紀海霞

摘要： ? ? ? 腦膠質瘤是一種發(fā)生于大腦和脊髓的腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤。由于病灶處于腦部，常常發(fā)生腫瘤細胞浸潤，因而無法明確腫瘤邊界，使得手術根除較為困難，而藥物作用又因為血腦屏障問題難以達到腦部，因而腦膠質瘤無法得到有效治療。IDH1 ? ? ? 突變會導致細胞內致癌代謝物 R-2- 羥基戊二酸 （2-HG） 升高，有助于腫瘤發(fā)生，IDH1 突變發(fā)生于高達 70% 的 II 級或 III 級腦膠質瘤中，開發(fā)高透腦率的小分子IDH1 抑制劑對于IDH1 突變的腦膠質瘤有重要的意義。

本文通過建立體內外藥效評價試驗，包括酶活性測試、細胞活性測試以及體內原位腦膠質瘤模型，測定了小分子抑制劑 KPC0226 對IDH1 突變體的抑制活性、KPC0226 的血腦屏障通透性以及對致癌代謝產(chǎn)物 2-HG 的減少作用。試驗結果顯示，KPC0226 對IDH1-R132H 和IDH1-R132C 突變酶的抑制活性IC50 均低于 20nM，而對野生型IDHI（DH wt） 的抑制活性IC50>3000nM，具有顯著的抑制活性及高選擇性。KPC0226 在細胞上的 IDH1-R132H 和 IDH1-R132C 抑制活性 IC50 分別為 33.09 nM 和 13.32 nM，抑制活性均高于陽性參比化合物 BAY032（BAY1436032）。KPC0226 在體內原位腦膠質瘤模型中具有與陽性化合物相當?shù)耐改X率及更高的 2-HG 抑制作用，其抑制作用可持續(xù)至給藥后 8hr。

KPC0226 具有繼續(xù)開發(fā)為IDH1 突變的腦膠質瘤抑制劑的潛力，一旦研發(fā)成功，將會造福廣大IDH1 突變的腦膠質瘤患者。關鍵詞：腦膠質瘤，IDH1，小分子抑制劑，體內外藥效腦膠質瘤主要是由于包圍和支持大腦神經(jīng)元的膠質細胞發(fā)生癌變引起，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜細胞。腦膠質瘤可以劃分為 1、II、III、IV 級，其中，Ⅰ、Ⅱ為低級別腦膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別腦膠質瘤。流行病學數(shù)據(jù)顯示，腦膠質瘤約占所 ?有原發(fā)性腦瘤的 33%[1]。腦膠質瘤的現(xiàn)有治療手段主要以手術、放化療為主，但由于病灶位于腦部，手術、放化療方法創(chuàng)傷大、易復 ? 發(fā)、預后差，甚至由于病灶太深無法達到很好的治療效果，且有較 ?大的毒副作用。

異檸檬酸脫氫酶 （Isocitrate dehydrogenases， IDHs） 是催化異檸檬酸生成 α- 酮戊二酸 （α-KG） 的關鍵代謝酶，如 ： 異檸檬酸 + NADP+ → α-KG+ C02 + NADPH + H+，參與細胞代謝的 TCA 循環(huán)。

IDH1 是異檸檬酸脫氫酶家族的三種亞型之一[2，3]，IDH1 突變通常發(fā)生在其催化域，如IDH1-R132H 或IDH1-R132C 突變較為多見。這些突變導致 IDH1 繼續(xù)催化 α-KG 轉化為 R-2- 羥基戊二酸 （2-HG）。2-HG ? ? 是一種有助于腫瘤發(fā)生的細胞代謝廢物，通常會發(fā)現(xiàn)，IDH1 突變的腫瘤中 2-HG 水平升高，而正常細胞中 2-HG 的水平普遍較低 [4，5，6]。大約在 15-20% 的急性髓系白血病 （AML）、超過70% 的 II 級或 III 級腦膠質瘤和高達 25% 的膽管癌中檢測到 IDH1 突變（IDH1 R132 突變較為多見）[7，8]。

本論文將研究KPC0226 在體內外對IDH1 突變體的抑制活性， 探索IDH1 突變體抑制劑作為今后膠質瘤治療新靶點的可能。

1 材料和方法

1.1 材料：

IDH1-R132H 突變酶購自 RBC，批號為 IDH-11-323;IDH1-R132C 突變酶購自RBC，批號為IDH-11-324。

U87MG-IDH1-R132H 細胞株由藥明康德構建， 是通過轉染U87MG 細胞（ATCC，貨號：HTB-14）后篩選得到的可以穩(wěn)定表達 IDH1-R132H 突變的細胞株。HT1080 細胞株是含有內源性的IDH1-R132C 突變的細胞株，購自ATCC（貨號：CCL-121）。

實驗動物為 BALB/c nude 小鼠，24 只，6-8 周齡， 雌性， 20-22 克，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：1909110049。動物以 IVC（獨立送風系統(tǒng)，恒溫恒濕）籠具飼養(yǎng)（每籠 3 只）于 SPF 級動物房，溫度：20-26 oC、濕度：40-70 %。

KPC0226 內標鹽酸維拉帕米 （Verapamil hydrochloride） 購自Sigma， 批 號 為 MKBV4993V;2-HG 內 標 2-HG-d5-13C5（D-α- Hydroxyglutaric acid-13C5 disodium salt） 購自TRC， 貨號H942568。

1.2 方法

1.2.1 IDH1 體外酶活性測試

配置試驗的基礎反應緩沖液：50mM KH2PO4， PH7.5， 10mM MgCl2， 10%glycerol（ 甘 油 ），150mM NaCl， 0.05% BSA（ 牛 血 清 白 蛋白 ）， 2mM b-ME（2- 巰基乙醇 ）， 0.003% Brij35（ 氧乙烯月桂醚 ）;底物和輔助因子：IDH1 wt（ 野生型） 65μM 異檸檬酸+50μM NADP， IDH1（R132H） 1500μM α-KG+15μM NADPH，IDH1（R132C） 500μM α-KG+15μM NADPH。

反應板孔中加入 1.33× 的酶（ 對照孔不加）、緩沖液和NADP 或 NADPH（ 對照孔），KPC0226 溶于 100%DMSO 后加入酶混合物中，簡單離心后孵化 60 分鐘，加入 4× 底物和輔助因子的混合物開始反應，簡單離心后搖振，室溫下孵育 45 分鐘。制備3× 硫辛酰胺脫氫酶和忍天青的混合物，加入至反應液中測試生成或剩余 NADPH 量，簡單離心后室溫下孵化 10 分鐘，使用多功能酶標儀Envision 測量（Ex/Em=535/590nm）。

1.2.2 IDH1 細胞學活性測試

將 U87MG-IDH1-R132H 細胞和 HT1080 細胞分別以 40，000 細胞/ 孔和 20，000 細胞/ 孔的種入 96 孔板中，每孔 200 μL，將化合物用DMSO 作 3 倍梯度稀釋后加入到細胞培養(yǎng)板中，共 10 個濃度， 每個濃度雙復孔。陰性對照孔只含 DMSO，陽性對照孔含有終濃度為 5 μM 的 AGI-5198。所有孔的 DMSO 終濃度為 0.5%。細胞在37oC、5% CO2 條件下培養(yǎng) 3 天。

取 10 μL 細胞上清用雙蒸水稀釋至 200 μL。取 50 μL 雙蒸水稀釋后的細胞上清樣品，加入到 200 μL 沉淀劑中，混合均勻后， 4000 rpm 離心 10 分鐘。取出 100 μL 上清，用 LC-MS 檢測 2-HG 的相對含量（2-HG 含量和內標含量的比值）。

用 CellTiter-Glo 試劑，按照試劑盒說明書方法檢測培養(yǎng)板各孔的細胞活力，并使用多功能酶標儀Envision 檢測化學發(fā)光信號值（RLU）。

數(shù)據(jù)分析：

2-HG 相對含量原始數(shù)據(jù)用于計算化合物對 IDH1 突變體的抑制百分比，計算公式為：

* 控制率%=（CPD-ZPE）（HPE-ZPE）X1000%*

*. ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? CPD： 化 合 物 孔 的 信 號 值 ; ZPE：無效作用對照孔，0.5% DMSO 處理孔的信號值;

HPE：100% 有效作用對照孔，5 μM 的 AGL-5198 處理孔的信號值。

應用 GraphPad Prism（version 5） 軟件， 將化合物活性抑制百分比（抑制率 ? ? %）采用非線性回歸方法擬合劑量效應曲線（log（inhibitor） vs. response -- Variable slope），并得出化合物的值。

1.2.3 IDH1 體內活性測試

本實驗用腦癌 U87-IDH1-R132H 細胞，細胞培養(yǎng)于含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，一周兩次消化傳代。在細胞傳代 20 代以內，且細胞量達到約 85% 時，收集細胞用于接種。

用舒泰 50 （60 mg/mL）+ 噻啦嗪 （1.5 mg/mL） 麻醉裸鼠，于術后蘇醒，皮下注射 2 mg/kg 美洛昔康，連續(xù)三天，以減輕動物的痛苦。將動物固定后，用 75% 的酒精進行消毒頭部，用滅菌手術刀在頂骨處切開約 0.5cm 切口，用粘有 3% 雙氧水的棉簽消毒手術部位頭骨并進行穿孔?；靹蚣毎麘乙海梦⒘孔⑸淦魑乙哼m量，針尖穿過孔位，勻速注入細胞懸液（約 3 μL，含 1×105 U87-IDH1-R132H ?細胞）。小心抽出針頭以防細胞懸液回流或擴散。將切口處組織縫合并繼續(xù)觀察至動物完全蘇醒。

接種后第 20 天，將小鼠分為三組，分別給予 BAY032 100mg/kg 或者 KPC0226200mg/kg 化合物，每日給藥兩次，共給藥 3 次， 另一組小鼠不做任何處理作為陰性對照組。給藥后 0.25 小時、2 小時和 8 小時后，分別取 3 只小鼠的腦瘤、癌旁腦組織和血漿。全血置于含有 EDTA-2K 抗凝管中，輕柔混合均勻，7500 rpm 離心取血漿，-80℃保存直至轉移，每個樣本取 ～100 uL 血漿。腫瘤及瘤旁組織經(jīng)稱重后（約 50-100 mg/ 樣本）置于液氮中速凍，-80℃保存。

使用 LC-MS/MS 檢測 2-HG 的含量。LC-MS/MS 型號為 LC- MS/MS-R （API 4000），液相條件選擇流動相 A：含 0.001% 氨水和0.18 mM 乙酸二丁基銨的水溶液;流動相 B：含 10 mM N，N- 二甲基己胺和 3 mM 醋酸銨的 50% 乙腈水溶液。保留時間：2-HG：0.70min（血漿）、0.74 min（腫瘤周邊組織勻漿）、0.88 min（腫瘤勻漿）;2-HG-d5-C13（ 內標）：0.70 min（ 血漿）、0.74 min（ 腫瘤周邊組織勻漿）、0.88 min（腫瘤勻漿）。MS/MS 采用電噴霧電離源（ESI）、負離子模式，質荷比設置為：2-HG：[M-H]- m/z 146.7/129.1、2-HG-d5-13C5（內標）： [M-H]- m/z 156.9/138.3。

2. 試驗結果

2.1 IDH1 體外酶活性測試

IDH1 突變體催化 NADPH 依賴的 α-KG（α- 酮戊二酸）還原為 2-HG（2- 羥戊二酸），消耗的 NADPH 可以用熒光讀出?；衔飳?IDH1-R132H 和 IDH1-R132C 突變酶抑制活性數(shù)據(jù)總結于表 1。

試驗結果顯示 ， KPC0226 對 IDH1-R132H 和 IDH1-R132C 突變酶的抑制活性 IC50 分別為 12.19 nM 和 10.62 nM，而對野生型IDHI（DH wt） 的抑制活性IC50 為3043nM，約為突變型的250 倍;因而，KPC0226 對 IDH1-R132H 和 IDH1-R132C 酶有顯著的抑制作用， 且相對于野生型IDH1 酶具有高選擇性。

2.2 IDH1 細胞學活性測試

本研究采用 U87MG-IDH1-R132H 和 HT1080 細胞株，將化合物與 IDH1 突變體細胞系共同孵育后，通過檢測 2-HG 含量來評價KPC0226 對IDH1 突變體的細胞水平抑制活性。活性數(shù)據(jù)見表 2。在 U87MG-IDH1-R132H 細 胞 中 ，KPC0226 對 IDH1-R132H的抑制活性 IC50 值為 33.09 nM， 在 HT1080 細胞中，KPC0226 對 IDH1-R132C 的抑制活性 IC50 值為 13.32 nM。據(jù)文獻報道 ，BAY032 對 IDH1-R132H 和 IDH1-R132C 的細胞抑制 IC50 為 60nM 和 45 nM[9]，與參比化合物BAY032 相比，KPC0226 在細胞上對IDH1-R132H 和IDH1-R132C 的抑制作用更強。

2.3 IDH1 體內活性測試

溶媒組腦瘤中的 2-HG 平均濃度為 803878.5 nM/kg;BAY032 給藥組，0.25 小時、2 小時和 8 小時，腦瘤中的 2-HG 平均濃度分 別 為 527515.2 nM/kg 、 387072.3nM/kg 和 24204.5 nM/kg， 相 比vehicle 組，0.25 小時、2 小時和 8 小時 2-HG 平均濃度分別下降3.4%、51.8% 和 97.0%;KPC0226 組，0.25 小時、2 小時和 8 小時， 腦瘤中的 2-HG 平均濃度分別為 15930.2 nM/kg、12402.0 nM/kg 和4993.9 nM/kg， 相比 vehicle 組，0.25 小時、2 小時和 8 小時 2-HG 平均濃度分別下降 98.0%、98.5% 和 99.4%。試驗結果如圖 1 所示， 給藥0.25 小時，KPC0226 即可顯著降低腦瘤中的致癌代謝產(chǎn)物2-HG的含量，作用快于BAY032，這一效果至少可持續(xù)至給藥后 8 小時。結果表明，KPC0226 在腦瘤組織內對 2-HG 表現(xiàn)出劑量和時間依賴性的抑制作用。

KPC0226 在血漿、正常腦旁組織和腦瘤中的平均總暴露量（AUC0-last） 分 別 為 416856 nM.hr，97429nM.hr 和 196733nM.hr， 透腦率 （AUC0-last [brain]/AUC0-last [plasma]） 為 47.1%;BAY032 在血漿、正常腦旁組織和腦瘤中的平均總暴露量（AUC0-last）分別為387498 nM.hr，125962nM.hr 和 230405nM.hr，透腦率 （AUC0-last [brain]/ AUC0-last [plasma]） 為 59.4%。結果表明，KPC0226 具有與 BAY032 相近的血腦屏障透過性。

3. 討論

根據(jù)美國腦腫瘤注冊中心統(tǒng)計，膠質瘤發(fā)病率約為 5.17/10 萬人。中國腦膠質瘤占顱內腫瘤的 35.2%-61.0%，平均 49.7%，年發(fā)病率為 3-6 人 /10 萬人，是原發(fā)性腦瘤中發(fā)病率最高的腫瘤。由于血腦屏障存在，眾多藥物難以達到腦部;且腦膠質瘤于周圍的神經(jīng) ? 組織往往邊界不夠清晰，使得治療一直無法取得有效進展。

IDH1、IDH2 和 IDH3 是異檸檬酸脫氫酶家族的三種亞型。

IDH1 和 IDH2 是細胞中以同型二聚體形式存在的結構高度相似的同工酶，同型二聚體的每個亞基都有一個活性中心，IDH3 是異四聚體 [10]。IDH 突變通常發(fā)生在其催化域，如野生型氨基酸被IDH1-R100、IDH1-R132、IDH1-G97 和 IDH2-R140、IDH2-R172等取代 [11]。 IDH-1 和 IDH-2 突變伴隨 2-HG 水平升高已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括腦膠質瘤、、膽管癌、黑色素瘤、急性髓細胞性 ?白血?。ˋML） 等，也可見于罕見的神經(jīng)代謝疾病中[2]。

因此，小分子突變 IDH1/2 抑制劑已成為治療癌癥和其他IDH1/2 突變疾病的潛在療法。截至目前，針對 mt-IDH 疾病的臨床試驗共有 112 個，其中 IDH1 抑制劑 46 個，IDH2 抑制劑 32 個，主要分布在北美、歐盟和中國。Celgene、諾華、拜耳、基石 藥業(yè)、和黃藥業(yè)、海和藥業(yè)等公司均參與 IDH 抑制劑的研發(fā)。其中，IDH2 抑制劑 Idhifa（Enasidenib， Celgene Inc） 和 IDH1 抑制劑Tibsovo（ivosidenib， AG-120， Agios Inc） 已獲批上市用于 AML 治療， AG-120 正在進行包括腦膠質瘤、膽管癌等在內的實體瘤臨床試驗，但 AG120 在 DH1m 發(fā)生率很高的腦癌中治療并不理想，這是由 AG120 固有的血腦屏障穿透性低所導致，在大鼠中單次給與AG-120 50mg/kg，其透腦率僅有 4.1%（AUC 0–8h [brain]/AUC 0–8h[plasma]）[4]。因此，本研究采用具有更高透腦率的拜爾公司的小分 ?子化合物 BAY032 作為體內試驗陽性參比化合物。BAY032 是具有高選擇性、高口服生物利用度的 IDH1 抑制劑，臨床前研究數(shù)據(jù)顯示，BAY032 對多種 IDH1-R132 突變體的酶具有兩位數(shù)納摩爾級別的抑制活性，在患者來源或是表達不同 IDH1 突變的細胞系中，BAY032 能有效地抑制 2-HG 的釋放 [12]。本研究表明，KPC0226 具有與 BAY032 相當?shù)?IDH1 細胞水平活性抑制作用，在體內，KPC0226 表現(xiàn)出與BAY032 相當?shù)耐改X率以及更高的腦瘤 2-HG 抑制活性。

未來，我們將繼續(xù)研究 KPC0226 對其他腦膠質瘤模型的抑制活性，并將進一步研究起藥代和毒理特性。膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展及 其復雜，我們還將在未來探索 KPC0226 與多種機制藥物聯(lián)用的作用，期待能為腦膠質瘤的治療提供更好的治療方法。

參考文獻

[1] 中國腦膠質瘤分子診療指南（2014）， 中華神經(jīng)外科雜志， 2014，30（5）：435-444.

[2] Q. Zheng et al.， Discovery and structure-activity- relationship study of novel imidazole cyclopropyl amine analogues for mutant isocitric dehydrogenase 1 （IDH1） inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2018， 28 （23-24）， 3808-3812.

[3] Y. S. Cho et al.，Discovery and Evaluation of Clinical Candidate IDH305， a Brain Penetrant Mutant IDH1 Inhibitor. ACS medicinal chemistry letters 2017， 8 （10）， 1116-1121.

[4] J. Popovici-Muller et al.， Discovery of AG-120 （Ivosidenib）： A First-in-Class Mutant IDH1 Inhibitor for the Treatment of IDH1 Mutant Cancers. ACS medicinal chemistry letters 2018， 9 （4）， 300-305.

[5] Q. Zheng et al.， Discovery and structure-activity- relationship study of novel conformationally restricted indane analogues for mutant isocitric dehydrogenase 1 （IDH1） inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2017， 27 （23）， 5262-5266.

[6] 陳妍紅， 陳小平. 腫瘤代謝物 2-HG 與膠質瘤發(fā)生發(fā)展及其檢測， 中國藥理學通報， 2018， 34（7）： 898-902.

[7] D. R. Borger et al.， Frequent mutation of isocitrate dehydrogenase （IDH）1 and IDH2 in cholangiocarcinoma identified through broad-based tumor genotyping. The oncologist 2012， 17 （1）， 72-9.

[8] Grassian， A. R.; Pagliarini， R.; Chiang， D. Y.， Mutations ?of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 in intrahepatic cholangiocarcinoma. Current opinion in gastroenterology 2014， 30 （3）， 295-302.

[9] A. Chaturvedi et al.， Pan-mutant-IDH1 inhibitor BAY1436032 is highly effective against human IDH1 mutant acute myeloid leukemia in vivo. Leukemia 2017， 31 （10）， 2020- 2028.

[10] Waitkus， M. S.; Diplas， B. H.; Yan， H.， Biological Role and Therapeutic Potential of IDH Mutations in Cancer. Cancer cell 2018， 34 （2）， 186-195.

[11] L. Dang et al.， Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature 2009， 462 （7274）， 739-44.

[12] Olaf Panknin et al.，BAY 1436032： A highly selective， potent and orally available inhibitor of mutant forms of IDH1. AACR 107th Annual Meeting 2016; April 16-20， 2016; New Orleans， LA.

（上海昆恒醫(yī)藥科技有限公司 上海 201202）