池肇春

池肇春,青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科 山東省青島市 266011

0 引言

藥物是人類為預防、診斷或治療疾病,或為改善生理功能和提高健康水平.隨著用藥種類增多,又常常缺乏正規(guī)的用藥方法,因此由藥物引起的不良反應的發(fā)生率居高不下.藥物性肝損傷如此常見,追究其原因除藥物質量低劣外,不合理用藥是主要原因,包括藥物的濫用、誤用、患者及其家屬的醫(yī)藥素質知識水平低等.此外還有缺乏科學管理、醫(yī)德醫(yī)風等社會問題.因此加強藥物管理,提高用藥的安全性,減少不良反應的發(fā)生率勢在必行.鑒于上述原因有必要對近幾年藥物性肝損傷的現(xiàn)狀和進展作一介紹和評述,為我國做好藥物性肝損傷的防治搭建一個學習平臺.

1 發(fā)病率、分類

我國藥物不良反應發(fā)生率約占住院患者的10%-30%.目前人類正暴露于6萬種以上化學物質的威脅下,藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)約占黃疸住院患者的2%-5%,占所謂“急性肝炎”住院患者的10%,占老年肝病的20%.盡管臨床上藥物性肝損傷屢見不鮮,但尚未引起人們和臨床醫(yī)師足夠和廣泛的重視.根據(jù)《國家藥品不良反應監(jiān)測年度報告(2020年)》化學藥品占83.0%、中藥占13.4%、生物制品占1.1%、無法分類者占2.5%,其中嚴重不良反應占10.6%.不良反應事件中,累及器官系統(tǒng)排名前3位依次為胃腸系統(tǒng)疾病、皮膚及皮下組織類疾病、疾病及給藥部位各種反應.在歐美國家DILI約占急性肝功能衰竭病因 的30%-40%,而在美國36%的DILI為非類固醇類抗炎藥引起.據(jù)統(tǒng)計,藥物消化道的不良反應占全部藥物不良反應的20%-40%,藥物性肝損傷的發(fā)生率僅次于皮膚、黏膜損害和藥物熱.2007年年底中華醫(yī)學會中華肝臟病學分會成立了藥物性肝病學組,這為我國藥物性肝損傷的防治提供了組織和技術保證[1].

藥物性肝損傷占腸胃內(nèi)科醫(yī)生所見急性肝損傷的＜1%,是美國和歐洲急性肝衰竭最常見的原因[2].占美國所有急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)病例的一半以上.根據(jù)法國和冰島的調(diào)查,DILI的年發(fā)病率約為每10萬居民14至19人[3].DILI也是藥物開發(fā)中化合物消耗的主要原因之一,也是藥物撤回、限制和項目終止的兩個最常見的原因之一.事實上很難確定DILI的真正發(fā)病率.盡管人們對肝毒性的認識不斷提高,而且毒性較低的替代品也越來越多,但隨著處方數(shù)量和可用藥物范圍的增加,肝藥物反應的絕對頻率似乎并未降低[4,5].

根據(jù)藥物不良反應的臨床藥理作用的關系將藥物性肝損傷分為:(1)A型不良反應(內(nèi)源性肝毒素,DILI):主要是由于藥理作用過強所致,通常與劑量有關,可以預測停藥或減量后癥狀很快減輕或消失,在人群中的發(fā)生率雖高,但死亡率低;(2)B型不良反應(特異的肝毒素,特異性藥物性肝損傷,IDILI):是與正常藥理應用完全無關的異常反應,與劑量無關,一般難以預測,常規(guī)毒理學篩查難以發(fā)現(xiàn),但死亡率高.大多數(shù)導致ALF引起的DILI病例是由于過量使用醋氨酚,而醋氨酚被認為是一種“內(nèi)在的”肝毒素.藥物所致的內(nèi)在肝毒性表現(xiàn)為對肝細胞的直接化學損傷、較短的潛伏期和明顯的劑量依賴性反應.內(nèi)源性肝毒素如果他們接受了足夠的過量,雖然毒性反應的閾值可以顯示出明顯的個體間的差異.但也會導致幾乎所有患者的肝臟損傷.

特異的(不可預測的)藥物性肝損傷(idiosyncratic drug induced liver injury,IDILI)是肝病學家面臨的最具挑戰(zhàn)性的肝臟疾病之一,因為臨床上使用了大量的藥物,可用的草藥和膳食補充劑具有潛在的肝毒性,這種疾病表現(xiàn)出多種臨床和病理表型的能力以及目前缺乏特定的生物標志物.這使得藥物性肝損傷的診斷是一個不確定的過程,因此,需要對病情有高度的認識,并仔細排除肝病的其他病因,以取得正確的診斷.特異性肝毒性可能是嚴重的,導致特別嚴重的各種急性肝功能衰竭,目前還沒有有效的治療方法[6].IDILI只在極少數(shù)接受治療的個體中引起重大的DILI,發(fā)生率通常不到1/10000.雖然罕見,然而IDILI事件有很大的肝衰竭風險.雖然似乎需要一個劑量閾值來誘發(fā)IDILI,但在大多數(shù)接受治療的患者中,過量通常不會產(chǎn)生肝臟毒性[5].從治療開始到IDILI發(fā)作,往往有較長的潛伏期.

2 風險因素

2.1 宿主依賴性危險因素

2.1.1 年齡:據(jù)報道,嚴重藥物不良反應(severe adverse drug reaction,ADRs)的發(fā)生率隨著年齡的增長而上升.老年人中很大一部分ADRs與劑量有關,可能是由于年齡增長與藥物清除障礙有關.老年人也被認為是DILI的一個一般風險因素.事實上,從DILI大型前瞻性登記處獲得的數(shù)據(jù),不要認為年齡越大是一個普遍的危險因素.在西班牙DILI登記處,46%的DILI患者在發(fā)病時≥60歲,美國DILI報告16.6%的DILI患者為65歲或以上[5].然而,冰島一項基于人口的研究數(shù)據(jù)顯示,DILI發(fā)病率隨著年齡的增長而明顯增加,其中15-29歲患者的發(fā)病率為9/100000,70歲以上患者的發(fā)病率為41/100000.年齡對DILI感染發(fā)生率的影響與藥物使用的增加是平行的,這表明年齡本身可能不會增加DILI感染的風險,而是老年人通常服用更多的藥物所致.

然而,年齡似乎影響了由特定病原體引起的DILI感染的風險.回顧性數(shù)據(jù)庫評估,在美國,377名接受異煙肼治療的成年人發(fā)現(xiàn),35-49歲患者的肝毒性病例幾乎是25-34歲患者的兩倍,50歲以上患者的肝毒性病例幾乎是25-34歲患者的5倍.有人推測,改變的藥代動力學和/或累積的線粒體功能損害可能是老年患者異煙肼相關肝損傷的發(fā)生率更高的原因[7].相反,年輕似乎是丙戊酸鈉誘發(fā)DILI的危險因素,10歲以下兒童發(fā)生DILI的風險更高,2歲以下兒童發(fā)生致命性結局的風險最高,可能是由于與藥物代謝的差異和血漿蛋白結合的減少有關.

除易感性外,年齡似乎對DILI表型也有影響,年輕患者更常發(fā)生肝細胞損傷,而老年患者更容易發(fā)生膽汁淤積型損傷.此外,年齡越大,發(fā)生持續(xù)性/慢性肝臟生化異常的DILI風險越高,這可能是由于年齡越大,組織修復功能下降所致[8,9].

2.1.2 種族:種族對個體藥物反應的影響主要歸因于不同種族人群中單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNPs)的差異.最近的一項對列研究報告了不同種族人群中導致DILI的藥物有顯著差異.在非裔美國人中,甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、甲基多巴和苯妥英鈉更常是DILI的病因,而在高加索人中,阿莫西林-克拉維酸鹽是一種明顯較高比例的病原體[10].盡管這些變異可能與遺傳因素有關,但同樣,這些藥物的適應證等因素也與此有關,因為處方模式的變化可以解釋不同人群之間的差異.相反,非裔美國人發(fā)生嚴重皮膚反應的頻率明顯高于白人,在控制選定的協(xié)變量后,住院率、肝移植率或肝相關死亡率也明顯高于白人.

對研究藥物代謝酶(drug-metabolising enzyme,DME)多態(tài)性與抗結核治療藥物性肝損傷(TBC-DIL)風險的候選基因研究結果的meta分析顯示,N-乙?；D移酶2(N-Acetyltransferase 2,NAT2)和DILI的單核苷酸多態(tài)性及1116例DILI(定義可變)和2655名對照者慢乙?；D移酶2(NAT2)基因型與東亞和中東血統(tǒng)人群患DILI的風險增加有關,但在高加索人中未發(fā)現(xiàn)相關性.相反,最近一項涉及印度抗TBC (antituberculosis) DILI病例和藥物暴露對照組的全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)未發(fā)現(xiàn)質疑NAT2基因型在確定DILI易感性中的作用的全基因組顯著信號[11].然而,考慮到后一項研究涉及大量表現(xiàn)為黃疸和腹瀉的患者因急性肝衰竭而導致死亡或肝移植,NAT2基因型可能主要影響發(fā)病的初始步驟.因此,在單純肝酶升高的人群中,它仍可能與DILI有關.

此外,某一特定族裔群體中危險等位基因的次要等位基因頻率可能解釋了不同群體對某種藥物繼發(fā)于DILI的易感性的一些差異.HLA-DRB1*15:02等位基因僅在0.7%的高加索人群中流行,而在南亞人群中流行率為13%-18%.最近的一份報告已經(jīng)確定HLADRB1*15:02-DQB1*06:01是南亞裔個體中阿莫西林-克拉維酸鹽相關性暴發(fā)性肝衰竭需要肝移植的潛在危險因素.藥物性肝損傷是抗結核藥物治療的并發(fā)癥,特別是在含異煙肼的治療方案中.為了調(diào)查遺傳危險因素,Kaliyaperumal等進行了一項全基因組關聯(lián)研究(GWAS),涉及抗結核DILI病例(55名印度人和70名歐洲人)和對照組(1199名印度人和10397名歐洲人).大多數(shù)病例采用標準抗結核藥物方案治療,均接受異煙肼治療.推測單核苷酸多態(tài)性和HLA基因型,并對GWAS和候選基因基因型進行跨種族Meta分析.GWAS只在歐洲人身上發(fā)現(xiàn)了一個顯著的關聯(lián)(Rs117491755).HLA中HLA-B*52:01有顯著性差異.N-乙酰轉移酶2 (NAT 2)的頻率較低(OR為0.69,95%CI為0.57-0.83,P=0.01).NAT 2*6和NAT 2*7以NAT 2*6和/或NAT 2*7的純合子為主(OR=1.89,95%CI:0.84-4.22,P=0.004).結果認為HLA基因型對結核病藥物相關性DILI的貢獻很小,NAT 2的貢獻是復雜的,但與以前的研究結果一致,NAT 2*5與NAT 2*6和NAT 2*7的代謝效應存在差異[12].

2.1.3 慢性肝病:慢性肝病可能與代謝減少和藥物清除有關的假設沒有強有力的證據(jù)支持.對酒精性肝病和代謝相關脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)的研究發(fā)現(xiàn),不同DME活性的誘導、下調(diào)或無變化的結果不一致[13],這些變異中的一些可能是由所研究的個體的不同程度的肝損傷所解釋的,而另一些則是由于所使用的方法所造成的,然而,還不能概括對于慢性肝病中肝功能對藥物處置的影響.最近一項涉及379名(包括128名慢性病毒性肝炎患者)接受抗結核(TBC)治療的回顧性研究發(fā)現(xiàn)HCV本身或與HBV結合與DILI的發(fā)病率增加有關[14].研究還表明,HIV感染可使抗TBC DILI的風險增加4倍,與HCV合并感染可使該風險增加14倍.

慢性肝病患者(16%)的死亡率明顯高于無肝病患者(5.2%).在107名慢性肝病患者(包括58名接受抗TBC治療的肝硬化患者)隊列中,17%的患者經(jīng)歷過DILI,其中24%患有慢性肝炎,15%患有代償性肝硬化[15].

2.2 藥物依賴性危險因素

2.2.1 劑量和肝藥物代謝:藥物劑量在內(nèi)源性DILI中起著至關重要的作用,DILI發(fā)生在服用過量藥物的患者身上,例如對乙酰氨基酚肝毒性.在推薦的每日劑量藥物治療后出現(xiàn)特異性DILI的事實最初導致人們相信特異性DILI是一種劑量無關的反應.1999年,Uetrecht強調(diào)了這樣一個事實:每天服用10 mg或更少的藥物是很少的,與特異性DILI的高發(fā)病率有關.藥物劑量在特異性DILI中起作用的觀點首次在向瑞典藥物不良反應咨詢委員會報告的598例瑞典DILI病例的研究中得到證實,發(fā)現(xiàn)77%的病例涉及劑量≥50 mg/天的病原體.此后,西班牙DILI登記處和冰島DILI全國性研究證實了推薦劑量≥50 mg/天的病原體占優(yōu)勢,在這兩個隊列中,這些病原體分別占77%和88%,也就是說,今天大部分的藥物需要＞50 mg/天的劑量才能達到預期的效果.因此,很難確定DILI的特異性是否與高劑量有關,或者DILI病例的高識別率是否是由于推薦劑量大于50 mg/天的藥物(例如抗生素)導致的.

然而,現(xiàn)在假設劑量實際上在特異性DILI中起作用,需要超過某種形式的閾劑量才能發(fā)生反應.然而,這種閾值劑量可能因個體而異[16].這一點在DILI案例中得到了證明,即患者對初始較低濃度的藥物有耐受性,但當需要增加劑量(仍在推薦的每日劑量范圍內(nèi))以獲得更好的藥理作用時,會出現(xiàn)DILI.此外,研究發(fā)現(xiàn),由每日劑量≥50 mg 的病原體誘發(fā)的DILI的潛伏期明顯短于服用低劑量藥物誘發(fā)的DILI[17].

除了劑量,肝臟藥物代謝被認為影響藥物的肝毒性潛力.大多數(shù)藥物都需要某種形式的生物轉化才能被消除,而且通常還需要生產(chǎn)活性藥物成分.這一過程通常需要形成反應性代謝物,這些代謝物可導致共價結合的半抗原和/或易感細胞環(huán)境中的細胞應激,從而引發(fā)或共同刺激產(chǎn)生適應性免疫應答的發(fā)展,從而導致DILI.藥物代謝特征與肝毒性潛在性之間的關系已有報道.一項對美國207種廣泛使用的口服藥物的分析發(fā)現(xiàn),肝代謝顯著(＞50%)的藥物有更高的ALT升高和肝衰竭的報告頻率.此外,發(fā)現(xiàn)具有顯著肝臟代謝和每日劑量＞50 mg的藥物具有顯著更大的肝毒性風險[18].

2.2.2 親脂性:眾所周知,親脂性(通常以辛醇-水分配系數(shù)的對數(shù)來衡量)會影響各種藥物相關方面,如藥效、藥代動力學和毒性,具有較高親脂性的藥物似乎增加了靶外結合,并增加了引起一般毒性事件的可能性.親脂性與每日劑量相結合,被稱為“二元法則”,被認為反映了藥物的潛在肝毒性.親脂性是化合物優(yōu)先在非極性脂介質中分配,而不在水相中分配的一種趨勢.它對藥物的其他屬性具有重要的決定作用.Log P為化合物油水分配系數(shù)P的對數(shù)值,指未解離的分子在油相與水相的分配平衡.在化合物的所有分子均以中性形式存在的pH條件下,其在一種有機相(例如辛醇)和一種水相(例如緩沖液)中分配系數(shù)的對數(shù)即為Log P.高親脂性(LogP ＞3)和每日劑量(＞100 mg)與DILI風險增加有關,根據(jù)對美國164種已批準藥物的分析,推測較高的親脂性可促進藥物進入肝細胞和隨后的肝代謝,從而增加活性代謝物的數(shù)量,可能會增加DILI的風險[19].親脂性藥物通常需要肝的代謝,因此,LogP可能只是廣泛生物轉化和肝臟暴露于活性代謝物的替代物.最近對5個公開藥物數(shù)據(jù)集的LogP、每日劑量和肝臟代謝程度的分析發(fā)現(xiàn),親脂性和肝臟代謝都是DILI的個體風險因素,當與劑量結合考慮時,風險增加[20].二元法則作為肝毒性預測工具,在支持藥物研究和開發(fā)方面的潛在適用性已在慢性丙型肝炎病毒感染的直接作用抗病毒藥物上得到證實[21].

2.2.3 反應性代謝物與氧化應激:反應性代謝物是已知的DILI發(fā)病的危險因素.在藥物開發(fā)過程中,通過共價蛋白結合體外人體肝臟模型評估反應性代謝物的形成.反應性中間體在反應性上表現(xiàn)出很大的差異,這反映了它們與蛋白質或其他分子結合的速度和選擇性有關.共價結合的可能后果是:(1)改變靶蛋白的功能或位置;(2)形成新抗原;或(3)沒有副作用或臨床影響.例如,如果只有很少的蛋白質被修飾.由于活性代謝物可以改變細胞蛋白質的功能和結構,因此被列為DILI的一個重要危險因素.除了它們的直接毒性作用外,反應性代謝物被認為是特異性DILI發(fā)病的第一步,因為共價結合的蛋白質形成免疫原性半抗原,可觸發(fā)下游免疫反應發(fā)生[22].

據(jù)Liver Tox數(shù)據(jù)庫估計,2000例接受治療的患者中約有1例出現(xiàn)急性肝損傷.形成反應性代謝物的肝毒性藥物包括非甾體抗炎藥(NSAID)雙氯芬酸布洛芬和萘普生、對乙酰氨基酚、托卡彭、奈法唑酮、扎魯司特、三苯氧胺、氟他胺,胺碘喹、磺胺甲惡唑、異煙肼、特比萘芬、非氨酸、氟烷和卡馬西平.另一份報告導致DILI的前10名藥物依次為:阿莫西林克拉維酸鹽、氟氯西林、阿托伐他汀、雙硫侖、雙氯芬酸、辛伐他汀、卡馬西平、布洛芬、紅霉素和合成代謝類固醇.在這10種藥物中,阿莫西林克拉維酸鹽的DILI病例數(shù)最高,合成代謝類固醇的病例數(shù)最低[23].

毒素直接作用于肝細胞可引起氧化性細胞器應激,如內(nèi)質網(wǎng)和線粒體應激,導致細胞凋亡或壞死.對乙酰氨基酚的肝毒性代謝物乙酰苯醌亞胺(acetylbenzoquinone imine,NAPQI)氧化蛋白質巰基并產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen,ROS).NAPQI和ROS損傷線粒體DNA,激活氨基末端激酶(N-terminal kinase,JNK)信號通路,進一步放大線粒體ROS的產(chǎn)生,導致線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的開放.MPT的開放導致ATP合成所需的線粒體膜電位崩潰,并導致膜間蛋白的釋放,從而引發(fā)壞死細胞死亡[24].

2.2.4 線粒體危害:線粒體毒性的例子是氟脲(fialuridine),一種引起微泡性脂肪肝和急性肝衰竭的核苷類似物.Fialuridine導致線粒體DNA缺失,慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)體重減輕、黃疸,胰腺炎和乳酸酸中毒.微泡性脂肪變性也見于胺碘酮、丙戊酸鈉、四環(huán)素和各種抗病毒核苷類似物,其特征是線粒體數(shù)量減少.患者表現(xiàn)為低血糖、高氨血癥和乳酸酸中毒,但ALT水平僅輕度升高[25].丙戊酸鈉抑制線粒體β-氧化脂肪酸和線粒體呼吸鏈,從而減少氧化磷酸化和消耗細胞內(nèi)ATP水平.這也會導致產(chǎn)生過量的活性氧,從而導致進一步的細胞損傷.

Aleo等人研究了美國食品與藥物管理局(FDA)的肝毒性知識庫(liver toxicity knowledge base,LTKB)中包含的72種化合物對線粒體呼吸的影響以及對人類 膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP)轉運活動的抑制.LTKB將可能引起DILI的藥物被歸類為:(1)大多數(shù)DILI相關藥物(盒裝警告或從實驗室撤回;(2)較少涉及DILI的藥物(標簽中提到DILI風險)和(3)不涉及DILI的藥物(標簽中沒有DILI指征)[26].通過結合臨床研究的因果關系評估和藥物標簽信息來改進DILI分類,以提高其準確性[27].具有雙重線粒體和BSEP抑制劑的效力,其與更嚴重的人類DILI高度相關,并且人對高度血漿藥物濃度(highest plasma drug concentration,Cmax)更敏感[26].

3 診斷

肝損傷的表型按R值分類,定義為谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)/ULN:ALP/ULN比值.≥5的R值提示肝細胞損傷、≤2提示膽汁淤積性損傷和2-5提示為混合型損傷[28].藥物性肝損傷(DILI)診斷檢查流程圖見圖1.

圖1 藥物性肝損傷診斷檢查流程.

3.1 傳統(tǒng)生化標記 近半個世紀以來,臨床和臨床中常用于檢測和管理藥物性肝損傷的血清標志物是丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和總膽紅素(total bilirubin,TBIL).丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)存在于肝細胞內(nèi),在急性藥物性肝損傷事件中,血清ALT和AST水平的升高與肝細胞死亡和釋放的速率密切相關.血清ALP升高通常表示對膽管膜或膽管上皮細胞的損傷.TBIL水平升高可反映肝臟功能損害或膽紅素生成(溶血)或加工改變.然而,這些傳統(tǒng)的血清標志物存在著一些缺陷.這些標記物中沒有一種是完全針對肝臟損傷的,也沒有提供對損傷模式的深刻理解.此外,當肝細胞損傷已經(jīng)發(fā)生時,ALT、AST等細胞損傷生物標志物被釋放到循環(huán)中,因此,在肝細胞損傷出現(xiàn)之前,這些生物標志物不能被用來鑒別藥物性肝損傷的潛在作用.此外,血清ALT/AST的升高可能發(fā)生在藥物治療期間,這些藥物不會對進行性肝損傷造成很大或任何風險(例如他汀類、肝素和膽堿).即使藥物能夠引起進展性和臨床上重要的肝損傷,大多數(shù)藥物引起的血清ALT和AST升高仍能得到控制解決[3].

Hy’s法則是評估肝臟特定實驗室參數(shù)時的基本經(jīng)驗法則,即當藥物性肝損傷出現(xiàn)血清ALT＞3×ULN,且血清TBIL＞2×ULN升高時,通常提示預后不良.經(jīng)實踐認識到血清ALT和AST在新藥物候選藥物臨床試驗中評估肝臟安全性的局限性,2009年美國食品與藥物管理局(FDA)指南將“Hy‘s法則”案例定義為最準確地預測到藥物可能導致急性肝衰竭.藥物性肝損傷的國際登記處證實,由于藥物導致的肝細胞性黃疸患者至少有10%的機會發(fā)展為肝衰竭[2,29].根據(jù)2014年由FDA/藥物評價與研究中心(CDER)主辦的DILI專題討論會,大會主席Senior談到新藥肝臟安全性評估與挑戰(zhàn)時指出:(1)肝損傷的嚴重程度不能僅依靠ALT水平確定,對于非常少見的事件,受試者操作特征曲線經(jīng)常失敗;(2)DILI不能僅通過血液生化檢測或肝活檢來進行診斷,而是要求掌握相關詳盡的臨床信息;(3)目前還沒有一種生物標志物足夠特異.

假設血清TBIL升高是由于肝細胞大量喪失而導致肝功能全面喪失所致.值得注意的是,在一個真正的Hy’s法則案例中,血清ALT和TBIL的聯(lián)合升高并不是預測嚴重肝損傷可能性的生物標志物,而是證明在這一課題中發(fā)生了嚴重和潛在威脅生命的肝損傷的生物標記物.

解釋Hy’s法則案例的一個挑戰(zhàn)是,藥物可能會導致血清TBIL升高,原因不是全面的(整體的)肝功能障礙的損害.其原因包括溶血(血紅素負荷增加)、藥物對轉運膽紅素的攝取或流出蛋白的抑制,或抑制與膽紅素結合的主要肝細胞酶(hepatocyte enzyme that conjugates bilirubin,UGT1A1).最近,定量系統(tǒng)藥理學已被應用于評估一種藥物對肝臟暴露的估計,以及藥物對抑制轉運蛋白和UGT1A1的量化效應.離體系統(tǒng)這一方法提高了對藥物引起的血清TBIL升高的認識和預測,而不是由于全面的肝功能障礙所致[29].

最近也有人提出,在急性藥物性肝損傷事件中死亡的肝細胞百分比可以通過血清ALT的連續(xù)測量來評估[30].這是基于這樣的觀點,即每個肝細胞都含有一定數(shù)量的ALT,而ALT在細胞死亡期間是被動釋放的.因此,血清ALT與時間曲線下的面積應與丟失的肝細胞數(shù)量相對應.此外,還提出用這種方法估算肝細胞丟失量,可以根據(jù)聚集肝功能的隱含損失來預測血清膽紅素升高的幅度.動物的肝切除研究表明,在血清TBIL升高到足以引起黃疸之前,必須有超過70%的肝細胞丟失.然而,在急性藥物性肝損傷事件中,在可能不會發(fā)生細胞死亡的部分肝細胞中,功能將受到損害.將這一現(xiàn)象納入丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的肝細胞丟失估計值的支持性數(shù)據(jù),可能是幾十年前對因醋氨酚過量而發(fā)生肝損傷的患者進行的一項肝活檢研究.根據(jù)本研究提供的數(shù)據(jù),可以得出結論:40%以上的肝細胞必須在血清TBIL升高到大于2×ULN之前死亡.根據(jù)一系列的血清ALT值估計,每個受試者的肝細胞丟失率均小于40%[31].模型的結論是,血清TBIL的升高并不僅僅是由于肝細胞毒性所致.如果系統(tǒng)藥理學方法表明藥物對轉運體和/或酶的抑制可能導致血清TBIL的升高,這一結論將得到進一步的支持.這些方法有可能完善對潛在的Hy’s定律案例的解釋[29].用連續(xù)血清ALT值來評估肝細胞丟失百分比,認為大多數(shù)ALT進入循環(huán)是肝細胞隨著ALT含量的釋放而死亡的結果.這種情況很可能發(fā)生在嚴重的藥物性肝損傷事件中,但血清ALT的大幅升高也可能是由于肌肉疾病或損傷引起的[32].

3.2 新的藥物性肝損傷生物標志物

3.2.1 凋亡指數(shù):最近提出了一種基于血清生物標志物的凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)來估計凋亡和壞死在肝損傷中的相對貢獻.AI為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(caspase)裂解角蛋白18 (caspase cleaved keratin 18,ccK 18)與總角蛋白18 (K18)的比值,K18包括全長K18和caspase裂解片段.K18是一種I型中間絲,存在于上皮細胞中,為細胞提供結構支持.細胞凋亡早期,K18被caspase切割,形成穩(wěn)定的蛋白片段(ccK 18),并釋放到循環(huán)中.壞死時,全長K18被動釋放入循環(huán),但有少量ccK 18反應釋放.現(xiàn)已研究在醋氨酚誘導的肝損傷(acetaminophen-induced liver injury,AILI)中檢測血中K18或ccK 18濃度的質譜(小鼠)或免疫分析(針對人類),以確定它們是否與肝臟中發(fā)生的壞死程度和凋亡程度相關.研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中,ccK 18水平的升高與caspase 3的表達密切相關,與caspase 3的處理、DNA斷裂和凋亡肝細胞的出現(xiàn)密切相關.此外,還發(fā)現(xiàn)ccK 18與K18的比值反映了肝臟從混合凋亡/壞死向主要壞死損傷的時間依賴性轉變.還注意到,在醋氨酚誘導的肝損傷(AILI),在ALT水平顯著上升之前,K18和ccK 18的水平都有很大的提高[33].這些數(shù)據(jù)表明,至少在臨床前模型中,量化K18和ccK 18既可以早期發(fā)現(xiàn)肝細胞死亡,也可以定量估計肝細胞凋亡與壞死的相對數(shù)量.由于K18并不局限于肝起源的上皮細胞,因此利用它本身作為藥物性肝損傷生物標記物可能會有問題. miR-122或谷氨酸脫氫酶(GLDH)/K18的比值可能允許這樣的結論,但這一點尚未得到調(diào)查.

血清K18和ccK 18的定量也是在藥物性肝損傷臨床背景下進行的.與ALT相比,這兩種方法對肝損傷的檢測都具有更高的敏感性[34].血清K18和ccK 18也有可能作為預測肝衰竭和死亡的生物標志物[35].在這些調(diào)查中,在符合國王學院標準(King’s College Criteria,KCC)的患者中,K18和ccK 18的水平都顯著高于未達到這些標準的患者(KCC),KCC是一種預測AILI肝衰竭的模型.AI的估計顯示,與未發(fā)生KCC的患者相比,KCC患者的值更低(壞死更多).這些結果與壞死性肝損傷相對于凋亡損傷更為嚴重和危險的觀點是一致的[36].

然而,應當指出,在使用商業(yè)上可獲得的ELISAs時,計算人工智能可能是一項挑戰(zhàn).在癌癥患者血清中進行的實驗證據(jù)表明,當K18和ccK 18水平較低,這一比率可能并不有用.因此,建議只有在K18和ccK 18的值都超過某些背景閾值時才能進行人工智能[37].當K18水平較低時,測量的ccK 18水平可能會超過測量的總K18水平,原因是由于非特定背景結合水平的增加所致.同樣,這也支持這樣的觀點,即只有當值高于特定的背景級別時,以及當K18水平超過ccK 18水平時,才能計算AI.當需要計算AI時ELISA制造商推薦使用較早版本的K18 ELISA(M65)?.最后,這些ELISAs目前還不適用于嚙齒類動物.

3.2.2 谷氨酸脫氫酶:谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GLDH)是一種位于線粒體基質中的酶,參與氨基酸的氧化和尿素的產(chǎn)生.這種蛋白主要表達在肝臟的中心周區(qū),但在腎臟和大腦中也有較低水平的GLDH表達.在最近對嚙齒動物進行的一項AILI研究中,發(fā)現(xiàn)GLDH在識別肝細胞壞死方面略優(yōu)于ALT,并顯示出與損傷嚴重程度之間的相關性[38].同樣,在一項狗的研究中,血清GLDH水平與ALT水平相比,在研究終止時能更準確地反映組織學觀察到的肝損傷的缺失.一項臨床研究表明血清GLDH與ALT水平有很強的相關性,表明GLDH對多種病因所致肝損害患者的肝損傷有較高的診斷能力[39].提示由于GLDH的半衰期短于ALT的半衰期(分別為～16小時和～47小時),血清GLDH水平能更準確地反映肝臟損傷的進展.

GLDH向血清中的釋放可能是線粒體毒性的信號,可能是肝損傷的機制之一.這一觀點源于這樣一個事實,即如果發(fā)生壞死而不導致線粒體毒性,則可通過離心(“線粒體后上清液”)從新鮮血清中去除釋放的完整線粒體.利用這一技術,AILI小鼠的研究中證明了GLDH作為線粒體損傷生物標志物的證據(jù),該研究檢測了從或速尿誘導的肝臟毒性所獲得的線粒體后上清液中GLDH的含量[40].雖然這兩種毒物引起的中心周區(qū)壞死和血清丙氨酸氨基轉移酶峰值升高的模式相似,但僅在AILI線粒體后血清上清液中GLDH水平顯著升高,而速尿處理小鼠未見明顯升高.這與對乙酰氨基酚已知的線粒體毒性和速尿所致線粒體毒性的缺乏相一致,提示在藥物性肝損傷期間分析線粒體后上清液中的GLDH升高可能是由于多種藥物所致[3].

3.2.3 miR-122:MicroRNAs是一種小而非編碼的RNA,有助于轉錄后基因的調(diào)控.這些物種的一個吸引人的特點是它們在生物液體中的高度穩(wěn)定性.MicroRNA-122是由肝細胞特異性表達的,它占肝臟miRNA總量的70%,有可能成為藥物性肝損傷生物標記物的理想候選物,因為ALT等傳統(tǒng)生物標志物并不完全是肝臟特異性的[41].

在AILI小鼠中,miR-122在血漿中的含量很高,同時在肝組織中減少.此外,與丙氨酸氨基轉移酶(ALT)相比,循環(huán)中的miR-122水平在早期和低劑量對乙酰氨基酚(APAP)后均升高.在臨床上,多次藥物性肝損傷研究表明,循環(huán)中的miR-122水平在ALT升高之前就會升高[34,42].在另一項研究中,急性肝損傷患者血清miR-122水平升高,而健康對照組和服用過量醋氨酚但未發(fā)生肝損傷的患者則未見升高.研究表明miR-122的血清半衰期比ALT短,因此能夠更準確地反映持續(xù)肝損傷的程度[43].

在從成人和兒童獲得的臨床醋氨酚誘導的肝損傷(AILI)數(shù)據(jù)集中也進行了大量的miRNA分析研究.在所有的研究中,miR-122是循環(huán)中最高水平的miRNAs之一.有趣的是,在一項涉及評估AILI和缺血性肝損傷的研究中,兩種損傷類型的miRNAs分布有明顯的差異[44].

盡管人們對miR-122作為肝損傷敏感和特異的生物標志物有很大的興趣,但最近的一些觀察表明,miR-122的肝細胞釋放可能受到調(diào)控,而不僅僅是反映肝細胞死亡過程中的被動釋放.例如,最近在大鼠身上進行的一項研究表明,與對照組相比,對乙酰氨基酚治療后2小時,大鼠血漿miR-122水平顯著降低[45].血清miR-122水平隨肝壞死的發(fā)生而升高.此外,最近有報道說,miR-122是在急性肝反應期間釋放出來的,可能是由于慢性炎癥狀態(tài)下經(jīng)常觀察到的貧血而向腎臟移動有關[46].miR-122也被發(fā)現(xiàn)在健康志愿者身上有很大程度的內(nèi)部和內(nèi)部變異.這種多變性在一定程度上促使預測性案例測試聯(lián)盟(PSTC)剝奪了miR-122作為藥物性肝損傷生物標記物的優(yōu)勢,而GLDH具有較低的學科間和內(nèi)部變異性為其優(yōu)點.

3.3 特異性藥物性肝損傷的生化標記預測 現(xiàn)在看來,許多甚至是大多數(shù)的IDILI反應都是由肝臟的適應性免疫攻擊引起的.這就要求人體的免疫系統(tǒng)將肝臟看作是外來的,這可能是藥物誘導的肝細胞表面Ⅰ類HLA分子所產(chǎn)生的新抗原的結果.然而,僅僅提出新的抗原并不足以引起肝臟的適應性免疫攻擊.這被認為需要激活天然免疫細胞,特別是肝臟中的庫普弗細胞.這就需要藥物誘導釋放損傷相關的分子模式,即抑制,從而啟動天然免疫細胞的激活[47].如果是這樣的話,在沒有損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern molecules,DAMPs)釋放的情況下,血清ALT升高和(或)缺乏天然免疫細胞的激活應意味著肝臟不會發(fā)生適應性免疫攻擊.因此,人們一直在積極尋找肝細胞釋放出的適當?shù)腄AMPs,以及能夠檢測肝臟中先天免疫細胞活化的生物標志物.迄今為止,高遷移率組1 (HMGB 1)及其各種翻譯后修改形式在這方面得到了最廣泛的關注.

為了引起肝臟的適應性免疫攻擊,認為藥物必須引起肝細胞應激或死亡,導致肝細胞損傷相關分子模式的釋放,進而激活天然免疫細胞,尤其是肝臟中的庫普弗細胞.激活的天然免疫細胞釋放細胞因子和趨化因子,將炎癥細胞引入肝臟,這一過程被認為是針對肝臟的適應性免疫攻擊的先決條件.

3.3.1 高遷移率族組1:高遷移率族組1 (high mobility group box 1,HMGB 1)這種無處不在的核蛋白主要發(fā)揮DNA結合和轉錄調(diào)節(jié)的作用;然而,它也可以積極地分泌到細胞外環(huán)境中.有證據(jù)表明,HMGB 1是被動地從受損或死亡的肝細胞中釋放到循環(huán)中的,并且可以起到DAMP的作用,引發(fā)免疫反應[48].這一功能似乎是由HMGB 1中特定殘基的氧化還原狀態(tài)介導的.在這些殘基處完全或部分減少的HMGB 1亞型在壞死時釋放,并促進先天免疫細胞趨化和細胞因子的釋放.相反,在這些關鍵部位被完全氧化的HMGB 1是由凋亡細胞釋放的,并不引起先天免疫反應.

重要的是,HMGB 1也可以在一個需要關鍵賴氨酸殘基高度乙?；倪^程中積極分泌.當在藥物性肝損傷事件中在血清中檢測到時,大多數(shù)高乙?；疕MGB 1被認為是由先天免疫細胞釋放的,這意味著受到DAMPs的激活;然而,肝細胞也被證明在某些條件下分泌這種異型.

非臨床和臨床研究都表明HMGB 1是AILI的敏感生物標志物.小鼠血清HMGB 1明顯早于ALT升高,并以較快的速度回歸基線,與肝壞死的組織病理學觀察密切相關[33].與壞死細胞滲出HMGB 1促進免疫細胞炎癥和HMGB 1活性釋放的觀點一致,血清中高乙酰化HMGB 1的升高與肝內(nèi)炎性細胞的出現(xiàn)同時發(fā)生.此外,在最近的一項小鼠研究中,用一種嵌合的人源化抗HMGB 1抗體減輕了對乙酰氨基酚所致的肝臟損傷,支持了該蛋白在藥物性肝損傷因該藥物所致的進展中的作用[49].

在臨床醋氨酚誘導的肝損傷(AILI)研究中,HMGB 1對肝毒性檢測的敏感性高于ALT[42].在一項研究中,從ALT水平仍在正常范圍內(nèi)的患者在提交時收集了測量結果.在這些樣本中,HMGB 1的總水平僅在后來發(fā)生肝損傷的患者中顯著升高.在第二項研究中,高乙?；疕MGB 1只在死亡或需要肝移植的AILI患者中觀察到,與那些自發(fā)存活的患者相比,表明這種形式的HMGB 1可能是AILI預后不良的預后因素[50].雖然總HMGB 1可以通過免疫測定來量化,但目前還沒有能夠解釋不同異構體的抗體,因此需要質譜來測定HMGB 1的翻譯后狀態(tài).然而,在上述AILI研究中,總HMGB 1的測定也被證明是藥物性肝損傷的一個敏感的生物標記物.

3.3.2 外顯子是真核生物基因的一部分:外顯子(expressed region,Exons)是最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列,又稱表達序列.如前所述,肝細胞壞死時可釋放DAMPs,并啟動肝內(nèi)先天免疫細胞的激活,這被認為是必要的,但不足以引發(fā)肝臟的適應性免疫攻擊.然而,有越來越多的證據(jù)表明,肝細胞壞死并不一定是需要釋放DAMP和最終啟動肝臟適應性免疫攻擊的先決條件.例如,在ximelagatran(希美加群,一種口服凝血酶抑制劑)、lumiracoxib (一種新型,選擇性的COX-2抑制劑)和lapatinib[拉帕替尼,是一個靶向Her2和EGFR的小分子的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)]的臨床試驗中,觀察到較強的HLA相關性,血清ALT升高相對較小.此外,在因抗生素異煙肼引起的IDILI病例中,在血清ALT升高之前,患者血液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了藥物反應性T細胞.這些觀察表明,血清ALT的輕度升高并不一定反映藥物直接引起的肝細胞壞死,而會引發(fā)適應性免疫攻擊,而最初的肝細胞死亡是由適應性免疫攻擊介導的.在沒有肝細胞死亡的情況下,可以觸發(fā)對肝臟的適應性免疫攻擊,這與乙肝感染是一致的.乙型肝炎病毒不是細胞溶解,而是產(chǎn)生肝臟特異性的適應性免疫攻擊,導致肝細胞壞死和臨床疾病[51].最近的數(shù)據(jù)表明,在沒有細胞死亡的情況下,這些DAMPs可能會通過藥物誘導的肝細胞應激而在肝細胞外小體中傳播[45].觀察還表明,與對照肝細胞釋放的外顯子相比,用醋氨酚亞毒性劑量的醋氨酚處理肝細胞釋放的外顯子對單核細胞的激活更大.這是合理的,應當強調(diào),但沒有死亡的肝細胞釋放DAMPs (可能是新抗原),在外顯子,然后移動和激活先天免疫細胞.這是一個重要的研究領域,因為,由于肝內(nèi)皮細胞的多孔窗,肝源性外顯子可以進入血液循環(huán),并有可能作為血液生物標志物.因此,從外周血中分離出外顯子,并對HMGB 1等HMGB1進行分析,可能是早期預測進展和臨床重要的藥物性肝損傷電位的生物標記物[3].

3.4 基因測定 研究人肝毒性時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了危險等位基因的存在,這些等位基因對藥物性肝損傷的易感性的風險比要高得多.HLA等位基因檢測具有較高的陰性預測價值,因此,由于藥物的特殊性,已被用于排除DILI.當病人服用一種以上的肝毒性藥物時,基因檢測的高陰性預測價值已被用于鑒別DILI的正確藥物.納入基因測試可以改善DILI因果關系評估工具的性能特征[52].長期以來,人類基因組中個體間的變異一直被認為是導致藥物反應和藥物不良反應敏感性差異的原因之一.

3.4.1 基因檢測在臨床診斷中的應用:診斷DILI的“基因測試”的表現(xiàn)通常被描述為根據(jù)病例對照研究計算的敏感性和特異性,這些研究旨在識別風險等位基因.大多數(shù)與DILI相關的HLA等位基因具有極高的陰性預測值(＞0.95).因此,當明確診斷的重要性時,它們可以用來排除由特定藥物引起的肝臟不良反應.這將允許繼續(xù)有效的藥物治療,并提請注意一種非典型的可治療情況的表現(xiàn),如自身免疫性肝炎,在沒有經(jīng)典的自身抗體模式的情況下,有緩解和復發(fā)的過程.基因測試的高陰性預測值可用于在病人接觸過兩種可能導致DILI的藥物時,識別DILI的正確藥物.在最近的一份報告中,一位患有膽汁淤積性肝炎的患者暴露于氟西林和雄激素合成類固醇,缺乏Hla-B*5701等位基因被用來排除氟氯西林作為冒犯劑,DILI被認為是合成類固醇[53].另一種在黃疸臨床評估過程中有效利用基因檢測的類似臨床情況,在急性肝損傷的研究中,臨床醫(yī)生正在使用基因檢測作為診斷工具,其中,藥物所致的DILI是鑒別診斷之一.對懷疑DILI的事件進行因果關系評估是一個具有挑戰(zhàn)性的過程,在特定情況下納入基因測試可能會提高諸如Roussel Uclaf因果關系評估方法(Roussel Uclaf causality assessment method,RUCAM)等因果關系評估工具的一致性和準確性[54].

3.4.2 藥物遺傳學的未來:迄今為止的調(diào)查已經(jīng)證實,一些常見的基因變異與DILI密切相關.然而,肝毒性遺傳因素的基礎知識還不足以使其在臨床上得到廣泛的應用.較罕見的基因變異對DILI的影響可能要大得多;由于其受檢測方法的限制,全基因組關聯(lián)分析(genomewide association study,GWAS)無法檢測到這些變異.全基因組測序技術涉及可挖掘整個人類基因組對藥物不良反應的遺傳貢獻;這些進展有望大大增加可與基因分型相聯(lián)系或可使診斷不良反應的檢出率增加.

在過去的十年里,對影響DILI易感性的非遺傳因素的認識也有了很大的提高.例如,如果接觸氟氯西林的每萬人中就有一人患上了DILI,那么攜帶氟氯西林的人患上DILI的風險就Hla-B*5701等位基因為1/500,同時攜帶危險等位基因的65歲以上人群的估計風險上升到1/100.因此,將影響DILI發(fā)展風險的lumiracoxib(羅美昔布,COX-2抑制劑)與藥物有關的、遺傳的和非遺傳的宿主因素結合在一起進行分析,與單獨使用的遺傳測試相比,性能特征有了很大的改善[55].因此,增加了集成算法的臨床適用性.也從而提高了DILI的檢出率.

4 結語

深入研究DILI的發(fā)病機制,為治療提供更多新途徑,開展更多的非創(chuàng)傷性新血清標記物和基因檢測的研究,這將是今后DILI防治的努力方向與期待.