王治會(huì)，彭華，岳翠男，李琛，李文金，江新鳳，楊普香*

（1.江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330202；2.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所，江西 南昌 330202）

鉛山縣位于武夷山脈北麓，境內(nèi)南高北低，海拔相差2 104.9 m，山區(qū)丘陵密布，雨量充沛、霧日長(zhǎng)，自古以來盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶葉，被農(nóng)業(yè)部劃入國家茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)區(qū)域[1]。目前鉛山縣創(chuàng)建茶葉品牌19個(gè)，包括紅茶6個(gè)、綠茶12個(gè)、白茶1個(gè)，“河紅茶”為其重要代表，產(chǎn)于“萬里茶道第一鎮(zhèn)”河口鎮(zhèn)[2]。在《中國通史》中記載“鉛山河紅茶乃國內(nèi)著名紅茶”和“第一次問世（出口）之華茶”，被西方奉為“至尊名茶”與“茶中皇后”，其品質(zhì)特征條索緊細(xì)，烏潤顯毫，香氣清鮮持久，滋味甘醇鮮爽，湯色紅艷[3]。產(chǎn)生其特征性品質(zhì)的一個(gè)重要因素就是鉛山群體種，該品種是本區(qū)域的主栽茶樹品種，適應(yīng)性強(qiáng)，制茶品質(zhì)優(yōu)異，且經(jīng)過長(zhǎng)期的自然雜交與變異，形成了一個(gè)天然茶樹種質(zhì)庫，極具開發(fā)利用價(jià)值。茶葉生化成分與其品質(zhì)和功能等息息相關(guān)[4-5]，研究其生化成分特征特性有助于人們明確其資源特征，對(duì)進(jìn)一步改善茶葉品質(zhì)，選育各區(qū)域生態(tài)經(jīng)濟(jì)型品種以及挖掘其深加工利用價(jià)值等具有重要意義。

目前，我國各茶區(qū)茶樹資源生化特性的研究在不斷深入，張金霞等[6]對(duì)黃山群體種的主要生化成分進(jìn)行分析，篩選出了7份適制紅茶、15份適制綠茶、6份適制烏龍茶的種質(zhì)。莫嵐等[7]對(duì)金秀野生群體的兒茶素及氨基酸組分進(jìn)行分析，為其區(qū)域茶產(chǎn)品與深加工的開發(fā)提供了參考。宋勤飛等[8]對(duì)久安古茶樹的生化成分進(jìn)行分析，篩選出了6份高茶多酚資源。林小瑞等[9]研究不同資源的兒茶素的變化，對(duì)烏龍茶加工工藝的改良提供了基礎(chǔ)。這些研究的側(cè)重點(diǎn)在于發(fā)掘特異茶樹種質(zhì)資源，而缺少關(guān)于種群生化特性的遺傳變異及多樣性的探討，關(guān)于鉛山群體種生化品質(zhì)多樣性及其特征特性的研究尚未見報(bào)道，因此不能準(zhǔn)確有效的發(fā)掘與利用該資源。本研究在江西省茶樹種質(zhì)資源收集與創(chuàng)新利用的基礎(chǔ)之上，擬對(duì)鉛山群體種的28份單株春梢生化成分含量進(jìn)行鑒定，明確其多樣性及品質(zhì)特性，從中篩選出優(yōu)良單株與特異種質(zhì)，為進(jìn)一步開發(fā)利用鉛山群體種資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

2014年江西省蠶桑茶葉研究所科研人員從鉛山縣各區(qū)縣的群體種中收集實(shí)生苗單株，保存于試驗(yàn)基地內(nèi)，2018年～2019年隨機(jī)從實(shí)生苗單株中采摘28份單株的春梢生化成分進(jìn)行檢測(cè)分析。采摘各單株越冬芽第一輪新梢一芽二葉進(jìn)行微波固樣，制作生化樣品用于分析。咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、沒食子酸（gallic acid，GA）、兒茶素（catechin，C），此9份標(biāo)準(zhǔn)品純度均為98%：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國賽默飛世爾公司；高效液相色譜儀（1100VL）：美國安捷倫有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550）：日本島津儀器有限公司；電子天平（ME104）：賽多利斯科學(xué)儀器（上海）有限公司；離心機(jī)（TG16-WS）：常州金壇良友儀器有限公司。

1.3 方法

兒茶素組分（ECG、EC、GCG、GC、EGCG、C、EGC）、GA、咖啡堿含量測(cè)定：采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，色譜柱采用Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A為0.3%冰乙酸溶液；流動(dòng)相B為純乙腈。流動(dòng)相A的梯度變化：0～5 min為95%～92%，5 min～15 min為92%～88%，15 min～30 min 為 88%～80%，30 min～31 min 為88%～0%，31min～35min為0%；流動(dòng)相B的梯度與A的梯度對(duì)應(yīng)；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm。

水分測(cè)定：采用減重法；水浸出物含量測(cè)定：采用GB/T 8305—2013《茶水浸出物測(cè)定》方法；游離氨基酸含量測(cè)定：采用GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量測(cè)定》方法；茶多酚含量測(cè)定：采用GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》方法；各個(gè)生化成分測(cè)定每個(gè)茶樣重復(fù)3次。酚氨比為茶多酚與氨基酸的比值；總兒茶素為各兒茶素單體之和。

兒茶素品質(zhì)指數(shù)分析方法[6-7]：兒茶素品質(zhì)指數(shù)=（EGCG含量+ECG含量）/ECG含量×100；兒茶素苦澀味指數(shù)=（EGCG含量+ECG含量+EGC含量+GC含量）/（EC含量+C含量）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生化成分的Shannon—Weaver多樣性指數(shù)計(jì)算公式為 H′=-ΣPi×lnPi，Pi是某生化成分第 i個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的頻率，級(jí)別劃分利用標(biāo)準(zhǔn)差和平均數(shù)分為10級(jí)：第1級(jí)為 X1<（X-2a）、第 10級(jí)為 X10≥（X+2a），X 為各生化成分的平均數(shù)，a為各生化成分的標(biāo)準(zhǔn)差，每0.5a為1級(jí)。聚類分析采用SPSS19.0，熱圖分析采用Multiple Experiment Viewer 4.9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化成分熱圖描述與多樣性分析

28份鉛山群體種單株的生化成分熱圖分析和多樣性分析結(jié)果見圖1。

圖1 各單株生化成分熱圖分析Fig.1 Thermogram analysis of biochemical components of each individual plant

從熱圖的顏色差異和多樣性指數(shù)來看，熱圖中每一個(gè)生化成分的顏色均不完全一致，存在較大差異，不同生化成分之間的顏色差異性不同，與多樣性指數(shù)的大小保持一致。鉛山群體種單株的生化成分多樣性指數(shù)范圍為1.44～2.04，平均值為1.83，大小依次為EC>酚氨比>非酯型兒茶素>酯型兒茶素>茶多酚=GC>EGC>EGCG=總兒茶素>水浸出物>ECG>咖啡堿>游離氨基酸>GCG>C>GA。江西省內(nèi)種質(zhì)資源生化成分多樣性指數(shù)范圍為1.25～2.11，平均值為1.91[10]。說明鉛山群體種的多樣性與整個(gè)江西省內(nèi)茶樹資源的多樣性相比稍低，原因在于江西省的茶樹資源包括省外引種、省內(nèi)群體、野生等原生種質(zhì)，所以多樣性程度較高，而鉛山群體種的多樣性主要來源于群體內(nèi)的自然雜交，但與黃山群體種（1.78）[6]等相比較，其多樣性相對(duì)豐富，具備篩選出優(yōu)良資源的潛力。

水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質(zhì)的重要代謝物質(zhì)[11-13]。鉛山群體種的水浸出物含量范圍為41.60%～47.72%，均值為45.29%，多樣性指數(shù)為1.85，從熱圖中可以看出高于均值的有16份；茶多酚含量的范圍為12.83%～23.07%，均值為17.79%，多樣性指數(shù)為1.93，各單株含量差異性較大；游離氨基酸含量的范圍為2.77%～5.16%，均值為3.70%，多樣性指數(shù)為1.69，高于均值的有13份；咖啡堿含量的范圍為3.22%～4.94%，均值為4.13%，多樣性指數(shù)為1.72，低于均值的有14份。從4個(gè)成分含量均值來看，與其它茶葉內(nèi)4個(gè)常規(guī)成分含量的范圍[10]比較，鉛山群體種的水浸出物、游離氨基酸含量較高，茶多酚含量較低，咖啡堿含量中等，說明鉛山群體種具備優(yōu)良制茶品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。多樣性指數(shù)中茶多酚最高、其次為水浸出物，說明鉛山群體種在自然雜交過程中，茶多酚和水浸出物的變動(dòng)較大，游離氨基酸和咖啡堿相對(duì)穩(wěn)定。

酚氨比是茶多酚與氨基酸的比值，其值能夠在一定程度上體現(xiàn)茶樹資源的適制性，值高的適制紅茶，值低的適制綠茶[14]。鉛山群體種春梢的酚氨比范圍為3.12～7.45，多樣性指數(shù)為2.01，多樣性指數(shù)較高，從熱圖顏色差異上也可看出各單株之間差異性較大，說明鉛山群體種各單株酚氨比的多樣性較豐富，能夠適制不同的茶類。

兒茶素是茶湯滋味的基本貢獻(xiàn)物質(zhì)[4，15]，在紅茶制作中，兒茶素可轉(zhuǎn)化為茶黃素、茶紅素和茶褐素，進(jìn)而決定紅茶的品質(zhì)[16-17]。鉛山群體種的總兒茶素含量范圍為9.17%～17.11%，均值為13.17%，多樣性指數(shù)為1.90，在各單株中兒茶素含量的差異性較大，說明可開發(fā)改良利用的潛力較大。

2.2 聚類分析

對(duì)28份鉛山群體種單株生化成分含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。在距離為10的時(shí)候，可將28份單株分為5類，每一類均含有不同的亞組，各類的生化成分含量平均值見表1。

圖2 聚類分析系譜圖Fig.2 Cluster analysis pedigree

表1 各類生化成分比較Table 1 Comparison of various biochemical components

由圖2可知，第一類包括7個(gè)單株，分別為No.2、No.3、No.8、No.15、No.21、No.22 和 No.5，此類單株特征為游離氨基酸含量最低、酚氨比、非酯型兒茶素含量最高；第二類包括2個(gè)單株，分別為No.14和No.16，此類單株特征為總兒茶素、酯型兒茶素含量最低；第三類包括3個(gè)單株，分別為No.10、No.11和No.6，此類單株特征為水浸出物、茶多酚含量最低，酚氨比最低，游離氨基酸、咖啡堿含量最高；第四類包括10個(gè)單株，分別為No.24、No.27、No.1、No.19、No.17、No.23、No.12、No.25、No.26和No.9，此類單株特征為各項(xiàng)生化成分含量均處于中等水平；第五類包括6個(gè)單株，分別為No.4、No.13、No.18、No.28、No.7和No.20，此類單株特征為水浸出物、茶多酚、總兒茶素含量最高。

2.3 兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)分析

兒茶素品質(zhì)指數(shù)是衡量茶葉品質(zhì)及評(píng)價(jià)茶葉功效的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，指數(shù)越大，說明鮮葉的嫩度與品質(zhì)越好，兒茶素苦澀味指數(shù)是酯型兒茶素與簡(jiǎn)單兒茶素的比值，指數(shù)越大，說明鮮葉的苦澀味越重[6-7]。以福鼎大白茶為對(duì)照，采用此兩項(xiàng)指標(biāo)能夠初步對(duì)鉛山群體種單株鮮葉的品質(zhì)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，各單株兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)的結(jié)果見圖3。

圖3 各單株的兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)Fig 3 Catechin quality and bitterness index of each individual plant

由圖3可知，各單株的兒茶素品質(zhì)指數(shù)比福鼎大白茶高的有7份，苦澀味指數(shù)比福鼎大白茶低的有19份。單株中既能滿足兒茶素品質(zhì)指數(shù)高，又能滿足苦澀味指數(shù)低的單株有4份，分別為No.3、No.5、No.17和No.18，說明此4份單株鮮葉的兒茶素品質(zhì)高、苦澀味低，初步判定為優(yōu)良茶樹單株，結(jié)合此4份單株的酚氨比來判斷其適制性。傳統(tǒng)認(rèn)為酚氨比小于8適制綠茶，8～15之間為紅綠茶兼制，大于15適制紅茶，此劃分依據(jù)的茶多酚檢測(cè)方法為酒石酸亞鐵法，而GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》福林酚比色法測(cè)的茶多酚含量比酒石酸亞鐵法檢測(cè)的降低約30%左右，所以酚氨比劃分應(yīng)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整[18-19]。本研究認(rèn)為，采用福林酚比色法檢測(cè)茶多酚含量的以酚氨比小于6適制綠茶，6～10為紅綠茶兼制，大于10適制紅茶較為實(shí)際，結(jié)合圖1中酚氨比初步判斷，No.5和No.3為紅綠茶兼制，No.17和No.18適制綠茶。

2.4 特異單株篩選

隨著人們對(duì)于茶葉藥理功能的研究不斷深入，以及消費(fèi)更加多元化，篩選出適應(yīng)加工多樣化茶葉產(chǎn)品或能夠滿足深加工利用的特異性茶樹資源是今后的重點(diǎn)方向[20]。依據(jù)對(duì)鉛山群體單株常規(guī)生化成分的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出的生化成分特異的單株見表2。

表2 生化成分含量特異的單株Table 2 Single plant with specific biochemical component

由表2可知，從鉛山群體種中可篩選出了5份高水浸出物單株、1份高游離氨基酸單株、1份高兒茶素單株、6份低茶多酚單株。

3 結(jié)論

本研究對(duì)28份鉛山群體種單株的16項(xiàng)主要生化成分進(jìn)行分析，其多樣性指數(shù)范圍為1.44～2.04，均值為1.83，各成分多樣性指數(shù)大小依次為EC>酚氨比>非酯型兒茶素>酯型兒茶素>茶多酚=GC>EGC>EGCG=總兒茶素>水浸出物>ECG>咖啡堿>游離氨基酸>GCG>C>GA，由此可以看出鉛山群體種在自然雜交與自然變異過程中形成了豐富的生化成分多樣性，其中以茶多酚類物質(zhì)（非酯型兒茶素、酯型兒茶素）多樣性為主，茶多酚類物質(zhì)對(duì)茶葉的適制性具有決定性作用，說明了鉛山群體種可開發(fā)與可改良潛力較大。聚類分析將28份單株分為5類，明確了各類單株的典型生化特征，在利用這些單株時(shí)，可根據(jù)其典型生化特征發(fā)揮其資源優(yōu)勢(shì)。依據(jù)兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)篩選出了兒茶素品質(zhì)高、苦澀味低的4份單株，初步判定其為優(yōu)良茶樹單株，通過酚氨比值來看，2份為紅綠茶兼制，2份為適制綠茶，鉛山縣茶產(chǎn)品以紅茶和綠茶為主，茶樹品種對(duì)茶產(chǎn)品的特色品質(zhì)具有決定性作用，因此培育出適合制作紅茶和綠茶的鉛山區(qū)域性茶樹新品種對(duì)其茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用，進(jìn)一步的工作將對(duì)此4份單株進(jìn)行擴(kuò)繁，形成系列新品系，全面測(cè)定其性狀指標(biāo)，探索其形成優(yōu)良品種的可能性。通過對(duì)比茶葉常規(guī)生化成分含量范圍，從鉛山群體種中篩選出了5份高水浸出物、1份高游離氨基酸、1份高兒茶素、6份低茶多酚特異資源，特異資源的應(yīng)用價(jià)值較大，可作為功能型和深加工專用型茶樹品種培育，如高氨基酸、高兒茶素等茶樹品種，也可作為茶樹遺傳改良的基礎(chǔ)性材料（如作為雜交親本）或探索其特異性成分的功能基因。