高婧昕，李天歌，郭凱睿，毛學(xué)英

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 教育部北京市共建功能乳品重點實驗室食品精準營養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點實驗室 北京 100083）

蛋白質(zhì)是機體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，主要以氨基酸和肽的形式被機體吸收利用，相比于游離氨基酸，肽的吸收轉(zhuǎn)運快、耗能低且利用率高[1]。生物活性肽是源自蛋白質(zhì)的功能活性片段，通常具有2～20 個氨基酸[2]。乳蛋白是制備生物活性肽的優(yōu)質(zhì)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)乳蛋白肽具有降血壓、抗氧化、抑菌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[3-6]。其中，免疫調(diào)節(jié)肽能激活機體細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，提高機體抵抗病原物質(zhì)感染的能力[7]。O'Sullivan 等[6]發(fā)現(xiàn)酪蛋白酶解物能顯著降低Jurkat T細胞和RAW264.7 巨噬細胞中炎癥因子白介素-6的產(chǎn)生并抑制炎癥相關(guān)信號通路的表達。

目前制備生物活性肽的主要方法是酶解，然而酶解法制備的生物活性肽往往有不同程度的苦味，制約了其工業(yè)化應(yīng)用。多肽的苦味與肽鏈中疏水性氨基酸殘基的位置、含量和類型密切相關(guān)，大多數(shù)苦味肽的肽鏈末端帶有疏水性氨基酸，蛋白酶解物中暴露的疏水性氨基酸殘基越多，苦味越重[8]。改善乳蛋白酶解物風(fēng)味是亟待解決的技術(shù)關(guān)鍵。Chesion 等[9]將乳清蛋白酶解，通過大孔吸附樹脂分離其中的苦味成分，造成蛋白酶解物營養(yǎng)價值降低。利用外肽酶酶切肽鏈末端的疏水性氨基酸也能有效去除苦味[10]，然而目前尚無可廣泛用于食品工業(yè)的外肽酶。微囊化技術(shù)通過包裹多肽掩蓋其苦味。Sarabandi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)采用微膠囊技術(shù)雖可降低酪蛋白酶解物的苦味，但在一定程度抑制了其生物學(xué)活性。此外，美拉德反應(yīng)對蛋白酶解物的風(fēng)味也有改善效果[12]，然而美拉德反應(yīng)改變酶解物的色澤，其產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物是許多疾病的誘發(fā)因素[13]，對食品安全構(gòu)成隱患。近年來，乳酸菌因有益作用而受到關(guān)注。乳酸菌具有豐富的酶系，有些可產(chǎn)生外肽酶。然而，國內(nèi)外用乳酸菌改善蛋白酶解物的風(fēng)味鮮有研究。

本研究采用蛋白酶酶解-乳酸菌發(fā)酵聯(lián)合處理制備乳清蛋白酶解物，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對乳清蛋白酶解物經(jīng)乳酸菌發(fā)酵前、后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析和鑒定。利用小鼠脾淋巴細胞模型評價乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性，為乳清蛋白酶解物的工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白濃縮物（Hilmar，WPC-8200），北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司；中性蛋白酶（0.8 AU/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；YO-MIX 300 發(fā)酵劑（由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌組成），丹尼斯克有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素，美國Invitrogen 公司；紅細胞裂解液、噻唑蘭 （Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；刀豆蛋白A （Concanavalin A，ConA），美國Sigma 公司；其余試劑均為分析純級，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP5002 型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；JJ-1 型精密定時電動攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DK-8D 型電熱恒溫水浴槽，上海一恒科技有限公司；LGJ-12 型真空冷凍干燥機，北京松原華興科技儀器有限公司；MCO-17AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋公司；FE20 型pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LC-15C 型高效液相色譜，日本島津公司；ZDX35BI 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；iMarkTM 酶標儀，美國伯樂公司；7890B-5977B 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白酶解物及其發(fā)酵產(chǎn)物的制備 稱取一定質(zhì)量乳清蛋白，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的乳清蛋白溶液，加入質(zhì)量分數(shù)5%中性蛋白酶（與底物比），在55 ℃、pH 7.0 條件下酶解3 h。酶解結(jié)束時在85 ℃條件下加熱20 min 滅酶，冷凍干燥得到乳清蛋白酶解物。

將滅酶后未凍干的乳清蛋白酶解物于超凈臺內(nèi)分裝至無菌試管中（10 mL/管），接入質(zhì)量分數(shù)5% YO-MIX 300 發(fā)酵劑（與底物比）發(fā)酵3 h，冷凍干燥后即為乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography and mass spectrometry，GCMS）進行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測，參照Zhao 等[14]的方法并略作修改。

稱取質(zhì)量約為12 g 未經(jīng)冷凍干燥的樣品放入樣品瓶中，于55 ℃水浴鍋中平衡20 min，然后頂空吸附40 min 進行固相微萃取。

色譜條件為：石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，載氣（He）流速1.0 mL/min，以1∶5 分流進樣。程序升溫的初始溫度40 ℃保持5 min；以3 ℃/min 升溫到110 ℃，保持10 min；再以4 ℃/min 升溫到150 ℃，保持10 min；最后以10 ℃/min 升溫到210 ℃，保持15 min。

質(zhì)譜條件為：四極桿質(zhì)譜儀，檢測器溫度為280 ℃，電子轟擊離子源，電子能量為70 eV，電子倍增電壓為1 353 V，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

采用Agilent GC-MS 色譜工作站軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3 脾淋巴細胞增殖活性測定 參照Mao 等[15]的方法并略作修改。將小鼠處死取脾制成2×106個/mL 的脾細胞懸液，加入到96 孔板中。加樣方式如下：

1）陰性對照 100 μL 脾細胞懸液+20 μL 磷酸鹽緩沖液

2）陽性對照 100 μL 脾細胞懸 液+10 μL ConA 溶液（5 μg/mL）+10 μL 磷酸鹽緩沖液

3）試驗組 100 μL 脾細胞懸液+10 μL ConA溶液（5 μg/mL）+10 μL 樣品

試驗孔均設(shè)5 個重復(fù)，混合均勻后將96 孔細胞培養(yǎng)板放入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，之后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄去上清液，將每孔加入200 μL DMSO，搖床孵育10 min，檢測波長570 nm 處的OD 值。用刺激指數(shù)來表示免疫調(diào)節(jié)活性，刺激指數(shù)值越大表明免疫調(diào)節(jié)活性越強，計算公式為：

1.3.4 分子質(zhì)量分布測定 采用高效液相色譜法進行測定[16]。將乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物配置成2 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 過濾器過濾。檢測條件：流動相A 為體積分數(shù)0.1%的冰醋酸溶液，流動相B 為含有體積分數(shù)0.1%冰醋酸的乙酸，A 相與B 相的比例為55∶45；流速為0.5 mL/min；進樣量為25 μL；檢測波長為214 nm；柱溫為40 ℃；色譜柱型號為TSK 凝膠G2000 SWXL 柱（7.8 mm×300 mm，0.5 μm）。以細胞色素c、抑肽酶、胰島素氧化B 鏈、桿菌肽、Trp-Pro-Trp-Trp、Asn-Cys-Ser、Gly-Sar 為標準品制作校準曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

除特別說明外，結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05 時為差異性顯著；用GraphPad Prism 7.00 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)鑒定

乳清蛋白、乳清蛋白酶解物及乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS 總離子色譜圖如圖1所示，共檢測出26 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（表1），主要是酯、醇、酮、酸、酚（圖2）。乳清蛋白中共檢測出10 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類3 種、醇類1 種、酸類2 種、酚類1 種和其它3種，其中酸類物質(zhì)占比最高，相對含量為35.36%；乳清蛋白酶解物中共檢測出14 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類2 種、醇類1 種、酮類4 種、酸類1種、酚類2 種和其它4 種。與乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物中酮類和酚類物質(zhì)的相對含量上升，酸類物質(zhì)的相對含量下降，僅為13.33%。乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物中共檢測出10 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類2 種、醇類1 種、酮類2 種、酸類4 種和其它1 種，與乳清蛋白酶解物相比，乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物中酯類和酸類物質(zhì)的相對含量升高，酮類和酚類物質(zhì)的相對含量下降。由以上結(jié)果可以看出乳清蛋白、乳清蛋白酶解物以及乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物，無論是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類還是數(shù)量都存在明顯差異。

表1 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Volatile flavor compounds in whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

圖1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS 總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds

圖2 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量Fig.2 Relative content of volatile flavor compounds in whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

酯類物質(zhì)通常具有芳香氣味，雖然乳清蛋白及其酶解物的酯類物質(zhì)相對含量差異不大，但種類不同，具有香甜味的肉豆蔻酸甲酯在酶解后消失，可能會造成體系香甜味減弱。醇類物質(zhì)通常具有芳香、植物香以及酸敗等氣味[17]，閾值較高，本研究中鑒定出的醇類物質(zhì)相對含量較低，對體系整體風(fēng)味的貢獻不大。2-庚酮、2-壬酮等甲基酮類具有令人愉悅的水果味及奶油味，乳清蛋白酶解物中甲基酮類物質(zhì)相對含量較高，因此，酶解導(dǎo)致的風(fēng)味變化并不全是負面的。酸類是乳清蛋白中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酶解后酸類物質(zhì)的相對含量下降。乳清蛋白酶解物中酚類物質(zhì)的相對含量高于乳清蛋白，6-姜酚具有不愉快的辛辣氣味[18]，可能會帶來腥味。此外，乳清蛋白酶解物中還產(chǎn)生了苯并噻唑，其氣味類似于喹啉，可能是長時間加熱酶解及高溫滅酶時發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物[19]。綜上所述，酶解后出現(xiàn)的不良風(fēng)味可能是不同酯、酮、酸、酚等多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

乳清蛋白酶解物經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后酸類物質(zhì)的相對含量提高，種類也更豐富，這是發(fā)酵過程中乳酸菌代謝作用的結(jié)果[20]。正癸酸是構(gòu)成酸乳主體風(fēng)味的物質(zhì)之一[21]，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后乳清蛋白酶解物中產(chǎn)生了正癸酸，相對含量為9.20%，會給體系帶來類似酸乳的良好風(fēng)味；發(fā)酵后產(chǎn)生的月桂酸有清香味，也會對體系的整體風(fēng)味起積極作用。曾少葵等[22]發(fā)現(xiàn)嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵的羅非魚下腳料酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味成分增加了酯類、辛酸及十六醛等，酶解液腥味減弱。大豆分離蛋白經(jīng)瑞士乳桿菌發(fā)酵后苦味和腥味也減弱[23]。本研究所用發(fā)酵劑由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌組成，在酶解乳清蛋白體系中，這2 種乳酸菌都能產(chǎn)生肽酶進一步水解苦味肽，從而使乳清蛋白酶解物的苦味下降.此外，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)也對酶解物的苦味和腥味有掩蔽作用。因此，乳酸菌發(fā)酵能夠改善乳清蛋白酶解物的風(fēng)味。

2.2 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性

2.2.1 不同質(zhì)量濃度乳清蛋白酶解物對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 不同質(zhì)量濃度乳清蛋白和乳清蛋白酶解物的脾淋巴細胞增殖活性如圖3所示。在0～2 000 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與文獻報道的其它蛋白酶解物的雙向免疫調(diào)節(jié)作用相符[24-25]。與對照組相比（即樣品質(zhì)量濃度為0 μg/mL），乳清蛋白僅在質(zhì)量濃度為62.5 μg/mL 和250 μg/mL 時顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖 （P＜0.05）。乳清蛋白酶解物在質(zhì)量濃度31.25～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)均能顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖，當(dāng)質(zhì)量濃度為250 μg/mL 時，刺激指數(shù)值達到最大值，為1.45±0.06。故本研究選擇

圖3 不同質(zhì)量濃度乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.3 Immunomodulatory activity of whey protein enzyme hydrolysate at different mass concentrations

250 μg/mL 作為后續(xù)酶解物的添加質(zhì)量濃度。

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性對比 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的脾淋巴細胞增殖活性如圖4所示。從圖中可以看出，與乳清蛋白相比，發(fā)酵前、后的乳清蛋白酶解物均能顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖（P＜0.05），且兩者之間沒有顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵未對乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性造成影響。

圖4 乳酸菌發(fā)酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.4 Immunomodulatory activity of whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

2.3 乳酸菌發(fā)酵后乳清蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布

經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后乳清蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布如圖5所示。從圖中可以看出，酶解物中分子質(zhì)量小于0.5，0.5～1，1～2，2～3，3～4，4～5，5～10 ku 和大于10 ku 的多肽分別占11.30%，28.13%，10.79%，15.85%，7.15%，6.41%，15.50%和4.87%。已有研究表明，多肽的分子質(zhì)量范圍在0～3 ku 時免疫調(diào)節(jié)活性更強[26]，而本文中經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的乳清蛋白酶解物中分子質(zhì)量小于3 ku的多肽占66.07%，說明活性肽能從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中有效釋放。

圖5 乳酸菌發(fā)酵后乳清蛋白酶解物的分子質(zhì)量分布Fig.5 Molecular weight distribution of whey protein enzyme hydrolysate after lactic acid bacteria fermentation

3 結(jié)論

與乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物的酯類和酸類物質(zhì)相對含量減少，具有腥味等不良氣味的物質(zhì)相對含量增加，而乳酸菌發(fā)酵處理可以增加乳清蛋白酶解物中酸類物質(zhì)的相對含量和種類，給其帶來類似酸乳的良好風(fēng)味，起到改善風(fēng)味的作用。與乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物的免疫調(diào)節(jié)活性顯著升高，且乳酸菌發(fā)酵未對其免疫調(diào)節(jié)活性造成不利影響。研究結(jié)果證明經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理獲得的乳清蛋白酶解物的風(fēng)味得到改善且具有免疫調(diào)節(jié)活性，為其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。