生龍娜雍 羅強 關(guān)仁梅 張明 劉巧 羅璠

【摘要】前期研究篩選到高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的明串珠菌T7，為探究T7產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)特性及產(chǎn)量，本實驗測定了菌株的生長曲線和pH曲線，通過硫酸銨鹽析粗提抑菌物質(zhì)，測定了代謝曲線和抑菌特性。以金黃色葡萄球菌為共培養(yǎng)菌，測定了在不同時間點進行共培養(yǎng)對T7產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：T7的抑菌物質(zhì)產(chǎn)生與菌體生長相關(guān)，在24h時產(chǎn)量最高。T7所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對除α-淀粉酶以外的蛋白酶均有部分敏感性，在pH5.0-10.0均有較高的穩(wěn)定性。當其與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時，均能刺激T7產(chǎn)生更高產(chǎn)量的抑菌物質(zhì)，其中在T7單獨培養(yǎng)至24h時進行共培養(yǎng)刺激產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)最多。

【關(guān)鍵詞】生長曲線;抑菌特性;代謝曲線;共培養(yǎng)

【中圖分類號】R-1【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）04-001-04

引言

乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類小分子質(zhì)量、安全無毒的抗菌肽，它能抑制或殺死食物中多數(shù)革蘭氏陽性致病菌和腐敗菌且具有良好的熱穩(wěn)定性[1-2]。根據(jù)細菌素的理化性質(zhì)以及氨基酸結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為四類但目前只有乳酸鏈球菌素（nisin）被允許廣泛應用于食品防腐和保鮮，主要原因是其他細菌素大多存在產(chǎn)量低、酸堿耐受性差、抑菌時效短、抑菌譜窄和抑菌機理不明確等因素[3]，不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。

如何提高乳酸菌細菌素的產(chǎn)量始終是乳酸菌研究領域的熱點，通常伴隨細菌素合成的是一簇基因的共同表達，可通過細菌素自誘導、共培養(yǎng)誘導等一系列條件來啟動產(chǎn)乳酸菌細菌素相關(guān)基因的表達，從而利用誘導物的調(diào)控來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量。易華西[4]等以發(fā)酵上清液、吸附-解吸法得到的發(fā)酵液和陽離子交換得到的發(fā)酵液分別加到培養(yǎng)體系中，三種不同條件下得到的上清液均對細菌素的合成有刺激作用，說明細菌素的產(chǎn)生存在自我誘導現(xiàn)象。塔娜[5]等研究了糞腸球菌在不同菌體密度下細菌素H抑菌活性的變化規(guī)律，證實了細菌素H受到了群體感應機理的調(diào)控。

乳酸菌T7是一株前期從發(fā)酵乳中分離得到一株具有較強抑菌能力的乳酸菌株T7。本研究主要擬分析其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)特性，并采用共培養(yǎng)的方法，探討在種群壓力下其抑菌物質(zhì)產(chǎn)生有無變化，希望尋找刺激菌種高產(chǎn)細菌素的方法，以期為乳酸菌T7細菌素的進一步開發(fā)利用提供前期技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗菌株

明串珠菌T7分離自藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳，前期實驗證明其高產(chǎn)抑菌物質(zhì);，金黃色葡萄球菌ATCC 25923購于成都鵬世達實驗用品有限公司。

1.1.2試驗試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司;硫酸銨，聚已二醇-20000、甘油、Tris-HCL、乳酸、鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉：上海生工生物工程有限公司;蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α—淀粉酶：德國 Biofroxx公司。所用試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆液體（TBS），培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設備

ST16R高速冷凍離心機：賽默飛世爾有限公司;R40-IIB2超凈工作臺：上海蘇凈實業(yè)有限公司;Tanon2500 凝膠成像系統(tǒng)：中國天能公司;GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司;GH6000電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津泰斯特設備有限公司;UV1900紫外可見分光光度計：上海佑科儀器;ELX-800酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的活化

取凍存的明串珠菌T7以5%接種量接種于滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，30℃活化24 h。

取保藏金黃色葡萄球菌菌液，以 2%接種量接入5 mL 滅菌胰蛋白胨大豆液體（TBS）培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)10 h備用。

1.3.2乳酸菌T7生長曲線及pH曲線測定

取活化后的明串珠菌T7，以5 %接種量接種于100 mL的滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h并進行間隔取樣，在600 nm波長下測定OD值，同時使用pH計準確測定pH值。

1.3.3T7發(fā)酵上清液制備

取活化菌株以5 %的接種量于100 mLMRS液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)適當時間，在4 ℃ 6000 r/min離心10 min，去除菌體細胞，制備發(fā)酵上清液。

1.3.4鹽析法制備粗提物

在上清液中加入硫酸銨至終濃度達到60 %，4 ℃靜置過夜，10000 r/min 4 ℃離心10 min收集沉淀，用10 mL PBS重溶，轉(zhuǎn)至截留量3400Da的透析袋除鹽后濃縮至10ml保存。

1.3.5明串珠菌T7細菌素的特性及共培養(yǎng)的影響

1.3.5.1抑菌活性測定

采用平板打孔法測定抑菌活性，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌。

1.3.5.2抑菌物質(zhì)產(chǎn)生曲線

在1.3.2的菌株培養(yǎng)過程中，在0h，8h，12h，16h，20h，24h，30h分別取一瓶培養(yǎng)液，制備粗提物，測定不同培養(yǎng)時間抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生量。

1.3.5.3pH穩(wěn)定性檢測

取粗提取物10ml，均分為10份，將其pH調(diào)為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0共10個梯度，室溫處理1h后調(diào)至pH6.0，測定抑菌活性。

1.3.5.4不同酶對粗提物抑菌活性的影響

取7ml素粗提物，均分為7份，將其中6份調(diào)節(jié)pH值到各酶的最適pH，加入1mg/ml的酶液，室溫處理1h，然后調(diào)節(jié)pH至6.0，以經(jīng)相同處理但不加入酶的樣品為對照做抑菌活性測定。

1.3.5.5不同共培養(yǎng)條件對抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

乳酸菌T7培養(yǎng)過程中在不同培養(yǎng)時間點加入金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，添加時間點如下表。其中，金黃色葡萄球菌（OD600=1.0）添加量為0.5﹪，以不添加金黃色葡萄球菌作為空白對照，培養(yǎng)至36h測定抑菌活性。

1.4.0數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以3 次重復的表示，使用SPSS v24.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Graphpad prism 8.0軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1T7的生長曲線圖和pH曲線圖

如圖1所示：乳酸菌T7接種后，約在4h進入對數(shù)生長期，在24h左右進入穩(wěn)定期。而發(fā)酵液的pH整體呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，在對數(shù)生長期產(chǎn)酸量大，pH下降明顯，進入穩(wěn)定期后pH變化趨緩。多數(shù)研究表明，細菌素的產(chǎn)生與其菌株生長具有關(guān)聯(lián)。 章檢明等[6]報道的植物乳桿菌 B23培養(yǎng)時間至12-16 h，p H=7時，最有利于細菌素Lac-B23合成;榮梓嫻等[7]報道的產(chǎn)細菌素屎腸球菌 TRS5在37℃，培養(yǎng)至24 h，pH為6.5時，其細菌素生成量達到最大。

2.2代謝曲線測定

將不同時間段取出的培養(yǎng)液處理得到的粗提取物進行抑菌試驗，結(jié)果如圖2所示：乳酸菌T7細菌素粗提物在24h時產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)最多，隨著培養(yǎng)時間增長，其，抑菌物質(zhì)產(chǎn)量略有下降。研究表明，不同來源細菌素達到最大產(chǎn)量的時間差異較大，張炎等[8]報道的Lactobacillus paracasei細菌素 24h發(fā)酵產(chǎn)量最高，高鵬等[9]報道的Lactobacillus plantarum發(fā)酵 12h 最大，Perumal[10]等研究的Enterococcus faecalis 細菌素在20 h產(chǎn)量達到最大。

2.3抑菌活性的pH穩(wěn)定性

T7產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖3：從結(jié)果可知，乳酸菌T7發(fā)酵液粗提物較穩(wěn)定，在pH 2-11的范圍內(nèi)均有抑菌活性。在pH5.0-10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性最高，在強酸條件下，穩(wěn)定性最差。Kumar等[11]從芒果泡菜中篩選到的干酪乳桿菌LA-1所產(chǎn)細菌素在pH酸性條件下穩(wěn)定性較差，在pH為6.5時穩(wěn)定性達到最強。張明[12]等研究屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵上清液在不同pH條件處理下的抑菌效果是該菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)在弱酸性條件下較穩(wěn)定，而在堿性條件下不穩(wěn)定。

2.4酶的影響

選取α-淀粉酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶在最適條件下分別對乳酸菌T7抑菌物質(zhì)粗提液處理后，結(jié)果如圖4所示：α-淀粉酶與對照無明顯變化，說明該粗提物里無糖類成分，其他蛋白酶處理后，抑菌活性均有下降，說明粗提物中含有蛋白質(zhì)成分，初步證明該抑菌物屬于細菌素類。結(jié)果顯示粗提物用蛋白酶k處理后，仍具有一定抑菌活性，說明該物質(zhì)中含有非蛋白成分。因不同的細菌素氨基酸組成與結(jié)構(gòu)存在差異，所以其對不同蛋白酶的敏感性也有差別。如Lactobacillus plantarum[13]細菌素活性對胃蛋白酶、α-凝乳酶有較強的耐受性，Enterococcus faecalis[14]所產(chǎn)細菌素對胰蛋白酶不敏感，但對胃蛋白酶和蛋白酶 K敏感。

2.5不同共培養(yǎng)條件對細菌素產(chǎn)量的影響

由圖5結(jié)果可見，在不同時間加入金黃色葡萄球菌進行共培，均促使T7的抑菌物質(zhì)產(chǎn)量增加，在T7培養(yǎng)到24 h加入金黃色葡萄球菌共培后，T7最終產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的量最大，其抑菌圈直徑達到了22.1±0.9。許多研究證明，細菌物質(zhì)的產(chǎn)生依賴于菌體密度，受到群體感應系統(tǒng)的影響，王筱夢[15]的研究結(jié)果也證實了這一點。

3結(jié)論

隨著對細菌素的深入研究， 生物防腐劑廣泛應用于食品工業(yè)成為大趨勢，這不僅會給消費者提供更安全更健康的食品， 而且會為食品工業(yè)帶來一場重要的變革。本研究從乳酸菌T7中初步提取出其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，對其抑菌特性進行了研究，證明該種抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，有較好的pH穩(wěn)定性，該種抑菌物質(zhì)的代謝與菌體生長直接相關(guān)，可能受到菌體密度的調(diào)節(jié)，當T7與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時，其抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生會受到誘導，提示T7可能存在群體感應系統(tǒng)。

本研究對細菌素的抑菌作用進行了部分探討，但細菌素的作用機制、合成及分泌運輸還可進一步研究。雖然細菌素具有高效性、安全性、應用范圍廣、其添加不改變產(chǎn)品風味和病原菌對其不易產(chǎn)生抗性等諸多優(yōu)點，也已廣泛應用于醫(yī)學治療、食品防腐和飼料業(yè)等，但其產(chǎn)量低、易失活、敏感細胞抗性的出現(xiàn)、尋找專一性的細菌素等諸多困難問題有待我們?nèi)ヌ骄拷鉀Q。

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作者簡介：生龍娜雍（1997-6），性別：女，民族：藏族，籍貫：四川康定，學歷：在讀碩士，單位：西南民族大學，研究方向：食品微生物，單位所在省市和郵編：四川成都 610041

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金優(yōu)秀學生培養(yǎng)工程項目（0217-3300220345）

通訊作者：羅璠，副教授，E-mail： luofany77@163. com

1.西南民族大學?食品科學與技術(shù)學院?四川 成都?6100412.西南民族大學 畜牧獸醫(yī)學院?四川成都 610041