陳頔 殷繼永 黃建

摘 要：目的：探究魚(yú)皮低聚肽（FOPs）對(duì)酒精損傷小鼠肝功能及糖脂代謝的影響。方法：將60只KM小鼠作為研究對(duì)象分為空白組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、陽(yáng)性組（水飛薊素，200 mg/kg BW）、FOPs組（250、500、1 000 mg/kg BW）。實(shí)驗(yàn)第33天灌胃制ALD模型。對(duì)小鼠各相關(guān)聯(lián)指標(biāo)（肝功能、血糖、血脂和氧化）的含量和活性進(jìn)行檢測(cè)，并量化分析肝組織的脂滴情況進(jìn)行。結(jié)果：FOPs氨基酸的成分組成甘氨酸（Gly）含量最高，其中90.61%均為低于1 000 U的小肽;FOPs各劑量組小鼠血清的肝功能指標(biāo)AST、ALT活力和血脂TG、TC含量顯著降低（P<0.05），250、500 mg/kg BW FOPs的TC含量略低于陽(yáng)性組;FOPs 各劑量組與模型組比較，肝臟合成蛋白指標(biāo)TP、ALB含量隨濃度的增加而升高，F(xiàn)OPs（250、1 000 mg/kg BW）組血糖GLU含量則明顯增高（P<0.05）;250、1 000 mg/kg BW劑量組肝組織過(guò)氧化指標(biāo)MDA含量顯著降低（P<0.05），F(xiàn)OPs各劑量組肝組織抗氧化指標(biāo)GSH活性明顯增高，甚至優(yōu)于空白組，與模型組相比差異顯著（P<0.05）。小鼠肝組織油紅O染色表明，F(xiàn)OPs緩解小鼠急性酒精肝細(xì)胞損傷的脂肪病變程度顯著（P<0.05）。結(jié)論：FOPs在急性乙醇小鼠的肝功能損傷和糖脂代謝方面方面具有良好的保護(hù)功能。

關(guān)鍵詞：魚(yú)皮低聚肽（FOPs）;乙醇;急性肝損傷;保肝功能

3～9個(gè)氨基酸單體經(jīng)過(guò)組合構(gòu)成了蛋白質(zhì)的前體，而這所謂的蛋白質(zhì)前體也被稱作低聚肽，食物蛋白質(zhì)在蛋白酶的酶解后，即可生成這種3～9個(gè)氨基酸殘基的物質(zhì)[1-2]。低聚肽不僅具有比原蛋白、游離的氨基酸更容易被人體吸收的特征，還具有很多生理活性。魚(yú)皮低聚肽（FOPs）是一種運(yùn)用生物酶解技術(shù)經(jīng)過(guò)魚(yú)皮中提取并制備出來(lái)的小分子的活性肽生物物質(zhì)，平均分子量低于1 000D[3]。該小分子肽的氨基酸組成不僅均衡、全面，還含有多種如纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及賴氨酸等必需氨基酸[4]。研究表明，F(xiàn)OPs在給予機(jī)體不斷地提供氮源的同時(shí)，還具備了免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、改善皮膚水分等生理活性[5-7]。近年來(lái)，來(lái)源于可食用物質(zhì)的外源性活性肽由于其在多方面生理活性中的重要性，成為了各界的研究熱點(diǎn)[8]。

作為分解代謝環(huán)節(jié)重要的器官——肝臟，過(guò)度甚至是有害的飲酒習(xí)慣均極易造成肝臟損傷，該類(lèi)情況引起的一系列疾病稱作酒精性肝?。ˋLD）[9-10]。由于人們對(duì)酒精的隨意使用和相對(duì)依賴，使之僅次于病毒性肝炎成為第二大肝臟性疾病[11]。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OPs對(duì)酒精性急性肝損傷及其機(jī)制的深入研究鮮有報(bào)道。在急性肝損傷模型中，酒精一次性大量攝入性肝損傷模型最接近于人類(lèi)豪飲所致肝損傷的ALD早期損傷特點(diǎn)[12]，所以本研究擬通過(guò)FOPs，對(duì)小鼠進(jìn)行乙醇急性肝損傷研究，通過(guò)這種急性模型的刺激和效果評(píng)估，以期評(píng)價(jià)并確定FOPs的肝功能相關(guān)指標(biāo)，從而為FOPs的保肝功能的有效干預(yù)提供有益且可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明系（KM）雌性小鼠，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重18～22 g，共計(jì)60只。動(dòng)物合格證：SCXK（京）2016-0011。

1.2 材料與試劑

FOPs，中食海氏生物技術(shù)有限公司;水飛薊素，Sigma公司;乙醇，95%，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司;MDA、GSH檢測(cè)試劑盒，南京建成科技有限公司;AST、ALT、TP、ALB、GLU、TG、TC檢測(cè)試劑盒，北京和光純藥工業(yè)株式會(huì)社提供。

1.3 主要儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf、Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，德國(guó) BMG LABTECH、7080全自動(dòng)生化儀，日本日立、冰凍切片機(jī)CM1850，德國(guó)Lecia、Ti-S熒光倒置顯微鏡，日本Nikon。

1.4 方法與指標(biāo)

1.4.1 FOPs氨基酸組成及相對(duì)分子量分布 相對(duì)分子量分布檢測(cè)采用高效液相色譜凝膠法[13];GB 5009.124—2016食品中氨基酸的測(cè)定方法檢測(cè)氨基酸的組成[14]。

1.4.2 動(dòng)物分組及造模方法 按體重將60只適應(yīng)飼養(yǎng)5 d后小鼠隨機(jī)分為空白、模型、陽(yáng)性和FOPs低、中、高劑量組（250、500、1 000 mg/kg BW），每組10只。陽(yáng)性組為每日200 mg/kg BW水飛薊素，空白和模型組給予等量純凈蒸餾水，按照0.1 mL/10 g標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)灌胃32 d，并根據(jù)每周體重變化量調(diào)整灌胃體積。除空白組繼續(xù)給予等量純凈蒸餾水外，其他5組均于第33天，50%乙醇，0.13 mL/10 g灌胃復(fù)制造模，并于禁食、自由進(jìn)水16 h后，小鼠摘眼球取血，4 000 r/min 離心 15 min 分離血清，吸取上清液保存，完整剝離處死小鼠肝臟并去除脂肪組織和膽囊稱取重量，計(jì)算其肝重指數(shù)。小鼠肝臟左葉干凈剖取后切片，鏡檢下觀察脂滴情況;另取剩余部分制成10%的肝組織勻漿。

1.4.3 指標(biāo)（1）肝重指數(shù)的計(jì)算 待完整干凈的剝離動(dòng)物肝臟后，對(duì)表面的血污進(jìn)行沖洗，吸干表面多余水分后，稱重，計(jì)算肝重指數(shù)。（2）小鼠血清和肝臟相關(guān)聯(lián)指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、TP、ALB、血糖GLU和血脂TG、TC指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)10%肝組織氧化指標(biāo)MDA、GSH進(jìn)行檢測(cè)。（3）小鼠肝臟油紅O染色切片觀察 乙醇致毒小鼠的肝臟內(nèi)脂滴情況及其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范-2003》進(jìn)行量化。

肝重指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/小鼠終體質(zhì)量（g）*100[15]

1.5 數(shù)據(jù)分析

SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，結(jié)果用±s表示;采用單因素方差分析法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異比較，P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FOPs理化特性

由表1、表2、圖1可知，F(xiàn)OPs占比前4位的氨基酸分別為甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala），比例分別為21.30%、13.50%、9.35%、8.50%。其組成主要以混合小分子肽結(jié)構(gòu)為主，140～500 U占主要比例，含量達(dá)到54.88%。

2.2 FOPs對(duì)小鼠肝重指數(shù)的影響

由表3可知，WKM小鼠模型組的肝重指數(shù)顯著高于空白組（P<0.01），該結(jié)果說(shuō)明酒精的急劇攝入使肝臟受損從而腫大，酒精急性肝損傷模型造模成功。FOPs 中、高劑量組、陽(yáng)性組的肝重指數(shù)均顯著低于模型組（P<0.05），且FOPs高劑量組肝臟指數(shù)低于陽(yáng)性組。

2.3 FOPs在小鼠血清肝功能、血脂血糖指標(biāo)的影響

由表4可見(jiàn)，與空白組相比，模型組血清的肝功能指標(biāo)AST、ALT活性和血糖GLU、血脂TG、TC含量一致性顯著升高，而反映肝臟蛋白質(zhì)合成功能指標(biāo)TP、ALB含量則明顯降低（P<0.05）。相較于模型組，F(xiàn)OPs各組的AST、ALT活性均顯著降低（P<0.01）;1 000 mg/kg BW 劑量組的TP含量和500、1 000 mg/kg BW劑量組ALB含量呈顯著性增加（P<0.05），且TP、ALB含量的絕對(duì)值隨著濃度的增加呈遞增態(tài)，但均沒(méi)有完全好于陽(yáng)性組，而FOPs各劑量組AST、ALT活性則低于陽(yáng)性組;250、1 000 mg/kg BW FOPs 劑量組血糖GLU含量明顯高于模型組（P<0.05），3個(gè)劑量組FOPs的TG、TC含量顯著低于模型組，250、500 mg/kg BW FOPs的TC含量略低于陽(yáng)性組。

2.4 FOPs在小鼠肝組織MDA和GSH的影響

由表5可見(jiàn)，模型組與空白組比較，ALD造模后，氧化指標(biāo)MDA含量顯著升高2.46（μmol/g肝），且明顯降低了GSH活性0.56（μmol/g肝）（P<0.05）。250、1 000 mg/kg BW劑量組FOPs的MDA含量明顯低于模型組（P<0.05），其中高劑量組MDA含量甚至接近于陽(yáng)性組;FOPs的GSH活性較空白組更高，尤以500 mg/kg BW最為突出。

2.5 FOPs對(duì)小鼠肝組織脂滴變化的影響

由表6、圖2可看出，乙醇急性肝損傷模型小鼠的肝組織油紅染色，觀察肝臟脂肪改變程度。剖取的模型組肝組織外觀色澤暗黃，組織紋理粗糙，并伴有白色顆粒，空白組則色澤鮮紅，表面光滑。經(jīng)油紅O染色肝組織內(nèi)的脂肪滴鏡檢呈紅或鮮紅色，被紅染的脂肪滴多數(shù)的輪廓清晰可見(jiàn)。模型組的肝臟脂滴被紅染的面積顯著多于空白對(duì)照組，F(xiàn)OPs 3個(gè)劑量組及陽(yáng)性組的肝臟脂質(zhì)顏色較淺，病變程度積分差異較模型對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且FOPs高劑量組病變程度積分與水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組相同。

3 討論

ALT和AST在肝細(xì)胞壞死、炎癥活動(dòng)中是極為重要的指標(biāo)，血清ALT和AST活力對(duì)肝損傷程度較為敏感[16-17]。肝組織細(xì)胞受到破壞變性后，使得肝細(xì)胞通透性增高，主要的酶ALT從細(xì)胞內(nèi)逸出;線粒體中的 AST 當(dāng)受到肝細(xì)胞嚴(yán)重病變壞死時(shí)便釋放出來(lái)[18]。肝臟能夠主要合成血清白蛋白，當(dāng)ALB濃度受阻降低后，血清TP含量隨之降低[19]。王曉紅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，酒精能夠降低血漿中脂聯(lián)素的含量，最終導(dǎo)致血糖濃度的升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型與空白組相比較，血清的肝功能指標(biāo)AST、ALT活性和GLU、TG含量顯著升高，而TP、ALB含量則明顯降低（P<0.05）。經(jīng)受試物FOPs影響后，血清中AST、ALT活性水平逐漸降低，TP、ALB含量隨受試物濃度的升高而增加，說(shuō)明其在保肝功能上的作用是毋庸置疑的，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，受試物血糖的含量不但沒(méi)有增加，反而在低、高濃度上顯著性增加，這與我們前期的預(yù)期效果正好相反，在之后的研究中，有必要再進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行觀察。ALD導(dǎo)致的一系列與酒精性肝損傷相關(guān)的表現(xiàn)，包括脂滴沉積、血清和肝臟總TG和TC的升高和抗氧化酶活性的降低以及過(guò)量脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生等[21-22]。作為酒精性肝損傷的一個(gè)特征性指標(biāo)—TG，在整個(gè)的肝臟代謝過(guò)程中，NADH/NAD+比率會(huì)嚴(yán)重失調(diào)，從而會(huì)造成TG的轉(zhuǎn)運(yùn)遭到抑制，使脂肪酸的氧化受阻，TG含量升高[23]。本研究結(jié)果表明，在血清中，與模型組比較，F(xiàn)OPs TG、TC含量顯著下降（P<0.05），脂代謝趨于正常。

自由基作用于脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA，其含量反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[24]，而GSH在與谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶和GSH—Px結(jié)合后，在ROS的防御機(jī)制中承擔(dān)了重要的角色[25]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，F(xiàn)OPs明顯降低肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)MDA含量的同時(shí)，提高了GSH活性（P<0.05），從而對(duì)自由基的生成起到抑制作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性肝損傷模型的建立，使得模型組的肝臟指數(shù)顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），這表明造模后，肝臟受損并腫大，陽(yáng)性組和FOPs各劑量組肝臟指數(shù)較模型組均顯著降低（P<0.05），這與劉睿等[8]、丁榮榮[26]等的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組與空白組比較，肝組織細(xì)胞內(nèi)大小不同的圓粒脂滴被油紅O清晰地染成紅色，且面積較大，脂肪變性程度具有顯著性差異（P<0.05），F(xiàn)OPs各劑量組則顯著減少了紅色脂滴面積，與模型對(duì)照組比較，變性程度顯著緩解（P<0.05）。由此提示，F(xiàn)OPs能夠降低TG等一系列脂質(zhì)的有害堆積，減緩肝組織在脂質(zhì)代謝中的紊亂程度，從而起到對(duì)損傷的肝組織的保護(hù)作用。

本研究使用的FOPs經(jīng)分析，分子量大部分在1 000 U以下，且氨基酸種類(lèi)全面豐富，這也是該受試物能夠有效的被人體吸收，最大效果的發(fā)揮其功能作用的原因。

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Protective Effect of Fish Skin Oligopeptides on Acute Hepatic Injury Induced in Mice

CHEN Di，YIN Ji-yong，HUANG Jian

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention/Key Laboratory of Trace Element Nutrition of National Health Commission of People’s Republic of China，Beijing 100050，China）

Abstract：【Objective】 To investigate the effects of Fish skin oligopeptides（FOPs）on liver function and glucose and lipid metabolism in mice with alcohol injury.【Method】 Totally 60 KM mice were divided into blank（distilled water），model（distilled water），positive group（silymarin，200 mg/kg BW）and FOPs groups（250，500，1 000 mg/kg BW）.On the 33rd day，the ALD model was made by gavage.The content and activity of the relevant indicators（liver function，blood sugar，blood lipid and oxidation）of the mice were detected，and the lipid droplets in the liver tissue were quantitatively analyzed.【Result】 The contents of glycine（Gly）in FOPS amino acids were the highest，90.61% of which were small peptides less than 1 000 U.The activities of AST and ALT and the contents of TG and TC in serum of mice in FOPs were significantly decreased（P<0.05），The content of TC in 250 and 500 mg/kg BW FOPs was slightly lower than that of positive group.Compared with model group，the contents of TP and Alb in FOPs increased with the increase of concentration，while the content of GLU in 250 and 1 000 mg/kg BW groups was significantly increased（P<0.05）.The content of MDA in liver tissue in 250 and 1 000 mg/kg BW groups was significantly decreased（P<0.05），while the activity of GSH in FOPS groups was significantly higher，even better than that of blank group，and the difference was significant compared with model group（P<0.05）.Oil red O staining of mice liver tissue showed that FOPs significantly alleviated the degree of fatty lesions in mice with acute alcoholic liver cell injury（P<0.05）.【Conclusion】 FOPS has a good protective effect on liver function injury and glycolipid metabolism in acute ethanol mice.

Keywords：FOPs;ethanol;acute liver injury;liver protection function

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：2016YFD0400602）。

作者簡(jiǎn)介：陳 頔（1985— ），女，碩士，助理研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)干預(yù)。

通信作者：黃 建（1969— ），男，研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)干預(yù)。