顏楨靈 陳潔萍 農小霞 李鑫 駱海玉 韋柳柳 阮家歡 關祥媛 陸莎

摘 要： ?本研究從柑橘抗病品種的健康植株不同組織中分離純化和鑒定內生真菌，并測定其發(fā)酵產物對柑橘潰瘍病菌的抑制活性，以明確柑橘抗病品種中內生真菌的組成及其產抗柑橘潰瘍病菌活性代謝產物的潛力，為柑橘潰瘍病抗菌劑的開發(fā)奠定基礎。該研究通過組織培養(yǎng)法分離內生真菌，采用形態(tài)學和分子生物學方法對其進行鑒定;基于前期的拮抗預試驗結果，選取代表性菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過乙酸乙酯浸提、真空抽濾、旋轉蒸發(fā)濃縮制備粗提物;采用帶毒平板涂布法測定不同菌株發(fā)酵產物乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑制活性。結果表明：（1）共分離得到72株內生真菌，歸為2門（Ascomycota、Basidiomycota）、14個屬，其中優(yōu)勢屬為刺盤孢屬（Colletotrichum）、球座菌屬（Guignardia）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀菌屬（Fusarium）。（2）不同柑橘品種中內生真菌多樣性指數為溫州蜜柑（桂林）>沙糖桔（桂林）>沙糖桔（梧州）。（3）不同組織中內生真菌多樣性變化因地理位置差異而有所不同，采自桂林的溫州蜜柑和沙糖桔均為葉片中的內生真菌的多樣性高于枝條，而采自梧州的沙糖桔為葉片中的多樣性低于枝條，并且采自梧州的柑橘樣品與采自桂林的柑橘樣品中的內生真菌相似性低。（4）測定了30株內生真菌乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌的抑制活性，其中29株菌株表現(xiàn)出不同程度抑制活性。不同柑橘品種中的優(yōu)勢屬的MIC介于0.312 5～10 mg·mL1之間，特有屬的MIC介于0.156～5 mg·mL1，共有屬鐮刀菌屬的MIC介于0.312 5～2.5 mg·mL1之間。研究結果表明柑橘抗病品種中內生真菌具有豐富多樣性，并且其發(fā)酵提取物普遍對柑橘潰瘍病菌具有抑制作用。特有屬抑菌活性總體優(yōu)于優(yōu)勢屬，共有屬鐮刀菌屬在不同柑橘抗病品種中均具有顯著抑菌效果。

關鍵詞： 柑橘內生真菌， 柑橘潰瘍病菌， 乙酸乙酯提取物， 最低抑制濃度

Abstract： ?In this study， to provide a basis for the controlling of citrus canker disease， endophytic fungi from different citrus diseaseresistant cultivars were isolated and identified by using a tissue culture method， and the method based on morphology combined with molecular biology， respectively. Representative endophytic fungi were selected based on the antagonism results in preexperimental， to determine the antibacterial activity with their ethyl acetate extracts from the fermented culture against pathogen Xanthomonas citri subsp. citri， using a toxic medium coating method. The results were as follows： （1） A total of 72 endophytic fungi were obtained from different citrus cultivars and classified into 14 genera. Fungal isolates belong to phylum Ascomycota and Basidiomycota. The frequent genera were Colletotrichum， Guignardia， Alternaria and Fusarium. （2） The diversity indices of endophytic fungi from different citrus as follow： Citrus unshiu Marc. （Guilin） > C. reticulata Blanco cv. Shatangju （Guilin） > C. reticulata Blanco cv. Shatangju （Wuzhou）. （3） The diversities indices of endophytic fungi were different， which were isolated from different tissues of citrus associated with different geographical location. The similarity of endophytic fungi in the citrus samples collected from Wuzhou and those from Guilin was low. （4） The antibacterial activity of ethyl acetate extracts from the fermented culture of 30 endophytic fungi were determined against pathogen Xanthomonas citri subsp. citri in vitro assay. Most of their extracts exhibited significant inhibition. Among them， the MIC values of dominant genera， specific genera and shared genus were 0.312 5-10 mg·mL1， 0.156-5 mg·mL1 and 0.312 5-2.5 mg·mL1， respectively. The results indicate that the endophytic fungi in citrus diseaseresistant cultivars are rich in diversity， and most of their extracts exhibit inhibition against X. citri subsp. citri. The antibacterial activity of specific genera is generally better than the dominant genera， and all of the strains in the shared genus Fusarium displayed significant inhibition against X. citri subsp. citri.

Key words： citrus endophytic fungi， Xanthomonas citri subsp. citri， ethyl acetate extract， minimum inhibitory concentration （MIC）

柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker disease，CBCD）是影響全球柑橘種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，對柑橘產業(yè)危害嚴重（陳先鋒等， 2017）。其病原是柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp. citri），同物異名為（X. campestris pv. citri或X. axonopodis pv. citri）（姚廷山等， 2015），具有易傳播、難防治的特點（Savietto et al.， 2018）。每年需使用大量化學藥劑對其進行防治。但是，隨著傳統(tǒng)化學藥劑的長期反復使用，導致的農藥殘留、環(huán)境污染、耐藥菌株等問題不斷增加（Lamichhane et al.， 2017）。因此，亟需尋找和開發(fā)高效、低毒的新型抗菌劑。

植物內生真菌作為一類特境微生物，已成為尋找和開發(fā)抗菌活性天然產物的重要資源。植物內生真菌是指在其生活史中的某一階段或全部階段存在于健康植物體組織中，而并不引起宿主植物產生明顯病害癥狀，并且與宿主植物互利共生的真菌（Abdalla & Matasyoh，2014）。植物內生真菌不僅可通過分泌次生代謝產物或刺激宿主產生活性物質提高宿主防御病害能力（Rodriguez et al.， 2009; Ding et al.， 2013），并且一些植物內生真菌離開宿主后，還可通過人工培養(yǎng)發(fā)酵產生抗菌活性物質（Venugopalan & Srivastava， 2015），為大規(guī)模生產生防菌劑提供可能。利用植物內生真菌及其代謝產物防治植物病害已有較多研究報道（Venkatesan et al.， 2016; Bindal et al.， 2020）。尤其是近年來，對作物中內生真菌組成及其對宿主病害防治作用的研究，持續(xù)成為當前內生真菌研究領域關注的熱點（Nicoletti， 2019）。利用柑橘內生真菌代謝產物防治柑橘病害的研究已有少量報道，如郭東升等（2020）研究發(fā)現(xiàn)柑橘果實中的一株內生燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum Gds1）對柑橘青霉病具有高效穩(wěn)定的防治效果，以其無菌發(fā)酵濾液單獨施用28和56 d時，對柑橘青霉病的防效與100 μg·mL1的抑霉唑相當。Pena et al.（2017）從柑橘中篩選獲得一株內生真菌Muscodor sp. LGMF1254產生的揮發(fā)性物質對柑橘黑斑病原菌菌絲和孢子具有顯著抑制活性，并且能有效控制離體葉片組織病斑形成。

柑橘中含有豐富的內生真菌資源（Nicoletti， 2019），并且不同柑橘品種中內生真菌的組成可能不同。任建國（2006）研究廣西主要柑橘品種對柑橘潰瘍病的抗性，發(fā)現(xiàn)無核沙糖桔和溫州蜜柑均為抗病品種。吳思夢（2018）研究發(fā)現(xiàn)從抗病品種溫州蜜柑中分離的拮抗內生細菌的數量較感病品種紐荷爾臍橙多，且感病品種紐荷爾臍橙中同時存在拮抗細菌和感病協(xié)同菌。但是，有關柑橘抗病品種中內生真菌的組成與其對柑橘抗?jié)儾【淖饔藐P系，以及柑橘抗病品種中的內生真菌能否產生抑制柑橘潰瘍病菌的活性產物等方面的研究尚未見報道。本研究旨在從柑橘抗病品種溫州蜜柑和沙糖桔中分離純化并鑒定內生真菌，明確其內生真菌組成，并通過離體抗菌活性的評估，探究柑橘內生真菌產抗柑橘潰瘍病菌活性成分的潛力，為其后期應用于柑橘潰瘍病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 柑橘樣品及柑橘內生真菌的分離

健康柑橘葉片和枝條于2016年11月，分別采自廣西桂林市柑橘研究所（溫州蜜柑）、廣西桂林市二塘鄉(xiāng)駱家寨（沙糖桔）、廣西梧州市蒼梧縣（沙糖桔）。每個地點隨機選取5株健康柑橘植株（3年以上株齡），共15株。在柑橘植株上選取4條顏色為暗綠色、枝徑粗約為0.4 cm、帶有深綠色葉片的枝條，用枝剪從枝條基部上方約3 cm處剪斷，將剪取的枝葉做好標記，總共采集60份樣品。裝至保鮮袋中帶回實驗室，立即進行內生真菌的分離純化。柑橘樣品葉片和枝條中的內生真菌分離純化參照Lou et al.（2013）、王利娟和賀新生（2006）的方法。

1.2 柑橘潰瘍病菌

柑橘潰瘍病菌為廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室化學生態(tài)實驗室于2017年12份分離和保存的菌種。

1.3 內生真菌的鑒定

主要采用形態(tài)學和分子生物學的方法對內生真菌進行鑒定。形態(tài)學鑒定主要以不同培養(yǎng)基（PDA、CMA、NGA）對分離得到的內生真菌進行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、顏色、邊緣形狀、生長速率、基質顏色等，以及其顯微鏡結構特征（如菌絲有無分隔、分支，分生孢子形態(tài)、大小，產孢結構特征等），結合《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）、相關文獻、實驗室已知菌種進行鑒定。分子鑒定主要通過內生真菌的rDNAITS序列對其進行鑒定。以真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）擴增菌株ITS堿基序列，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行檢測純化及測序。所獲的測序結果與GenBank中的序列進行BLAST比對，選擇相似度最高的菌株，以MEGA X軟件Neighborjoining（NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行同源性分析，進行自展次數為1 000的置信度檢測，根據系統(tǒng)發(fā)育樹中的組群關系對菌株進行分類。

1.4 內生真菌的多樣性指數統(tǒng)計分析方法

內生真菌的多樣性指數統(tǒng)計分析主要參考徐祥林等（2019）、Chowdhary & Kaushik（2015）的方法。具體如下。

相對頻率（relative frequency，RF）：分離到某種屬內生真菌的菌株數量占分離到的所有總菌株數量的百分數，即RF（%）=（某種屬內生真菌菌株數量/分離到的所有內生真菌總菌株數）×100。

多樣性指數（H′）：根據 ShannonWeiner 指數公式計算，即H′=-∑ki=1Pi×lnPi，式中： k 為某種植物或組織中內生真菌種類的總數;Pi為某種屬內生真菌的菌株數量占分離到的所有總菌株數量的百分數。

相似性系數（CS）是根據Sorenson系數公式計算，即CS=2j/（a+b）。式中：j是兩種組織中具有的相同內生真菌種類數;a是一種組織中內生真菌的種類數;b是另一組織中內生真菌的種類數。相似性系數可以比較兩種組織之間內生真菌種類組成的相似程度。

1.5 內生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)及粗提物制備

無菌條件下，用打孔器（直徑4 mm）在已經活化好的菌落邊緣處打孔，取3塊菌餅接入含有馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB，150 mL）的錐形瓶（250 mL）中，置于恒溫搖床上，（28±1）℃、150 r·min1震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d后，即可得到發(fā)酵種子液。取5 mL種子液接種于事先準備好的大米固體培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中，（28±1）℃培養(yǎng)60 d。

將發(fā)酵好的產物進行干燥、粉碎處理，用適量乙酸乙酯浸泡提取3次，真空抽濾，合并3次提取濾液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮蒸干，即得到內生真菌發(fā)酵產物的乙酸乙酯粗提物。

1.6 抑菌活性測定

采用帶毒平板涂布法（慕立義， 1994），用丙酮將樣品溶解配制成藥液，將藥液與熱熔冷卻至50～55 ℃的牛肉膏培養(yǎng)基按1∶9混合均勻后，倒入6 cm培養(yǎng)皿（每皿5 mL），對照組以丙酮純溶劑代替藥液。待凝固后，吸取50 μL柑橘潰瘍病菌懸浮液（濃度約106～107 cfu·mL1）至培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒涂布均勻。每處理設3個重復，置于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察和記錄細菌生長情況，以“+”代表有菌生長，“-”代表無菌生長。對于有活性的內生真菌發(fā)酵物，進一步測定其最低抑制濃度（MIC），配制系列梯度濃度藥液，按照如上方法操作，以病原菌不生長的最小濃度為最低抑制濃度。

2 結果與分析

2.1 柑橘內生真菌的定殖率和分離率

從不同柑橘品種的葉片和枝條中總共分離得到72株內生真菌（表1）。其中，從溫州蜜柑中分離得到50株，包括葉片40株、枝條10株。從桂林采集的沙糖桔中分離得到7株，包括葉片4株、枝條3株。從梧州采集的沙糖桔中分離得到15株，包括葉片2株、枝條13株。不同采集地的柑橘抗病品種的不同組織中內生真菌數量變化有所不同，采自桂林的柑橘抗病品種的葉片中內生真菌數量均高于枝條，而在采自梧州的柑橘抗病品種中，則為葉片中內生真菌數量低于枝條。

2.2 柑橘內生真菌的鑒定

根據菌株菌落形態(tài)、顏色、生長速度、邊緣形狀、基質顏色以及顯微結構，將菌株歸為2門（子囊菌門和擔子菌門）、14屬（表2）。其中擔子菌門僅含1科1屬，其余均歸為子囊菌門。選取30株代表菌株進行分子鑒定，將其ITS序列在GenBank中進行BLAST比對，選取相似度最高的已知屬種的序列，采用MEGA X軟件以NJ法構建系統(tǒng)進化樹（圖1），分析其同源性?；贗TS序列的BLAST比對結果與系統(tǒng)進化同源性分析，結合形態(tài)學特征，30株內生鑒定結果及GenBank序列號如表3所示，包含14個屬：鏈格孢屬（Alternaria）、短梗霉屬（Aureobasidium）、枝孢屬（Cladosporium）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、棒孢屬（Corynespora）、彎孢霉屬（Curvularia）、間座殼屬（Diaporthe）、附球菌屬（Epicoccum）、鐮刀菌屬（Fusarium）、小球腔菌屬（Leptosphaeria）、炭墊菌屬（Nemania）、黑孢屬（Nigrospora）、球座菌屬 [Guignardia （Phyllosticta）]、裂褶菌屬（Schizophyllum）。

分子鑒定結果與形態(tài)鑒定基本一致。其中，在系統(tǒng)進化樹中，內生真菌LJZJ4、WZMGY24和WZMGY4所聚集的分支包含Guignardia mangiferae（有性型）和Phyllosticta capitalensis（無性型）。對于菌株LJZJ4和WZMGY24， 它們的分生孢子大小為（8～）10～12 μm × （5～）6～7 μm，有透明的、黏液樣的頂端附著物（7～13 μm × ?1～1.5 μm），尖端錐狀，這些特征與Guignardia mangiferae分生孢子特征一致，并顯著區(qū)別于Phyllosticta capitalensis的分生孢子（Glienke et al.， 2011; Guarnaccia et al.， 2017）。因此，將內生真菌LJZJ4和WZMGY24鑒定為Guignardia mangiferae。由于未觀察到WZMGY4的分生孢子，難以區(qū)分其歸屬的種，所以，本研究將WZMGY4暫時鑒定至Phyllosticta sp.，有待進一步鑒定。此外，rDNAITS序列分析存在不足，如進行序列比對的數據庫需不斷完善（據估計GenBank中有10%～20%的真菌序列存在錯誤鑒定），以及對于某些物種其ITS區(qū)序列的可變程度相對不高，不足以用來分析其屬種或組群間的差異等（燕勇等，2008;鄭冰等，2011;李營等，2015），后續(xù)還需結合深入的、系統(tǒng)性的形態(tài)研究對菌株進行準確鑒定。

不同柑橘樣品中內生真菌分布及種屬差異較大。在分離的內生真菌中，溫州蜜柑中共含有8個屬，優(yōu)勢屬為刺盤孢屬（27.78%）、鏈格孢屬（15.28%）、球座菌屬（13.89%）。桂林采集的沙糖桔中共包含5個屬： 小球腔菌屬、 球座菌屬、 鐮刀菌屬、炭墊菌屬、黑孢屬，除了小球腔菌屬、球座菌屬的相對頻率為2.78%外，其他各屬的相對頻率均為1.39%。梧州采集的沙糖桔中共包含5個屬，優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（11.11%）、附球菌屬（4.17%）、刺盤孢屬（2.78%）。鏈格孢屬、間座殼屬、短梗霉屬、枝孢屬、裂褶菌屬僅分布在溫州蜜柑中;炭墊菌屬、黑孢屬、小球腔菌屬僅分布在桂林采集的沙糖桔中;彎孢霉屬、附球菌屬、棒孢屬僅分布在梧州采集的沙糖桔中。

不同組織部位中的內生真菌種屬差異較大。鏈格孢屬、間座殼屬、炭墊菌屬和黑孢屬僅分布在葉片中，短梗霉屬、枝孢屬、小球腔菌屬、彎孢霉屬、附球菌屬、棒孢屬、裂褶菌屬僅分布在枝條中。

2.3 各組織中內生真菌的多樣性與相似性

在選取的柑橘品種中，內生真菌的多樣性為溫州蜜柑>沙糖桔（桂林）>沙糖桔（梧州）。不同組織中內生真菌多樣性指數（H′）大小分別如下。在溫州蜜柑中，葉（1.20）>枝（0.62）;在桂林采集的沙糖桔中，葉（1.11）>枝（0.64）;在梧州采集的沙糖桔中，葉（0.27）<枝（1.02）。

從選取的柑橘品種各組織中分離的內生真菌相似性指數范圍為0～0.22（表4）。其中，在采自桂林的溫州蜜柑和沙糖桔中，二者葉片中的相似性最高，其次為溫州蜜柑的葉與枝。而從梧州采集的沙糖桔的葉與其枝中內生真菌的相似性指數為0，并且其葉與桂林采集的沙糖桔的葉、枝，以及其枝與桂林沙糖桔的枝、溫州蜜柑的枝中內生真菌的相似性指數均為0，表明從梧州采集柑橘抗病品種中的內生真菌與桂林采集的柑橘抗病品種中的內生真菌組成差異較大。

2.4 柑橘內生真菌發(fā)酵產物對柑橘潰瘍病菌抑制活性

基于拮抗預試驗結果，測定了30株內生真菌發(fā)酵產物粗提物對柑橘潰瘍病菌的抑制活性，結果如表6所示。當內生真菌發(fā)酵粗提物處理濃度為10 mg·mL1時，除內生真菌WZMGY27外，其余29株菌株對柑橘潰瘍病菌均有抑制作用。進一步測定29株內生真菌對柑橘潰瘍病菌的最低抑制濃度（表5），發(fā)現(xiàn)29株內生真菌乙酸乙酯粗提物對柑橘潰瘍病菌均有不同程度抑制作用，最低抑制濃度（MIC）介于0.156～10 mg·mL1之間。本次選取的16株溫州蜜柑內生真菌中，有9株（56.25%）菌株對柑橘潰瘍病菌的MIC小于1 mg·mL1;在選取的7株桂林沙糖桔內生真菌中，有5株（71.43%）菌株對柑橘潰瘍病菌的MIC小于1 mg·mL1;在選取的7株沙糖桔（梧州）內生真菌中，有2株（28.57%）菌株對柑橘潰瘍病菌的MIC小于1 mg·mL1。結果表明，采自桂林的柑橘抗病品種的高活性菌株多于梧州的柑橘抗病品種。

不同柑橘抗病品種中的優(yōu)勢屬及特有屬菌株對柑橘潰瘍病菌均有不同程度的抑制活性。在溫州蜜柑中，優(yōu)勢屬和特有屬對柑橘潰瘍病菌的MIC分別介于0.312 5～10 mg·mL1和0.156 ～0.625 mg·mL1之間。其中，其特有屬中的菌株WZMGY12（間座殼屬）、WZMGJ81（裂褶菌屬）和WZMGJ9（裂褶菌屬）對柑橘潰瘍病菌具有最佳抑制活性，MIC均為0.156 mg·mL1;短梗霉屬、枝孢屬也是僅分布于溫州蜜柑中的菌屬，該屬菌株WZMGJ82、WZMGJ1對柑橘潰瘍病菌也均有較好的抑制活性，MIC分別為0.312 5、0.625 mg·mL1;溫州蜜柑中的優(yōu)勢屬刺盤孢屬（27.78%）、鏈格孢屬（15.28%）對柑橘潰瘍病菌的MIC分別介于0.312 5～10 mg·mL1和0.625～10 mg·mL1之間。對于優(yōu)勢屬 （球座菌屬）中的菌株，本次僅選取一株（WZMGY24）進行測定。采自桂林的沙糖桔中的優(yōu)勢屬及其特有屬對柑橘潰瘍病菌也有不同程度的抑制作用，MIC分別介于0.312 5～5 mg·mL1和0.312 5～2.5 mg·mL1之間，其中小球腔菌屬既是其優(yōu)勢屬，也是其特有屬。此外，與其他柑橘樣品的共有屬鐮刀菌屬中的菌株LJZY20也對柑橘潰瘍病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性，MIC為0.312 5 mg·mL1。采自梧州的沙糖桔中的內生真菌優(yōu)勢屬和特有屬對柑橘潰瘍病菌的MIC均介于0.312 5～5 mg·mL1之間，其中附球菌屬既是其優(yōu)勢屬，也是其特有屬。

具有活性的內生真菌在不同組織中均有分布，枝條中含有的高活性菌株略多于葉片。在本次測定的30株內生真菌中。16株分離自葉片，其中8株 （50%）對柑橘潰瘍病菌的MIC<1 mg·mL1;14株分離自枝條，8株（57.14%）對柑橘潰瘍病菌的MIC<1 mg·mL1。

綜上所述，采自桂林的柑橘抗病品種的高活性菌株多于梧州的柑橘抗病品種;內生真菌中的優(yōu)勢屬及特有屬中的部分菌株對柑橘潰瘍病菌具有較好的抑制活性;具有活性的內生真菌在不同組織中均有分布，且枝條中含有的高活性菌株略多于葉片。

3 討論與結論

本次從柑橘抗病品種中總共分離得到72株內生真菌，歸為14個屬。分離的菌株數量顯著少于前人報道的從柑橘中分離的內生真菌數量（羅永蘭等， 2005a，b; Juybari et al.， 2019; Nicoletti， 2019; Sadeghi et al.， 2019），可能與采集的柑橘品種、采集時間、采集地點、樣本量及分離過程中的消毒方法等多種因素有關（羅永蘭等， 2005b; 王利娟和賀新生， 2006; Juybari et al.， 2019; Sadeghi et al.， 2019）。Petrini & Fisher（1986）曾提出偶見種或稀有種的檢出概率通常與采樣量的大小成正比。不同樣品、不同組織部位消毒時間的差異也會顯著影響內生真菌的分離（王利娟和賀新生， 2006）。因此，后續(xù)可對柑橘不同品種、不同組織部位內生真菌分離純化的消毒時間進行系統(tǒng)優(yōu)化，并增加樣本量（包括擴大柑橘品種數量，更多組織部位、分布地點，不同年份及季節(jié)等）的采集和分離。

不同采集地的柑橘抗病品種中內生真菌的分布差異較大。溫州蜜柑的內生真菌多樣性最高，其次為采自桂林的沙糖桔，而采自梧州沙糖桔中的內生真菌多樣性最低。并且，采自桂林的柑橘樣品枝葉中內生真菌多樣性變化與采自梧州的有所不同，桂林柑橘樣品中均為葉片中內生真菌多樣性高于枝條，而梧州柑橘樣品中的葉片內生真菌多樣性低于枝條。另外，采自梧州的沙糖桔葉片中的內生真菌與采自桂林的沙糖桔枝、葉中的內生真菌相似指數均為0，其枝條中的內生真菌與桂林沙糖桔和溫州蜜柑枝條中的內生真菌相似指數也均為0。不同柑橘樣品中的優(yōu)勢屬有所差異，溫州蜜柑的優(yōu)勢屬為刺盤孢屬、鏈格孢屬及球座菌屬，采自桂林的沙糖桔的優(yōu)勢屬為球座菌屬、小球腔菌屬，采自梧州的沙糖桔的優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬、附球菌屬、刺盤孢屬。前人報道的來自不同柑橘樣品中的內生真菌優(yōu)勢屬也存在一定差異，如Juybari et al.（2019）報道的柑橘（Citrus sinensis）內生真菌的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬;羅永蘭等（2005a）從溫州蜜柑（柑類）、甜橙（橙類）、文旦柚（柚類）中分離鑒定的24個屬中，刺盤孢屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬為優(yōu)勢屬;Durán et al.（2005）報道的檸檬（Citrus limon）內生真菌的優(yōu)勢屬為刺盤孢屬;Araújo et al.（2001）報道的不同柑橘品種中內生真菌的優(yōu)勢屬為刺盤孢屬、球座菌屬和枝孢屬。以上研究表明，植物中內生真菌群落結構受宿主及其分布的地理位置影響（Durán et al.， 2005; 羅永蘭等， 2005b; 高劍， 2013; 黃謙， 2015; Sadeghi et al.， 2019）。Summerbell（2005）研究指出相差幾平方千米的生長區(qū)就可能影響根部真菌的群體結構。羅永蘭等（2005b）研究發(fā)現(xiàn)柑橘內生真菌種群出現(xiàn)的頻率隨地理緯度的升高而降低。但是，本研究結果并不符合此規(guī)律，可能與樣本量較小無法體現(xiàn)出規(guī)律有關，也可能是受降水量等其他因素影響。Loro et al.（2012）發(fā)現(xiàn)委內瑞拉西北部三個不同環(huán)境的草本植物內生真菌的多樣性和定殖率與緯度呈負相關，而干旱、半干旱環(huán)境可能因為條件特殊不符合此規(guī)律。另外，Carroll et al.（1978）研究發(fā)現(xiàn)花旗松內生菌的定殖率可能與年降水量成正相關。此外，有研究發(fā)現(xiàn)柑橘種子中未發(fā)現(xiàn)內生真菌存在，推測柑橘中的內生真菌并非垂直傳播，而是來自周圍環(huán)境（Nicoletti， 2019）。植物內生菌可來源于空氣、雨水和土壤等，不斷從環(huán)境中積累，進而使內生菌組成表現(xiàn)出地理差異性。此外，柑橘產區(qū)的土壤成分、農藥的噴施、肥料的施用等也可能對內生真菌的組成和分布具有影響（Tian et al.， 2004; Eschen et al.， 2010; Peroh， 2013; Sadeghi et al.， 2019），而具體的影響機制還有待更深入的研究。

不同組織中的內生真菌群落結構差異較大，部分菌株的分布具有組織偏好性。采自桂林的溫州蜜柑和沙糖桔均為葉片中的內生真菌的多樣性高于枝條;而采自梧州的沙糖桔為葉片中的多樣性低于枝條。葉片中的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬、刺盤孢屬、球座菌屬，枝條中的優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬、裂褶菌屬、附球菌屬。其中，鏈格孢屬、間座殼屬、炭墊菌屬和黑孢屬僅分布在葉片中，短梗霉屬、枝孢屬、小球腔菌屬、彎孢霉屬、附球菌屬、棒孢屬、裂褶菌屬僅分布在枝條中，該結果與前人研究結果有較大差異。如Sadeghi et al.（2019）研究柑橘（Citrus reticulata cv. Siyahoo）不同組織（葉、枝、主干、根）中內生真菌組成差異，發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬也僅分布于葉片中，而短梗霉屬在葉、枝、主干中都有分布，枝孢屬分布于所有研究的組織中。殷恭毅等（1981）在柑橘主干主枝皮層、1到3年生小枝皮層及當年生葉片中均發(fā)現(xiàn)含有鏈格孢屬，而枝孢屬和彎孢霉屬僅存在于葉片中。羅永蘭（2005a）研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬在主干皮層、枝條、果皮、葉和根中均有分布。以上不同研究結果進一步表明，不同年份、不同季節(jié)、不同地點采集的不同柑橘植株，其內生真菌的分布情況均有可能不同（羅永蘭等， 2005a， b; Sadeghi et al.， 2019）。

柑橘抗病品種中含有的內生真菌普遍具有抗柑橘潰瘍病菌活性，優(yōu)勢屬及特有屬中的部分菌株對柑橘潰瘍病菌均具有較好的抑制活性。選取的30株內生真菌中，有29株具有抗柑橘潰瘍病菌的活性，共歸為14個屬。由此可見，柑橘中可產生抗柑橘潰瘍病菌活性代謝產物的內生真菌豐富多樣。柑橘抗病品種的優(yōu)勢屬中的不同菌株對柑橘潰瘍病菌具有不同程度抑制活性，MIC介于0.312 5～10 mg·mL1之間;特有菌屬對柑橘潰瘍病菌的MIC介于0.156～5 mg·mL1之間，總體優(yōu)于柑橘抗病品種中優(yōu)勢屬。并且，本次從溫州蜜柑葉中分離得到的間座殼屬的菌株WZMGY12，以及從枝中分離得到的裂褶菌屬的菌株WZMGJ81和WZMGJ9表現(xiàn)的抗菌活性最佳。其中，間座殼屬真菌既是柑橘及其他植物中廣泛存在的內生真菌菌屬（Huang et al.， 2015; Cui et al.， 2017; Brissow et al.， 2017），同時也是柑橘及其他植物中廣泛存在的病原菌屬（Gomes et al.， 2013; 黃峰， 2015; 李媛等， 2017）。已有大量研究表明該屬內生真菌代謝產物具有廣譜抗菌活性（Chepkirui & Stadler， 2017）。也有報道表明裂褶菌屬內生真菌可產生具有顯著抗菌活性的代謝產物（Vieira et al.， 2012; 李元銘， 2016）。以上研究表明間座殼屬、裂褶菌屬菌株對其宿主溫州蜜柑防御柑橘潰瘍病菌侵害可能具有極為重要的作用。有關特有屬與柑橘抗病性互作關系有待后續(xù)進一步深入研究。此外，此次研究的柑橘抗病品種中均含有鐮刀菌屬，且該屬菌株均表現(xiàn)出顯著抑菌活性。郭東升等（2020）研究發(fā)現(xiàn)柑橘內生鐮刀菌屬菌株（Fusarium avenaceum Gds1）發(fā)酵產物對柑橘青霉病具有高效穩(wěn)定的防治效果;趙昌會等（2008）研究發(fā)現(xiàn)柑橘內生鐮刀菌屬菌株對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及黑曲霉均具有抑制作用。以上研究表明，鐮刀菌屬內生真菌產生的代謝產物對柑橘防御病害可能具有重要作用，后期可加強該方面研究。

綜上所述，柑橘抗病品種中含有豐富的內生真菌資源，內生真菌的組成及高活性菌株數量的分布受宿主、組織及地理位置影響。但是，本研究未系統(tǒng)性研究同一果園不同柑橘抗病品種中內生真菌的組成、分布及其抗菌活性與柑橘抗病性的關系。另外，有關柑橘內生真菌次生代謝產物抗菌活性方面的研究仍較少，且尚未見有關柑橘內生真菌發(fā)酵產物抑制柑橘潰瘍病菌的研究報道。后續(xù)可深入探討柑橘抗病品種中內生真菌種類、抗菌活性與其宿主抗病性關系，進一步挖掘柑橘中的活性內生真菌，并研究活性菌株的活體抗菌活性，以及其活性成分和作用機制，為開發(fā)可替代的殺菌劑防治柑橘潰瘍病以及柑橘產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎。

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（責任編輯 周翠鳴）