基于1H-NMR 技術(shù)的VE 亞臨床缺乏奶牛血清代謝組學中給出具體脂類、氨基酸或糖類代表性的指標高低變化，也證實了臨床生化結(jié)果。而且，VE 亞臨床缺乏奶牛差異代謝物主要參與的代謝途徑：氨?；?tRNA 的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氮代謝，糖酵解或糖異生，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，這些主要的富集通路提示VE 亞臨床缺乏對奶牛脂質(zhì)代謝、氧化應激等方面產(chǎn)生了明顯的影響。

磷脂酰膽堿（DLPC）在細胞結(jié)構(gòu)和活性中起重要作用，有助于脂蛋白的合成與分泌及膽固醇溶解在膽汁中[10-11]。DLPC 是VLDL 的主要組成成分，在VLDL的分泌過程中，其生物合成起至關(guān)重要的作用，并會增加花生四烯酸和亞油酸的生成[12]。VLDL 主要由肝臟合成，其功能主要是將肝臟中的脂類物質(zhì)、VE 等運輸?shù)窖汗┙M織利用。機體多種器官或組織（腎上腺皮質(zhì)、卵巢、睪丸及肝臟細胞）細胞表面均有低密度脂蛋白受體（LDLR）。血液中LDL與組織表面的LDLR結(jié)合形成復合物，通過胞吞進入細胞釋放VE，供細胞利用[13]。

膽堿（ACh）在維護細胞膜信號傳導和結(jié)構(gòu)完整性方面至關(guān)重要，是維持膽堿能神經(jīng)正常傳遞和肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的重要物質(zhì)[14]，在體內(nèi)由絲氨酸和蛋氨酸合成。丙酮和3-羥基丁酸都屬于酮體，是脂肪酸在肝臟內(nèi)正常代謝的中間產(chǎn)物且可通過血腦屏障及肌肉毛細血管壁，是重要的能源，用于肌肉和腦組織代謝[15-16]。VE亞臨床缺乏組奶牛磷酸膽堿、LDL、VLDL、膽堿、丙酮、絲氨酸的上調(diào)，表明機體脂質(zhì)代謝和亞油酸合成增加，磷脂酰乙醇胺與磷脂酰膽堿的生物合成過程增強，這說明VE 亞臨床缺乏的奶牛存在能量負平衡，體內(nèi)相應脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會隨著脂質(zhì)代謝加強而增多，致使機體產(chǎn)生氧化應激，消耗更多VE。

本研究篩選到的差異代謝物中，有11 種氨基酸在VE 亞臨床缺乏組與對照組對比均呈上調(diào)，差異代謝物富集的氨基酸代謝通路較多。丙酮酸通過轉(zhuǎn)氨基作用，首先生成丙氨酸再轉(zhuǎn)化成亮氨酸和纈氨酸。也可為賴氨酸和異亮氨酸等氨基酸提供部分碳骨架。丙氨酸是由碳水化合物丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化而成的非必需氨基酸[17]，或由二肽肌肽、鵝肌肽和DNA 分解而來，是肌肉釋放的較為重要的氨基酸之一，高度集中在肌肉中，是主要的能量來源[18]。三羧酸循環(huán)（TCA）中α-酮戊二酸氨基化后衍生為谷氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺。谷氨酰胺可影響肝臟糖異生[19]，通過調(diào)節(jié)磷酸烯醇丙酮酸的轉(zhuǎn)錄水平或活性，進而增強機體的抗氧化性能力[20]。谷氨酰胺是血漿中最豐富的游離氨基酸，是谷胱甘肽和谷氨酸合成的前體物質(zhì)[21]，谷胱甘肽能夠保護細胞免受自由基損傷，是重要的抗氧化劑[22]。谷氨酰胺在VE 缺乏組奶牛體內(nèi)升高，表明谷胱甘肽和蛋白質(zhì)分解代謝增強，導致谷胱甘肽合成不足，對機體易造成氧化損傷。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的代謝最終產(chǎn)物。亮氨酸和異亮氨酸有助于調(diào)節(jié)血糖水平、修復肌肉、提高生長激素的含量，幫助燃燒內(nèi)臟脂肪。磷酸肌酸大多儲存在肌組織，是能量儲備的重要化合物[23]。本試驗中，VE 亞臨床缺乏組奶牛血漿中肌酐含量上升，提示VE亞臨床缺奶牛可能通過加強磷酸肌酸代謝來緩解自身能量負平衡狀態(tài)。

4 結(jié) 論

通過1H-NMR血漿代謝組學分析以及多元統(tǒng)計分析等后期數(shù)據(jù)處理分析后，獲得了血漿差異代謝物近30種，結(jié)果表明，奶牛發(fā)生VE亞臨床缺乏造成機體代謝的諸多途徑均發(fā)生了改變，影響的主要代謝通路有：氮代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-谷氨酰胺代謝，糖酵解或糖異生，丙酮酸代謝，檸檬酸鹽循環(huán)（TCA循環(huán)）和谷胱甘肽代謝等。表明VE 的缺乏會增強糖異生、糖酵解和各種脂質(zhì)代謝，提示奶牛泌乳早期容易發(fā)生能量負平衡，此時機體為了補充能量，調(diào)動其他生糖途徑，代償性增強脂質(zhì)動員。VE 亞臨床缺乏組奶牛伴隨著更為嚴重的代謝應激，機體氧化應激加劇后反過來又會促使VE消耗增加，造成機體能量代謝的惡性循環(huán)。