王堯, 田衎, 封躍鵬, 王偉

(生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心環(huán)境標準樣品研究所， 國家環(huán)境保護污染物計量和標準樣品研究重點實驗室，北京 100029)

土壤中總有機碳(TOC)是指土壤中與有機質(zhì)相關(guān)的碳元素總稱，是土壤理化性質(zhì)重要指標之一，主要用于指示土壤中有機質(zhì)含量。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有機碳不僅在全球碳平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其含量與土壤全氮、陽離子交換量、pH值等土壤理化性質(zhì)之間也具有相關(guān)性，而且還對有機污染物特別是多環(huán)芳烴(PAHs)在土壤中的遷移和吸附有重要影響[1-5]。土壤中總有機碳被認為是既能定量又能定性反映土壤信息的綜合性參數(shù)，因此被廣泛應(yīng)用于土壤狀況的測定與評估[3,6]。而土壤中總有機碳標準樣品作為配套土壤中總有機碳測定標準方法的實物標準，可有效保證土壤總有機碳監(jiān)測數(shù)據(jù)的質(zhì)量，對于客觀評價土壤健康水平、優(yōu)化土壤質(zhì)量管理等工作具有重要意義[7-8]。

表1列出了國內(nèi)外主要的土壤中有機碳標準樣品研究機構(gòu)，以及所開發(fā)樣品的主要信息。國外對土壤中有機碳的研究始于20世紀60年代。為滿足對土壤有機碳存量等相關(guān)研究的需要，歐盟標準樣品和測量研究所(IRMM)、美國RTC公司等國際標準樣品研究機構(gòu)分別針對黏土、砂土等不同質(zhì)地的土壤，陸續(xù)開發(fā)出指標為總碳(TC)或總有機碳(TOC)的土壤標準樣品。這些國外土壤標準樣品中總有機碳的含量范圍介于4.00～60.0mg/g之間(表1)。多年來中國學(xué)者在土壤有機碳儲量、存在形態(tài)、空間分布特征等領(lǐng)域的研究取得了十分豐碩的成果，但對土壤中有機碳標準樣品的研究方面關(guān)注程度較為有限[9-13]。中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所(IGGE)研制的土壤中元素成分分析標準樣品提供了土壤中總碳及有機碳的量值信息，可用于土壤肥力或土壤營養(yǎng)成分的評價等工作，但中國一直未曾推出專門用于土壤中有機碳分析檢測的環(huán)境標準樣品。2021年初，國家地質(zhì)實驗測試中心(NRCG)發(fā)布了土壤碳形態(tài)系列標準樣品(GBW07974～GBW07977)，量值指標包括總碳、有機碳以及重組有機碳。而上述中國土壤樣品進行量值評定時，主要是使用傳統(tǒng)的重鉻酸鉀容量法作為測定土壤中有機碳的分析方法，暫未采用當(dāng)前國際上使用較多的燃燒氧化-非分散紅外法。

表1 國內(nèi)外主要土壤標準樣品中涉及總有機碳的信息

本文在梳理土壤中有機碳檢測技術(shù)發(fā)展趨勢的基礎(chǔ)上，選擇近些年逐漸流行的燃燒氧化-非分散紅外法，以中國有機碳含量較高的農(nóng)用地土壤為原材料，研制了土壤中總有機碳標準樣品，并對樣品量值及不確定度評定方法等進行了研究和討論，為同類指標環(huán)境基體標準樣品的研制提供參考。

1 實驗部分

1.1 分析儀器

總有機碳分析儀(Aurora 1030C + 1030S，美國OI Analytical公司)；X射線熒光光譜儀(Axios PW4400，荷蘭Malvern Panalytical公司)；精密電子天平(AE240，瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 樣品和主要試劑

葡萄糖基準試劑(CAS:50-99-7，美國Sigma-Aldrich公司)；土壤TOC質(zhì)量控制樣品[SQC014-100G，(5210±2280)mg/kg，美國Sigma-Aldrich公司]；土壤成分分析標準樣品(GBW07430，0.97%±0.12%)；鹽酸(MOS級，北京化學(xué)試劑研究所)。

1.3 候選物的采集與制備

考慮到土地功能、管理模式等人為因素對土壤中有機碳的巨大影響，選擇受人為活動影響較少的農(nóng)用地土壤作為土壤標準樣品的候選物[14-16]。鑒于中國土壤標準樣品中有機碳含量普遍偏低，在對中國土壤資源分布調(diào)研的基礎(chǔ)上，確定以腐植質(zhì)層深厚且鈣積層較深的黑鈣土為研究目標，并選定因山地氣溫低導(dǎo)致腐植質(zhì)積累偏高的新疆地區(qū)為樣品采集地。在新疆維吾爾自治區(qū)某牧場采集pH值為8.4的土壤原料樣品，采樣深度為0～20cm，共采集土壤樣品約100kg。

除掉土壤中雜物等非土壤部分，在80℃低溫條件下烘干樣品，使樣品水分含量低于1%。用陶瓷球磨機研磨樣品，研磨后的樣品過100目(150μm)不銹鋼篩[17]，樣品粒度能夠滿足《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》(HJ/T 166—2004)對制樣粒度的要求。收集篩下樣品轉(zhuǎn)移至混勻機中混勻8h，并采用X射線熒光光譜法(XRF)對混勻后樣品進行均勻性初檢。通過均勻性初檢的土壤樣品分裝于40mL棕色玻璃瓶中，每瓶樣品質(zhì)量為30g，共計分裝成品900瓶。以放射線60Co輻照滅菌，使土壤樣品的菌落總數(shù)低于10CFU/g[18]。樣品于室溫下避光儲存。

1.4 樣品分析測試

1.4.1儀器分析條件

檢測模式為固體-總碳(Solids-TC)，樣品注射量0.200mL，系統(tǒng)壓力20psi，排空時間15s，反應(yīng)時間4min，檢測時間3min，反應(yīng)溫度900℃，檢測溫度680℃，樣品杯預(yù)處理時間1.5min，測量方式為標準曲線法。

1.4.2檢測樣品的制備

在鏤空底石英樣品杯中填充少量石英棉，準確稱取干燥后的待測土壤樣品0.1g(精確到0.0001g)于石英樣品杯中，緩慢滴加50%的鹽酸約300μL，覆蓋樣品杯內(nèi)全部樣品。石英樣品杯放入烘箱中120℃烘干2h，去除總無機碳(TIC)。樣品妥善放置，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 測量方法的選擇

土壤中總碳(TC)由總無機碳(TIC)和總有機碳(TOC)組成。土壤中總有機碳的測定原理是通過氧化的方式，將土壤中各種類型的有機碳(OC)轉(zhuǎn)化為可以定量測定的化合物，利用碳元素之間的對應(yīng)關(guān)系計算樣品中有機碳含量。近年來，關(guān)于土壤有機碳測定方法的研究較多，按照測定過程來看，可分為土壤有機碳的氧化和氧化產(chǎn)物的測定兩個步驟。幾種常見的土壤中總有機碳的測定方法歸納于圖1。

圖1 土壤中總有機碳的測定方法Fig.1 Analytical methods of TOC in soil

根據(jù)土壤有機碳氧化方式的不同，可將氧化方法大致分為以下兩種類型：一是使用強氧化劑作為氧化手段的化學(xué)氧化法，即濕法氧化法；二是使用干式燃燒作為氧化手段的高溫氧化法，即燃燒法[3,6,10,19]。濕法氧化法是指在土壤樣品中加入過量的氧化劑，將樣品中的有機碳全部氧化為二氧化碳，然后對氧化產(chǎn)物進行測定，進而換算出有機碳的含量。常用的濕法氧化法有重鉻酸鹽氧化法、過硫酸鹽氧化法、過氧化物氧化法等[20-23]。燃燒法是將土壤樣品置于燃燒爐中，使樣品在高溫下(通常超過900℃)的氧氣流中燃燒，將樣品中的碳元素全部氧化為二氧化碳。燃燒法既可先測定樣品中總碳以及總無機碳，然后通過差減法間接計算出總有機碳含量；也可通過測定加酸并烘干去除總無機碳后的樣品，直接獲得樣品中的總有機碳含量[21-22]。

對樣品氧化后的產(chǎn)物(如：重鉻酸根、二氧化碳等)進行測定，可采用滴定法、比色法、重量法、容量法、光度法、氣相色譜法等多種不同技術(shù)[21-23]。手動滴定法是通過滴定過量的重鉻酸根，然后換算出結(jié)果。比色法是測定溶液中反應(yīng)產(chǎn)生的三價鉻的吸光度，再間接確定指標含量。重量法是根據(jù)吸附裝置在吸收二氧化碳后其質(zhì)量發(fā)生的變化，從而換算出結(jié)果。容量法是通過滴定吸收二氧化碳后過量的氫氧化鋇，進一步計算出有機碳含量。光度法是采用非色散紅外(NDIR)檢測器測定反應(yīng)生成的二氧化碳的量，進而計算碳的含量。氣相色譜法是使用配有熱導(dǎo)檢測器(TCD)的氣相色譜儀測定二氧化碳的量，或?qū)⒍趸嫁D(zhuǎn)化為甲烷后再用氫火焰離子化檢測器(FID)進行測定[3,6,21-22]。

目前，測定土壤中有機碳含量最常用方法是重鉻酸鉀-外加熱氧化法(濕法氧化)和總有機碳分析儀法(高溫燃燒氧化法)，兩種氧化方法各有優(yōu)缺點、適用范圍及局限性[3,10,24]。重鉻酸鉀-外加熱氧化法為測定土壤有機碳的傳統(tǒng)方法，國際上采用該技術(shù)的標準方法為重鉻酸鉀氧化比色法《Soil quality—Determination of organic carbon by sulfochromic oxidation》(ISO 14235—1998)，中國常用的標準方法為《區(qū)域地球化學(xué)樣品分析方法 第27部分：有機碳量測定 重鉻酸鉀容量法》(DZ/T 0279.27—2016)。上述方法對于儀器設(shè)備要求少，成本較低，靈敏度高，不受土壤中碳酸鹽的影響，用于堿性土壤的測定具有一定優(yōu)勢[3,25-26]。但是，重鉻酸鉀-外加熱氧化法存在氧化不完全的缺點，在測定高含量氯離子、亞鐵離子、錳化合物的土壤時，測定結(jié)果會受到影響[27]。而且，該方法在實驗中會消耗大量硫酸和重鉻酸鉀，產(chǎn)生大量廢液，對環(huán)境不夠友好[28-29]。相比之下，采用高溫燃燒氧化法的有機碳分析儀具有更好的穩(wěn)定性，對土壤中以各種形式存在的碳元素的氧化更徹底，實驗測定結(jié)果的回收率較高，樣品前處理工作量小，且不對環(huán)境產(chǎn)生污染。雖然燃燒氧化-非分散紅外法的儀器昂貴且維護費用較高，但綜合考慮其優(yōu)勢，以該方法檢測土壤中有機碳的實驗室越來越多[24,28-29]。采用燃燒法的國際標準方法為《Soil quality—Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)》(ISO 10694—1995)和《Total organic carbon (TOC) in soil》(USEPA SW-846 Test Method 9060A)。中國的同類方法為《土壤有機碳的測定 燃燒氧化-非分散紅外法》(HJ 695—2014)。多篇文獻曾報道關(guān)于燃燒氧化-非分散紅外法與重鉻酸鉀容量法測定結(jié)果之間關(guān)系的研究，并對兩種方法的特點進行了探討，兩種檢測方法的優(yōu)缺點匯總于表2[3,17,25-26]。

表2 土壤中總有機碳測定常用方法的比較

鑒于中國尚未開發(fā)以燃燒氧化-非分散紅外法用于定值的標準樣品，且儀器法通常具有更好的穩(wěn)定性，本研究采用燃燒氧化-非分散紅外法(即總有機碳分析儀法)作為土壤中總有機碳標準樣品均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗等分析測定的方法，采用重鉻酸鉀容量法和燃燒氧化-非分散紅外法兩種方法共同進行標準樣品中總有機碳的協(xié)作定值。

2.2 均勻性檢驗

均勻性用來描述標準樣品的空間分布特征，是表征樣品量值指標一致性的重要參數(shù)。影響土壤樣品均勻性的主要因素有：加工制備過程的混勻程度、研磨后粒徑的均勻程度，以及分裝過程中的潛在影響因素等。由于土壤樣品為粉末顆粒，相比液體樣品其流動性和分散性較差，因此對樣品開展均勻性檢驗顯得十分重要。

根據(jù)《標準樣品工作導(dǎo)則(3) 標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》(GB/T 15000.3—2008)中的方法，采用分層隨機抽樣法，在土壤樣品分裝過程中的前、中、后期隨機抽取10瓶樣品，以燃燒氧化-非分散紅外法檢測標準樣品中總有機碳指標的均勻性，每瓶樣品平行測定2次。土壤中總有機碳標準樣品均勻性檢驗數(shù)據(jù)詳見表3。由表中結(jié)果可見，樣品均勻性實驗的總均值為23.2mg/g，相對標準偏差(RSD)為1.4%。以單因素方差分析法對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和評價[30]。統(tǒng)計量F的計算公式如下：

表3 土壤中總有機碳標準樣品的均勻性檢驗結(jié)果

(1)

式(1)中：MSb為瓶間均方；MSw為瓶內(nèi)均方；SSb為瓶間平方和；vb為瓶間自由度；SSw為瓶內(nèi)平方和；vw為瓶內(nèi)自由度。

F統(tǒng)計量=0.38

2.3 穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性是指在規(guī)定的時間間隔和環(huán)境條件下，標準樣品的特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的性質(zhì)[31]。在18個月穩(wěn)定性檢驗期間，按照前密后疏的原則進行6次抽樣及檢測。每次隨機抽取室溫避光保存的土壤標準樣品3瓶，采用燃燒氧化-非分散紅外法進行測定。每瓶樣品平行測定2次，以3瓶樣品測定值的總平均值作為該時間點穩(wěn)定性檢驗的檢測值。土壤中總有機碳標準樣品穩(wěn)定性檢驗的研究結(jié)果詳見表4。由結(jié)果計算出樣品穩(wěn)定性實驗測定的總有機碳總均值為23.4mg/g。

表4 土壤中總有機碳標準樣品的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

檢測數(shù)據(jù)采用《標準樣品工作導(dǎo)則(3) 標準樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計方法》(GB/T 15000.3—2008)推薦的一元線性擬合模型進行統(tǒng)計檢驗，即假定特性量值變化與儲存時間之間存在線性關(guān)系，通過考察斜率(b1)的顯著性來評價樣品的穩(wěn)定性[32]。斜率b1的計算公式如下：

(2)

斜率的標準偏差s(b1)的計算公式如下：

(3)

采用以上公式計算，b1和s(b1)的結(jié)果分別為0.039和0.016。經(jīng)查表t(0.95,n-2)=2.78，斜率|b1|小于t(1-α,n-2)×s(b1)，表明在18個月的檢測期內(nèi)，在室溫避光條件下，樣品中有機碳含量隨時間沒有發(fā)生明顯變化，即標準樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4 定值分析與不確定度評定

2.4.1定值方法

采用多家實驗室協(xié)作定值的方式進行共同測定[18,33-34]。邀請了中國在土壤樣品檢測方面能力較強的11家實驗室，分別為：生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心環(huán)境標準樣品研究所、天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、國家地質(zhì)實驗測試中心、廣西壯族自治區(qū)地質(zhì)礦產(chǎn)測試研究中心、陜西省地質(zhì)礦產(chǎn)實驗研究所有限公司、河南省巖石礦物測試中心、沈陽礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測中心、長春礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測中心、成都礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測中心、武漢礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測中心、中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所。分別向參加協(xié)作定值的每家實驗室提供土壤樣品6瓶，每家實驗室反饋6個獨立數(shù)據(jù)結(jié)果。參加定值的11家協(xié)作實驗室共采用了2種分析方法：采用燃燒氧化-非分散紅外法的實驗室為5家，采用重鉻酸鉀容量法的實驗室為7家，其中1家實驗室同時采用了以上兩種測量方法。各家實驗室所采用的分析方法及測定結(jié)果匯總于表5。

表5 協(xié)作實驗室所用分析方法和測定數(shù)據(jù)

2.4.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

在全部測定數(shù)據(jù)中，每家協(xié)作實驗室提供的每個測定結(jié)果均滿足溯源性要求。采用燃燒氧化-非分散紅外法的5組數(shù)據(jù)的總均值為23.7mg/g，均值標準偏差為1.9mg/g；而采用重鉻酸鉀容量法的7組數(shù)據(jù)的總均值為26.2mg/g，均值標準偏差為0.9mg/g。上述兩種方法檢測結(jié)果的不確定度分量之間具有一致性，并且對樣品特性值不確定度的貢獻程度均較小。國內(nèi)外多個課題組就燃燒氧化-非分散紅外法與重鉻酸鉀容量法測定結(jié)果之間的關(guān)系進行了研究，所獲得的結(jié)論是，在一定的含量范圍內(nèi)，上述兩種方法的測定結(jié)果之間具有相關(guān)性[3,25-26]?？紤]到對于環(huán)境基體樣品，單一分析方法可能存在基體影響或基體干擾的風(fēng)險，兩種方法測定結(jié)果的中位值將是更加穩(wěn)健的統(tǒng)計量，用于評估標準樣品的特性量值會更合適。

2.4.3標準值的認定和不確定度評估

經(jīng)過對全部測定結(jié)果的統(tǒng)計處理，最終以多家實驗室協(xié)作測定統(tǒng)計結(jié)果的總均值作為土壤總有機碳標準樣品的標準值，該標準值為25.2mg/g。

本文土壤總有機碳標準樣品的不確定度(uCRM)由測定不確定度分量(uchar)、瓶間均勻性不確定度分量(ubb)和長期穩(wěn)定性不確定度分量(ults)組成。

測定不確定度分量(uchar)計算方法如下：

(4)

式(4)中：s為總均值標準偏差；p為檢測數(shù)據(jù)的組數(shù)。

經(jīng)計算，測定不確定度(uchar)結(jié)果為0.52mg/g，相對測定不確定度為2.1%。

標準樣品瓶間均勻性不確定度(ubb)是表征土壤樣品均勻性的定量指標。而檢測方法的重復(fù)性水平是評定瓶間均勻性不確定度的重要影響因素。當(dāng)樣品檢測方法的重復(fù)性很好時，能夠反映出瓶間很小的不均勻性，出現(xiàn)瓶間均方(MSb)明顯大于瓶內(nèi)均方(MSw)的情況，可用瓶間均勻性標準偏差來評估樣品的瓶間均勻性不確定度，計算公式為：

(5)

當(dāng)樣品檢測方法的重復(fù)性欠佳時，出現(xiàn)瓶間均方(MSb)接近或小于瓶內(nèi)均方(MSw)的情況，采用檢測方法的重復(fù)性標準偏差對瓶間均勻性標準偏差的貢獻來評估樣品的瓶間均勻性不確定度，計算公式為：

(6)

根據(jù)方差檢驗結(jié)果，以公式(6)計算本標準樣品的瓶間均勻性不確定度(ubb)，其結(jié)果為0.36mg/g，相對瓶間均勻性不確定度為1.5%。

根據(jù)穩(wěn)定性統(tǒng)計結(jié)果，計算標準樣品的長期穩(wěn)定性不確定度(ults)。對于沒有顯著穩(wěn)定性變化趨勢的標準樣品，其長期穩(wěn)定性不確定度計算公式為:

ults=s(b1)×t

(7)

式(7)中：s(b1)為斜率的標準偏差；t為穩(wěn)定性檢驗的總時間(月)。

土壤總有機碳標準樣品的穩(wěn)定性檢測共進行了6次，總時間累計18個月，即n=6，且t=18。經(jīng)計算，長期穩(wěn)定性不確定度(ults)為0.29mg/g，相對長期穩(wěn)定性不確定度為1.2%。

土壤總有機碳標準樣品的不確定度(uCRM)的計算公式為：

(8)

本文土壤總有機碳標準樣品的不確定度(uCRM)為0.7mg/g，相對不確定度為2.8%。不確定度采用擴展不確定度(UCRM)表示，取包含因子k=2，并按照“只進不舍”原則對結(jié)果進行保留[18,35]。則樣品的擴展不確定度(UCRM)為1.4mg/g，相對擴展不確定度為5.6%。即土壤總有機碳標準樣品的標準值和擴展不確定度為(25.2±1.4)mg/g。

2.4.4標準值的溯源性

為保證樣品標準值的質(zhì)量，盡可能減小誤差，本標準樣品的研制主要采取了以下6項具體措施保證溯源性。①制作標準曲線的試劑均由基準試劑配制，可溯源至SI測量國際單位。②用于樣品分析檢測的方法均為國家或行業(yè)標準分析方法，且經(jīng)實踐證明是成熟、準確、可靠的方法，方法的準確度、精密度及檢出限均滿足標準樣品分析要求。③實驗所用計量器具、天平、測量儀器等均通過國家計量部門檢定或校準，量值準確可靠，并可溯源至國家標準。④分析過程中，確保分析試劑的純度，每次分析時均進行空白試驗，扣減空白并進行背景校正。⑤參加本項目協(xié)作定值的實驗室通過國家級計量認證認可，具備參與標準樣品定值的能力、經(jīng)驗及質(zhì)量保證體系。⑥各實驗室均采用國家有證標準樣品對測定全過程進行質(zhì)量控制，確保分析結(jié)果準確可靠。

3 結(jié)論

采集新疆農(nóng)用地環(huán)境土壤作為原材料，經(jīng)除雜、干燥、研磨混勻、分裝滅菌等加工步驟，制備成土壤中總有機碳標準樣品。采用燃燒氧化-非分散紅外法分析測試并對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗，在最小取樣量為0.1g時，該標準樣品中總有機碳均勻性良好，在室溫避光條件下的穩(wěn)定性良好。組織多家具備能力和資質(zhì)的實驗室以燃燒氧化-非分散紅外法和重鉻酸鉀容量法兩種方法進行協(xié)作測定，在對檢測結(jié)果進行量值評定后，確定了土壤中總有機碳標準樣品的標準值和不確定度為(25.2±1.4)mg/g。該標準樣品的研制程序完全符合GB/T 15000系列和HJ 173—2017等標準規(guī)范的要求。

研制的土壤中總有機碳標準樣品為采用燃燒氧化-非分散紅外法進行分析的標準樣品。該樣品中有機碳含量水平和不確定度范圍等技術(shù)指標，能夠滿足中國土壤生態(tài)環(huán)境監(jiān)測工作質(zhì)量的要求，進一步完善了中國土壤環(huán)境標準樣品體系，可廣泛應(yīng)用于土壤環(huán)境監(jiān)測和土壤有機碳相關(guān)研究的質(zhì)量控制、土壤有機碳分析儀的校準、土壤有機碳檢測方法的評價，以及相關(guān)檢測能力的考核等方面的工作。