鄭世茂 齊文武 陳曉云 白云昇 龐欣

摘?要：目的：探究模擬空間誘變處理后，生長速率提高的釀酒酵母細(xì)胞的誘變機(jī)制。方法：采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)對模擬空間誘變處理前后的釀酒酵母進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討對照組與誘變組在蛋白質(zhì)組表達(dá)水平上的差異，以及受影響的生物功能。結(jié)果：共鑒定到764個(gè)差異蛋白，占檢測蛋白總數(shù)的15.54%。其中，上調(diào)差異表達(dá)蛋白378個(gè)、下調(diào)差異表達(dá)蛋白386個(gè)，主要涉及細(xì)胞核、線粒體、核糖體和質(zhì)膜等重要細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)論：提高重要代謝的效率、降低DNA修復(fù)功能與環(huán)境防御能力，可能是模擬空間誘變提高釀酒酵母細(xì)胞生長速率的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：模擬空間誘變;釀酒酵母;蛋白質(zhì)組學(xué);iTRAQ

空間誘變育種是近年來興起的一種新型誘變技術(shù)?？臻g環(huán)境能夠影響微生物的生物學(xué)形態(tài)和表型，是微生物誘變育種的有效方法[1]，但現(xiàn)階段實(shí)施空間誘變?nèi)杂兄T多限制，此時(shí)模擬空間誘變就成為一個(gè)非常好的選擇。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，傳統(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，是發(fā)酵中最常用的菌株。同位素標(biāo)記相對與絕對定量（iTRAQ）技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)之一，該方法幾乎可以對任何蛋白樣品進(jìn)行定量分析，具有可定量、高精度、高通量等特點(diǎn)，可在一次試驗(yàn)中對8個(gè)樣品進(jìn)行定量比較，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于微生物、植物、動物、人體細(xì)胞定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[2-5]。但是，目前針對模擬空間誘變前后的酵母蛋白組學(xué)分析與研究國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)采用iTRAQ技術(shù)對模擬空間誘變后樣品與對照組樣品進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異比對，進(jìn)行GO功能注釋、KEGG Pathway代謝通路分析、KOG注釋與亞細(xì)胞定位預(yù)測，比較模擬空間誘變前后釀酒酵母在蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的差異，進(jìn)而分析引起誘變后酵母生長速率提高的可能的機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?材料

出發(fā)菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AS 2.430，誘變菌株為出發(fā)菌株在模擬空間誘變環(huán)境參數(shù)（包括但不限于真空、振動、加速度等）下篩選出的生長速率提高12.27%的菌株S.c_11。YPD液體培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。

島津LC-20AB液相系統(tǒng)（分離柱為5 μm 4.6 mm×250 mm Gemini C18柱）;Thermo公司UltiMate 3 000 UHPLC、trap柱、自裝C18柱（75 μm內(nèi)徑，3 μm>粒徑，25 cm柱長）;質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X。SDSL3、含EDTA的蛋白酶抑制劑Cocktail、DTT、丙酮、碘乙酰胺溶液、Tissue lyser、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙醇、乙酸、胰蛋白酶、iTRAQ Reagents -?8plex kits 異丙醇、TRAB溶液、流動相A（5%ACN，pH 9.8）、流動相B（95% ACN，pH 9.8）、流動相C（2% ACN，0.1%FA）、流動相D（98%ACN，0.1% FA）。

1.2?蛋白質(zhì)提取

將酵母菌出發(fā)菌株和誘變菌株于斜面試管培養(yǎng)后分別接種于YPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，各設(shè)置4個(gè)平行樣，在32 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h得對照組與誘變組發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)低溫離心后收集酵母細(xì)胞，用滅菌預(yù)冷的PBS洗滌3次，獲得8個(gè)菌體樣品。提取蛋白過程中如未特殊說明，試驗(yàn)則在4 ℃下進(jìn)行操作。稱取適量樣品，加500 μL含SDSL3的Cocktail，靜置反應(yīng) 5 min，加入終濃度10 mmol/L DTT溶液;超聲、離心取上清液;加入5倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃冰箱放置過夜，離心去上清液獲取沉淀;風(fēng)干沉淀，加入適量的Cocktail溶解蛋白;離心后取上清液;加終濃度為10 mmol/L的DTT溶液，56 ℃中水浴1 h，保證充分反應(yīng);加入終濃度55 mmol/L的碘乙酰胺溶液，暗室放置45 min;加入5倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃冰箱放置2 h，離心獲取沉淀;風(fēng)干沉淀，加入適量的Cocktail溶解蛋白，離心后取蛋白質(zhì)上清液[6]。

1.3?蛋白定量

采用Bradford定量方法定量[7]：在96孔酶標(biāo)板A1～A10位置依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白 （0.2 μg/μL BSA）0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，之后依次加入純水20、18、16、14、12、10、8、6、4、2 μL，之后各孔加入考馬斯亮藍(lán)G-250定量工作液180 μL。用酶標(biāo)儀測量OD595，依據(jù)OD595與蛋白濃度制作線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋待測蛋白質(zhì)溶液若干倍，在20 μL蛋白溶液中加入180 μL定量工作液，讀取OD595。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品OD595計(jì)算樣品蛋白濃度。其中，對照組4個(gè)生物重復(fù)樣品為S.c_1、S.c_2、S.c_3、S.c_4，誘變組4個(gè)生物重復(fù)樣品為S.c_11_1、S.c_11_2、S.c_11_3、S.c_11_4。

1.4?蛋白酶解

8個(gè)樣品各取100 μg蛋白溶液;按蛋白∶酶=40∶1的比例加入胰蛋白酶2.5 μg，37 ℃酶解4 h;加酶循環(huán)1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h;肽段除鹽并真空抽干。

1.5?肽段標(biāo)記

取出一定量iTRAQ標(biāo)簽試劑并恢復(fù)至室溫，各管試劑加入50 μL異丙醇，渦旋振蕩混勻后低速離心;用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品，并加入到對應(yīng)iTRAQ標(biāo)簽試劑中，不同樣品肽段選用不同的iTRAQ標(biāo)簽，靜置2 h充分反應(yīng)。

1.6?肽段分離

采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)對樣品進(jìn)行液相分離。用2 mL流動相A復(fù)溶抽干的肽段樣品并進(jìn)樣，以1 mL/min的流速梯度洗脫：5%流動相B 10 min，20%流動相B 40 min，95%流動相B 1 min，流動相B持續(xù)3 min，5%流動相B平衡10 min。在214 nm波長下監(jiān)測洗脫峰并每分鐘收集1個(gè)組分，結(jié)合色譜洗脫峰圖合并樣品得到20個(gè)組分，然后冷凍抽干[8]。

1.7?納升高效液相分離

將抽干的肽段樣品用流動相C復(fù)溶，20 000 g離心10 min后，取上清進(jìn)樣。通過HPLC進(jìn)行分離。樣品首先進(jìn)入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下有效梯度進(jìn)行分離：0～5 min，5% 流動相D;5～45 min，流動相D從5%升至25%;45～50 min，流動相D從25%升至35%;50～52 min，流動相D從35%升至80%;52～54 min，80%流動相D;54～60 min，5%流動相D。

1.8?質(zhì)譜檢測

經(jīng)過HPLC分離的肽段離子化后進(jìn)入到與之串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X進(jìn)行DDA（data-dependent acquisition）模式檢測。

1.9?蛋白質(zhì)鑒定與定量分析

使用軟件Mascot 2.3.02進(jìn)行蛋白鑒定，質(zhì)譜數(shù)據(jù)與UniProt數(shù)據(jù)庫比對搜索得到最終的蛋白鑒定結(jié)果。篩選包含至少1個(gè)可信的特異性肽段的蛋白。采用IQuant軟件[9]以Mascot Percolator算法[10]進(jìn)行iTRAQ數(shù)據(jù)定量。分別在譜圖/肽段水平與蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行1% FDR的過濾（PSM-level FDR≤0.01），從而獲得顯著性鑒定的譜圖和肽段列表。利用肽段進(jìn)行蛋白組裝，并產(chǎn)生一系列的蛋白組。

1.10?生物信息學(xué)分析

對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO、KEGG Pathway富集分析與KOG注釋，使用WoLF PSORT軟件[11]實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測。

2?結(jié)果與分析

2.1?蛋白質(zhì)定量結(jié)果

對照組與誘變組經(jīng)Bradford定量法定量，結(jié)果見表1。

2.2?蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot 2.3.02利用UniProt數(shù)據(jù)庫比對鑒定樣本中的蛋白質(zhì)。對照組4個(gè)生物重復(fù)樣品與誘變組4個(gè)生物重復(fù)樣品，共進(jìn)行1次重復(fù)試驗(yàn)。對有生物重復(fù)的比較而言，在生物重復(fù)配對情況下，最終差異蛋白需至少在1次配對重復(fù)中被定義為差異蛋白。此次試驗(yàn)共鑒定到4 916個(gè)蛋白質(zhì)，包含764個(gè)差異蛋白質(zhì)，占檢測蛋白總數(shù)的15.54%。其中，上調(diào)蛋白數(shù)目378個(gè)、下調(diào)蛋白數(shù)目386個(gè)。鑒定到的所有蛋白的分子量分布情況見附圖，其中X軸為蛋白質(zhì)分子量范圍（kDa），Y軸為相應(yīng)蛋白比例。

2.3?生物信息學(xué)分析

2.3.1?差異蛋白基因本體論（GO）富集分析?GO富集分析給出了差異蛋白顯著富集的GO條目，對差異蛋白涉及的分子功能、細(xì)胞組分、生物過程進(jìn)行分析。檢測到的764個(gè)差異蛋白，參與的分子功能有10個(gè)，其中主要功能有催化活性、結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子功能調(diào)節(jié)等;參與構(gòu)成的細(xì)胞組分有12個(gè)，主要有細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、細(xì)胞器組分、大分子復(fù)合物等;參與的生物過程有19個(gè)，主要有細(xì)胞過程、代謝過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)節(jié)、定位、應(yīng)激反應(yīng)、生物過程調(diào)控等（表2、表3）。

2.3.2?差異蛋白KEGG Pathway富集分析?KEGG數(shù)據(jù)庫中主要的數(shù)據(jù)庫有4個(gè)，分別為Pathway、Genes、Ligand、Brite[12]，其中KEGG Pathway以圖形代替文字直觀地描述各種代謝途徑以及各途徑之間的關(guān)系。經(jīng)KEGG Pathway分析，本次試驗(yàn)有658個(gè)差異蛋白參與了111條生物信號通路（表4）。

2.3.3?差異蛋白KOG注釋分析?KOGs數(shù)據(jù)庫是一種常用的蛋白功能注釋數(shù)據(jù)庫，每個(gè)KOG條目都包含一系列直系同源蛋白或旁系同源蛋白。此次KOG注釋分析將所有鑒定到的差異蛋白BLAST比對KOG數(shù)據(jù)庫，得到相應(yīng)的KOG注釋結(jié)果。750個(gè)顯著差異蛋白參與了能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，糖類運(yùn)輸和代謝，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯，RNA加工和修飾，輔酶運(yùn)輸與代謝，無機(jī)離子的運(yùn)輸與代謝，次級代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生物反應(yīng)過程（表5）。

2.3.4?差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測?蛋白質(zhì)合成后，經(jīng)信號引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)被分泌到細(xì)胞外部、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或者進(jìn)入特定的細(xì)胞器中，翻譯后的蛋白只有到達(dá)正確的部位才能發(fā)揮其功能，參與細(xì)胞的各種生命活動。因此，進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是對差異蛋白功能注釋的重要部分。本次試驗(yàn)采用WoLF PSORT軟件實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測。764個(gè)差異蛋白被預(yù)測出現(xiàn)在12個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，其中最主要的結(jié)構(gòu)有細(xì)胞核（34.82%）、細(xì)胞液（27.23%）、線粒體（18.98%）、細(xì)胞外（5.37%）、質(zhì)膜（4.58%）等。

3?結(jié)論

經(jīng)過模擬空間誘變，釀酒酵母的差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞核、線粒體、核糖體和質(zhì)膜等主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，涉及氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核苷酸、核酸等重要代謝過程;通過提高DNA復(fù)制，mRNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)維持等代謝過程效率。Rad50是一種參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的蛋白質(zhì)，對于DNA雙鏈斷裂修復(fù)非常重要。Rad50蛋白在模擬空間誘變后的菌種中含量提升，這可能是釀酒酵母經(jīng)模擬空間環(huán)境篩選出的優(yōu)勢菌株，但是在正常生產(chǎn)條件下并無輻射等誘變因素使得DNA雙鏈斷裂，因此，Rad50蛋白含量的增加對正常生產(chǎn)條件下的釀酒酵母菌株影響并無積極影響[13]。蛋白HSM3與DNA裂解酶APN1分別在DNA錯(cuò)配修復(fù)與切除修復(fù)中起重要作用，這兩種蛋白的下調(diào)可能會引起突變率的提高，但同時(shí)減少了DNA修復(fù)時(shí)間，使得DNA復(fù)制速率有所提高[14]。海藻糖作為酵母重要的抗逆因子具有重要的抗逆作用，生物合成海藻糖的關(guān)鍵酶是海藻糖-6-磷酸合成酶TPS1[15]。誘變后酵母細(xì)胞TPS1下調(diào)，其抗逆能力也隨之下降。由此可見，細(xì)胞是通過降低其對DNA復(fù)制后的修復(fù)能力與環(huán)境防御能力來提高生長速率的。但是誘變后的釀酒酵母有關(guān)DNA修復(fù)和環(huán)境防御部分的相關(guān)蛋白含量下調(diào)，這一變化對其突變與生長的意義及所帶來的影響還需要進(jìn)一步研究。

4?討論

從20世紀(jì)60年代開始，國內(nèi)外研究人員就利用返回式衛(wèi)星或飛船搭載微生物菌種，獲得了多種地面難于得到的優(yōu)良菌株[16]。實(shí)驗(yàn)室近些年通過模擬空間誘變獲得了一些生長速率加快的菌株，但均停留在現(xiàn)象研究上，深入的機(jī)理研究十分匱乏。本研究檢測到的764個(gè)差異表達(dá)蛋白，涉及的多為較重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量代謝與信號過程。上調(diào)蛋白涉及細(xì)胞核中染色質(zhì)、核仁核孔復(fù)合體等重要成分，還有細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中核糖體的大亞基與小亞基成分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重要成分、高爾基體膜組成成分、細(xì)胞骨架成分、細(xì)胞質(zhì)膜等，這些蛋白的上調(diào)為釀酒酵母的快速生長提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。上調(diào)蛋白還涉及線粒體中線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)、膜間空間、呼吸鏈中電子傳遞的酶復(fù)合物、V-型與F-型質(zhì)子泵等重要成分，這些蛋白上調(diào)為釀酒酵母的快速生長提供了能量基礎(chǔ)。上調(diào)蛋白中涉及的重要生物過程包括糖類代謝過程、氨基酸合成過程、核苷酸代謝過程、脂類的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)、輔助因子與中間產(chǎn)物生物合成、產(chǎn)能代謝過程;蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)的正調(diào)節(jié)，其中包括組蛋白乙?；cH2B泛素化的正調(diào)控相關(guān)蛋白，組蛋白乙?；琀2A、H2B、H3、H4的10個(gè)以上的賴氨酸修飾位點(diǎn)[17]，組蛋白H2B泛素化是RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄Ⅱ所必需的[18];DNA復(fù)制，RNA加工處理，細(xì)胞骨架形成與維持，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過程;cAMP合成過程，Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)途徑。

下調(diào)蛋白包括轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控蛋白、染色質(zhì)沉默過程相關(guān)蛋白;DNA修復(fù)蛋白，含切除修復(fù)與錯(cuò)配修復(fù)等相關(guān)蛋白，如蛋白HSM3與DNA裂解酶APN1，DNA修復(fù)相關(guān)蛋白減少，這可能是誘變后酵母DNA復(fù)制過程中以犧牲復(fù)制準(zhǔn)確率為代價(jià)來快速復(fù)制DNA的機(jī)制;細(xì)胞骨架的解聚過程相關(guān)蛋白，有助于維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)以及保證各種細(xì)胞器與生物大分子分布正常;環(huán)境防御相關(guān)蛋白如TPS1。這些蛋白涉及的生物過程與細(xì)胞的生存有關(guān)，但是并非細(xì)胞所必需，這可能是釀酒酵母細(xì)胞為應(yīng)對模擬空間誘變這一逆境而啟動的生物效應(yīng)。

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