劉明，伍時(shí)華，龍秀鋒*，易弋，曾令杰

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006)

甘蔗是一種廉價(jià)高產(chǎn)的作物，在廣西有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[1]。它的主要成分是水、蔗糖、無(wú)機(jī)物等，它又是制取白砂糖的主要原料[2]，其副產(chǎn)物甘蔗糖蜜主要用于生產(chǎn)酒精。蔗糖乙醇發(fā)酵的實(shí)質(zhì)是蔗糖先被酵母分泌的蔗糖水解酶在胞外水解為果糖和葡萄糖，然后果糖和葡萄糖在酵母細(xì)胞內(nèi)經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，進(jìn)而生成乙醇，后續(xù)加工提純?yōu)楣I(yè)酒精或燃料乙醇[3-4]。目前對(duì)甘蔗汁和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵的研究多集中于甘蔗糖蜜預(yù)處理、發(fā)酵菌種篩選、工藝優(yōu)化等方面[5-9]，但是很少有對(duì)蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程酵母生長(zhǎng)、乙醇生成、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)規(guī)律方面的研究。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究菌體生長(zhǎng)、底物消耗、產(chǎn)物生成之間的動(dòng)態(tài)定量關(guān)系[10-11]，建立相應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的數(shù)學(xué)模型，從而達(dá)到認(rèn)識(shí)發(fā)酵過(guò)程規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵工藝、提高發(fā)酵產(chǎn)量、預(yù)先估計(jì)含量變化的目的，為補(bǔ)料發(fā)酵、放大實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)[12-13]。模擬發(fā)酵過(guò)程的模型有很多種[14-17]，大多數(shù)人采用的是非結(jié)構(gòu)模型或經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停琙akeri等[18]利用非結(jié)構(gòu)模型建立動(dòng)力學(xué)方程可以成功預(yù)測(cè)甘蔗糖蜜生產(chǎn)黃原膠的發(fā)酵過(guò)程，為黃原膠的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。為了能夠利用簡(jiǎn)單數(shù)學(xué)模型表示復(fù)雜的發(fā)酵過(guò)程曲線，本文重點(diǎn)研究高濃度(260 g/L)蔗糖乙醇分批發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)、乙醇生成、總糖消耗情況，利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程擬合實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)據(jù)，并對(duì)模型擬合情況進(jìn)行分析，找到能預(yù)測(cè)發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)方程，對(duì)甘蔗糖蜜和甘蔗汁高濃度乙醇擴(kuò)大生產(chǎn)有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母GJ2008(Saccharomycescerevisiae)：由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏，適用于高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)

一級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，自然pH(50 mL三角瓶裝液量30 mL)；二級(jí)種子培養(yǎng)基：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(500 mL三角瓶裝液量300 mL)；蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖260，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(5 L發(fā)酵罐裝液量3 L)。以上培養(yǎng)基均使用高壓蒸汽在115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器

蔗糖：市售，生產(chǎn)于廣西；硫酸(AR)：西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖、果糖(AR)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈、乙醇(AR)：安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；酵母粉、蛋白胨(BR)：廣東環(huán)凱微生物科技公司。

SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Chormaster高效液相色譜儀、Himic大容量冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；Biotech-5BG×5-94005L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備公司；LDZH-100KBS立式壓力滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BX43生物顯微鏡 奧林巴斯有限公司；ZWYR-C2402觸控?fù)u床 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

取1環(huán)斜面菌體至一級(jí)種子培養(yǎng)基，在搖床32 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h后離心去上清液，加無(wú)菌水制成10倍濃縮一級(jí)種子菌懸液。將10倍濃縮一級(jí)種子菌懸液3 mL接至二級(jí)種子培養(yǎng)基，在搖床32 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 h后離心去上清液，加無(wú)菌水制成10倍濃縮二級(jí)種子菌懸液。

1.2.2 發(fā)酵方法

將30 mL 10倍濃縮二級(jí)種子菌懸液接至5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速150 r/min、溫度32 ℃、通氣量80 mL/min條件下，進(jìn)行微通氧發(fā)酵；從0 h開始，每隔3 h取一次發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置2組平行，結(jié)果取平均值。

1.3 檢測(cè)分析方法

酵母細(xì)胞數(shù)的測(cè)定：取發(fā)酵液樣品用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，充分振蕩并采用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

液相色譜檢測(cè)糖條件：色譜柱為Alltima Amino(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶超純水為80∶20(V/V)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL?？偺?蔗糖×1.05+果糖+葡萄糖。

液相色譜檢測(cè)乙醇條件：色譜柱為L(zhǎng)achorm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型求解

通過(guò)蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)得到酵母生長(zhǎng)、乙醇生成、總糖消耗隨時(shí)間變化的曲線，以Logistic方程描述酵母生長(zhǎng)及乙醇生成隨時(shí)間變化的曲線，以Luedeking-Piret-like方程描述總糖消耗過(guò)程。利用Origin 9.5軟件繪圖并對(duì)這3項(xiàng)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，采用Levenberg-Marquardt算法和全局優(yōu)化算法獲得參數(shù)，并求出帶有具體參數(shù)的動(dòng)力學(xué)方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖乙醇分批發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)、乙醇濃度和總糖含量的變化

按照1.2.2中的發(fā)酵方法對(duì)蔗糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的酵母數(shù)、乙醇濃度進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)總糖含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 260 g/L蔗糖乙醇分批發(fā)酵過(guò)程Fig.1 The batch fermentation process of ethanol with 260 g/L sucrose

由圖1可知，在接種二級(jí)濃縮菌懸液后，酵母菌的生長(zhǎng)過(guò)程變化可分為兩個(gè)階段，0～15 h為快速生長(zhǎng)期，酵母數(shù)呈線性增加，生長(zhǎng)速率較快；15 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，酵母數(shù)趨于平緩，酵母數(shù)最大達(dá)4.23×108個(gè)/mL。乙醇含量隨著菌體生長(zhǎng)而增加，說(shuō)明產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)屬于“生長(zhǎng)偶聯(lián)型”，0～6 h乙醇增加得比較緩慢，6 h之后酵母細(xì)胞產(chǎn)生乙醇能力開始增加，乙醇濃度快速增加，在27 h時(shí)乙醇濃度趨于平緩，39 h發(fā)酵結(jié)束，終乙醇量為111.17 g/L?？偺窍内厔?shì)與乙醇大致相同，0～6 h之間總糖消耗緩慢，期間減少的糖主要用于菌體生長(zhǎng)，在6 h之后糖消耗加快，乙醇快速增加，二者有很大的相關(guān)性，33 h殘總糖趨于平緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘總糖為17.86 g/L。

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立和求解

2.2.1 酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

Logistic方程是由比利時(shí)學(xué)者Verhulst提出的一種“S”形曲線，此方程在擬合分批發(fā)酵中酵母生長(zhǎng)很實(shí)用，能較好反映發(fā)酵過(guò)程中酵母增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用[19]，方程如下：

(1)

式中：x為酵母濃度，×108個(gè)/mL；xm為最大酵母濃度，×108個(gè)/mL；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；t為發(fā)酵時(shí)間，h。將式(1)積分：

將x∈(x0, xt)，t∈(0, t)對(duì)上式積分得：

(2)

利用軟件將式(2)進(jìn)行自定義擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖2，其相關(guān)參數(shù)及方差分析表見(jiàn)表1和表2。

圖2 酵母生長(zhǎng)試驗(yàn)值擬合曲線Fig.2 The fitting curve of yeast growth test values

表1 參數(shù)估計(jì)值(菌體生長(zhǎng))Table 1 The parameter estimates (cell growth)

表2 方差分析(菌體生長(zhǎng))Table 2 The analysis of variance (cell growth)

由圖2可知，曲線在酵母快速生長(zhǎng)期時(shí)擬合度較好，但是在平穩(wěn)期時(shí)可能由于取樣的原因?qū)е聹y(cè)定值有高有低，擬合度沒(méi)有快速生長(zhǎng)期好。由表1和表2可知，酵母擬合曲線的均方根誤差為0.134，相關(guān)系數(shù)R2為0.9915，F(xiàn)值為3135.719，說(shuō)明擬合結(jié)果較好，此模型可以較好反映260 g/L蔗糖酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母的生長(zhǎng)變化。

2.2.2 乙醇生成動(dòng)力學(xué)模型

乙醇生成模型同樣屬于“S”形曲線，本試驗(yàn)乙醇生成動(dòng)力學(xué)模型仍采用Logistic方程進(jìn)行預(yù)測(cè)模擬。

(3)

式中：p為乙醇質(zhì)量濃度，g/L；pm為乙醇最大質(zhì)量濃度，g/L；μn為最大比生成速率，h-1；t為發(fā)酵時(shí)間，h。將式(3)積分得：

將p∈(p0, pt)，t∈(0, t)對(duì)上面公式積分得：

(4)

利用軟件將式(4)進(jìn)行擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到乙醇生成動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖3，其相關(guān)參數(shù)及方差分析表見(jiàn)表3和表4。

圖3 乙醇生成試驗(yàn)值擬合曲線Fig.3 The fitting curve of ethanol generation test values

表3 參數(shù)估計(jì)值(乙醇生成)Table 3 The parameter estimates (ethanol generation)

表4 方差分析(乙醇生成)Table 4 The analysis of variance (ethanol generation)

由圖3可知，在6 h之前擬合效果不好，預(yù)測(cè)值始終高于測(cè)定值，甚至在95%置信區(qū)間之下，結(jié)合圖2的酵母生長(zhǎng)擬合曲線，說(shuō)明在高濃度蔗糖乙醇分批發(fā)酵過(guò)程的前期主要是細(xì)胞生長(zhǎng)，乙醇生成很少。但在9 h之后乙醇生成量開始快速增加并且在33 h趨于平緩，可知在酵母穩(wěn)定期也有相當(dāng)一部分乙醇生成。由表3和表4可知，乙醇生成擬合曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9940，均方根誤差為4.044，F(xiàn)值為1672.07，雖然9 h之前的乙醇生成量比預(yù)測(cè)值低，但是總體的擬合趨勢(shì)良好，說(shuō)明此方程能大致反映260 g/L蔗糖酒精發(fā)酵過(guò)程中乙醇的生成變化。

2.2.3 總糖消耗動(dòng)力學(xué)模型

總糖消耗包括3個(gè)方面：用于酵母生長(zhǎng)及合成；作為酵母自身呼吸代謝；用于產(chǎn)生乙醇[20]。在蔗糖乙醇發(fā)酵中根據(jù)總糖消耗的碳平衡，結(jié)合酵母生長(zhǎng)和乙醇生成的動(dòng)力學(xué)模型，得到總糖消耗動(dòng)力學(xué)模型。其模型如下：

(5)

式中：s為總糖濃度，g/L；x為酵母濃度，×108個(gè)/mL；p為乙醇濃度，g/L；ms為細(xì)胞的維持系數(shù)，h-1；Yx/s為酵母相對(duì)于總糖的得率系數(shù)，108個(gè)/g；Yp/s為乙醇相對(duì)于總糖的得率系數(shù)，g/g；將式(5)積分得：

將s∈(s0, st)，x∈(x0, xt),t∈(0, t)對(duì)上面公式積分得：

(6)

利用軟件將式(6)進(jìn)行擬合，代入圖1數(shù)據(jù)后得到總糖消耗動(dòng)力學(xué)曲線，見(jiàn)圖4，其相關(guān)參數(shù)及方差分析表見(jiàn)表5和表6。

圖4 總糖消耗試驗(yàn)值擬合曲線Fig.4 The fitting curve of total sugar consumption test values

表5 參數(shù)估計(jì)值(總糖消耗)Table 5 The parameter estimates (total sugar consumption)

表6 方差分析(總糖消耗)Table 6 The analysis of variance (total sugar consumption)

由圖4可知，6 h之后糖消耗速率增大，說(shuō)明菌體代謝旺盛，乙醇生成量也大量增加，并且總糖實(shí)測(cè)值幾乎都在擬合曲線附近且屬于95%置信區(qū)間之內(nèi)。由表5和表6可知，此模型相關(guān)系數(shù)為0.9975，均方根誤差為5.4，F(xiàn)值為2882.53，說(shuō)明此方程擬合效果好，能較好反映260 g/L蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程中總糖消耗的過(guò)程變化。

綜上，將經(jīng)過(guò)軟件模擬的3個(gè)方程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)整合并帶入到各自方程中得到動(dòng)力學(xué)方程，見(jiàn)表7。

表7 擬合方程及各自相關(guān)系數(shù)Table 7 The fitting equations and respective correlation coefficients

2.3 模型數(shù)值比較

將各自模型的試驗(yàn)值和理論值進(jìn)行比較，并用相對(duì)誤差表示結(jié)果的可信度，見(jiàn)表8。

表8 模型試驗(yàn)值和理論值的比較Table 8 Comparison of model experimental values and theoretical values

續(xù) 表

由表8可知，除了發(fā)酵初期的乙醇試驗(yàn)值與擬合值差距較大外，其余試驗(yàn)值與擬合值相對(duì)誤差絕大多數(shù)在10%以內(nèi)，所以在此條件下，釀酒酵母GJ2008發(fā)酵高濃度蔗糖產(chǎn)乙醇的過(guò)程能夠用以上發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型來(lái)表示。

3 結(jié)論與展望

就本研究而言，酵母菌發(fā)酵0～6 h處于快速生長(zhǎng)期的前期，總糖消耗緩慢，酒精生成比較緩慢；發(fā)酵6～15 h是酵母菌快速生長(zhǎng)期的中后期，菌體活力高，耗糖能力和產(chǎn)乙醇能力增加；在15 h之后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，數(shù)量趨于平緩，耗糖能力和產(chǎn)乙醇能力依然很高，說(shuō)明在高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程中，乙醇不僅在酵母快速生長(zhǎng)期的中后期大量生成，穩(wěn)定期也有相當(dāng)一部分乙醇生成，33 h之后乙醇量趨于平緩，最大乙醇量為111.17 g/L。

利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程建立高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)、乙醇生成和總糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型，通過(guò)Origin 9.5軟件對(duì)方程進(jìn)行非線性回歸及相關(guān)系數(shù)分析，得到方程預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值的數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9929，0.9940，0.9975，具有很高的擬合度，表明模型能夠較好地說(shuō)明蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)、乙醇生成和總糖消耗的動(dòng)力學(xué)特性。為了更清楚地找到高濃度蔗糖乙醇發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、乙醇生成和總糖消耗的規(guī)律，我們?cè)诤罄m(xù)會(huì)增加不同濃度蔗糖乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，并對(duì)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)不同濃度下擬合的結(jié)果進(jìn)行分析，找到最適合高濃度蔗糖條件下乙醇發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)方程，對(duì)甘蔗汁和甘蔗糖蜜的擴(kuò)大生產(chǎn)有一定的參考意義。