高園園 張龍平 任艷云 朱庚振 劉國偉 王南南

摘要：為進(jìn)一步探討山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)根腐病的病原菌及種類，于2020年從山東省濟(jì)寧市任城區(qū)、金鄉(xiāng)縣，菏澤市巨野縣，臨沂市蘭陵縣等采集發(fā)病大蒜植株，通過組織分離法獲得4株分離物，利用形態(tài)學(xué)鑒定方法，結(jié)合Blast同源性分析，利用MAGE 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法對分離物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮孢菌（F. solani）、芳香鐮孢菌（F. redolens）、木賊鐮孢菌（F. equiseti）是山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)根腐病的致病菌。通過對比4種鐮孢菌對大蒜根腐病的致病性發(fā)現(xiàn)，分離出尖孢鐮孢菌的植株根腐病最為嚴(yán)重，可見尖孢鐮孢菌是大蒜根腐病病害的主要致病菌。結(jié)果可為大蒜根腐病拮抗菌的篩選和防治及大蒜——根腐病互作機理研究提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：大蒜;根腐病;尖孢鐮孢菌;病原菌鑒定;腐皮鐮孢菌;芳香鐮孢菌;木賊鐮孢菌

中圖分類號：S436.33 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0086-04

大蒜（Allium sativun L.）為百合科蔥屬一年生或二年生草本植物，原產(chǎn)于西亞和中亞，漢代張騫出使西域帶回我國[1]，至今已有2 000多年的種植歷史[2]。大蒜性溫味辛，富含營養(yǎng)物質(zhì)，是人們生活中重要的蔬菜和調(diào)味品。據(jù)統(tǒng)計，我國是世界上大蒜種植面積最大、產(chǎn)量最高的國家[3]，大蒜種植成為多數(shù)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱性產(chǎn)業(yè)和出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一[4]。近年來隨著大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和效益的增加，在大蒜主產(chǎn)區(qū)由于連作、管理不善等因素影響，大蒜病害呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢[5]，尤其是大蒜根腐病較為嚴(yán)重，影響大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)。已有研究表明，根腐病發(fā)生是由多種病原菌混合侵染造成的[6]，比如牡丹根腐病病原菌是茄腐皮鐮刀菌（Fusarium solani） 、鏈格孢菌（Alternaria spp.） 、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等;甜瓜、黃瓜、苜蓿等作物的根腐病病原菌是茄腐皮鐮刀菌;寧國山核桃根腐病的病原是尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）。有關(guān)大蒜根腐病的病原，前人進(jìn)行了一定研究，已知的有真菌性和細(xì)菌性病原菌。張博等通過對病株進(jìn)行分離和致病力測定，確定致病菌是腐霉（Pythium）[7];而有的研究則認(rèn)為大蒜根腐病是由鐮刀菌屬的真菌引起的，其中尖孢鐮刀菌是致病的優(yōu)勢種[8];有的研究則認(rèn)為大蒜根腐病屬細(xì)菌性病害，是大蒜軟腐病的一種[9];由此可見，導(dǎo)致大蒜根腐病的致病菌在不同地區(qū)存在差異。本研究以大蒜根腐典型發(fā)病植株為供試材料，采用組織分離法對病原菌進(jìn)行分離純化，運用菌落形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，以期明確導(dǎo)致大蒜發(fā)生根腐病的病原菌種類，旨在為大蒜生長過程中根腐病病害的有效防治提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

于2020年從山東省濟(jì)寧市任城區(qū)、金鄉(xiāng)縣，菏澤市巨野縣，臨沂市蘭陵縣等大蒜種植主產(chǎn)區(qū)采集發(fā)病的植株樣品，將以上樣品保存于無菌采樣袋中，立刻到實驗室進(jìn)行病原菌分離。

真菌固體培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌分離[10-11]，取患根腐病的大蒜植株，流水沖洗根部30 min，75%乙醇浸泡1 min，3%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干。取病健交界處用無菌刀切2 cm小段接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接純化。

1.2.2 菌株的致病性測定 斜面保存的菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng) 7 d，制成107個孢子/mL的孢子懸浮液，用于接種備用，裝有基質(zhì)的組培瓶滅菌后備用。采集苗期大蒜植株，用流水沖洗20 min，乙醇消毒鱗莖和根部 1 min，無菌水沖洗5次，移栽到滅過菌的基質(zhì)中，加入25 mL菌懸液灌根，對照組接無菌水培養(yǎng)，觀察接種后的發(fā)病情況。根據(jù)科赫法則，對發(fā)病的植株再次進(jìn)行病原菌分離，并與原接種菌株進(jìn)行比較。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態(tài)觀察 將分離到的致病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)。挑取菌絲進(jìn)行菌體顯微觀察，參照《真菌鑒定手冊》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[12]。

1.2.3.2 ITS序列分析 將純化培養(yǎng)好的菌株用真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，DNA 片段經(jīng)膠回收試劑盒回收，將擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 從NCBI網(wǎng)站下載與待測菌株相似的序列，通過CLUSTAL_X （version 1.81）[13]進(jìn)行序列比對，去除冗余序列。用鄰接法（neighbour-joining，NJ）[14]在MEGA 7.0[15]軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)定值Bootstrap均為500次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化結(jié)果

通過組織分離法從發(fā)病大蒜植株中分離到4株菌落形態(tài)特征不同的真菌菌株，依次編號為55R-1、BR917-3、JSS6、LZR，進(jìn)一步分離純化培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

2.2 菌株致病性測定

采用科赫法則進(jìn)行致病性驗證，將分離到的菌株重新接種到健康大蒜植株上。接種7 d后，分別接種不同病原菌分離物的植株均呈明顯干枯癥狀，根部呈腐爛狀（圖1）。對根部發(fā)病部位重新分離病原菌，分離結(jié)果與原接種真菌一致。根據(jù)科赫法則，證明接種的真菌55R-1、BR917-3、JSS6、LZR是引起大蒜根腐病的致病菌。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)特征鑒定 菌株55R-1菌落顏色呈白色，菌落背面為淺黃色，生長速度中等，菌絲白色、絮狀、致密。大分生孢子紡錘形，有橫隔，1～3隔常見，小分生孢子棒槌形（圖2）。

菌株BR917-3菌落顏色呈白色，菌落背面呈黃色，中心區(qū)域菌絲隆起，絮狀茂盛，邊緣菌絲顏色稍暗。大分生孢子細(xì)長，鐮刀型或紡錘形，1～3 個隔膜，兩端細(xì)胞尖或稍彎，小分生孢子紡錘形或者橢圓形（圖3）。

菌株JSS6菌落顏色呈白色，菌落背面為土黃色。菌絲白色、密實、邊緣齊。小孢子長橢圓形，大孢子頂端漸尖，呈鐮刀狀，多數(shù)3隔（圖4）。

菌株LZR菌落呈同心環(huán)狀，初期顏色為淺白色，在生長后期中心圓環(huán)區(qū)呈土黃色，菌落背面黃色。大型分生孢子呈鐮刀型，1～3橫隔，小型分生孢子呈卵圓形或柱形，偶有橫隔（圖5）。

2.3.2 ITS序列分析 對PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電泳結(jié)果見圖6，擴增條帶大小在510～540 bp之間。

將4個菌株ITS序列進(jìn)行Blast同源性分析，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。菌株55R-1與芳香鐮孢菌（F. redolens）表現(xiàn)出最高相似度（100%）且聚在一支，結(jié)合菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果，鑒定菌株55R-1為芳香鐮孢菌;菌株JSS6與木賊鐮孢菌（F. equiseti）的同源性最高，相似性100%且與該物種其他菌株均聚在一支，結(jié)合菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果，鑒定菌株JSS6為木賊鐮孢菌;菌株BR917-3與尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）的相似性最高（100%）且聚到一支，結(jié)合菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果，鑒定菌株BR917-3為尖孢鐮孢菌;菌株LZR與腐皮鐮孢菌（F. solani）的其他菌株均聚到一支且表現(xiàn)出最高相似性（100%），結(jié)合菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果，鑒定菌株LZR為腐皮鐮孢菌。

3 討論

近年來由于市場需求增大，大蒜種植盲目擴大生產(chǎn)，連作、病害、種質(zhì)資源退化等已成為山東省大蒜生產(chǎn)的主要限制因素[16]，尤其是土傳病害已嚴(yán)重制約和影響大蒜的產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善。張麗等研究表明，土傳病害的病原菌種類和數(shù)量與氣候、土壤類型及生物因子等密切相關(guān)[17]。前人對大蒜根腐病的致病菌進(jìn)行了大量研究，但不同地域的研究者分離得到的病原菌卻不盡相同[16]，可見不同區(qū)域大蒜根腐病的致病菌存在明顯差異。本研究從山東省3個地市4個縣（市、區(qū)）取樣大蒜根腐病病株，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定均為鐮孢菌屬，分別為尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、芳香鐮孢菌、木賊鐮孢菌，可見鐮孢菌屬是山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)根腐病的致病菌。但從分離地理區(qū)域來看，不同地域所分離到的分離物種類存在明顯差別[18]，究其原因可能與各縣（市、區(qū)）的地理位置、氣候因素和耕作制度等密切相關(guān)[11]。本研究的取樣區(qū)域多采取大蒜連作種植模式，該種植模式致使土壤地力下降，自身有毒物質(zhì)不斷積累，造成微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群發(fā)生明顯變化，加劇根腐病等土傳病害的發(fā)生[16]，這與張麗娟等的研究結(jié)果類似[8]。

同一種屬不同種類的致病菌對根腐病的致病效果差異明顯，本研究通過對比尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、芳香鐮孢菌、木賊鐮孢菌對大蒜根腐病的致病性發(fā)現(xiàn)，分離出尖孢鐮孢菌的植株根腐病較為嚴(yán)重，分離出腐皮鐮孢菌、芳香鐮孢菌、木賊鐮孢菌的植株根腐病較輕，可見尖孢鐮孢菌是該病害的主要致病菌。下一步筆者所在課題組將通過盆栽和大田試驗，進(jìn)一步研究在不同生長時期尖孢鐮孢菌對大蒜根腐病的致病機制，同時開展針對該病害的抗病品種選育和種苗繁育工作，篩選高效防治藥劑[19]，以期為防治山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)根腐病提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

綜上，尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、芳香鐮孢菌、木賊鐮孢菌均可導(dǎo)致山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)大蒜根腐病的發(fā)生，尤其是尖孢鐮孢菌是該病害的主要致病菌。本研究能為開展山東省大蒜主產(chǎn)區(qū)根腐病病害的深入研究和防治工作奠定理論基礎(chǔ)，為解決大蒜根腐病識別及科學(xué)防治提供了一定的參考，對提高大蒜產(chǎn)量和改善大蒜質(zhì)量意義重大。

致謝：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（161013201704）資助。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹 琳，曹 東，陳存坤，等. 鮮剝大蒜種腐敗微生物的分離純化及鑒定[J]. 中國釀造，2017，36（9）：123-126.

[2]鐘文文，劉婷婷，趙志龍，等. 山東省蒼山大蒜（Allium sativum）貯藏期新病原菌的分離與鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，46（21）：140-144.

[3]李旭雙，陳 典，梁 譽，等. 大蒜干腐病病原菌的分離鑒定[J]. 中國蔬菜，2012（20）：88-93.

[4]何 祎，范龔健，吳彩娥，等. 邳州地區(qū)霉腐蒜頭致病性真菌的分離鑒定[J]. 生物技術(shù)，2019，29（3）：267-271.

[5]程智慧，沈永杰. 大蒜紫斑病菌的分離及培養(yǎng)條件研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（2）：274-278.

[6]穆向榮，馬逾英，楊枝中，等. 藥用植物根腐病防治的研究進(jìn)展[J]. 中藥與臨床，2014，5（2）：5-8.

[7]張 博， 李長松，李 林，等. 大蒜腐霉根腐病藥劑防治試驗[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（8）：84-86，89.

[8]張麗娟，茆 軍，張志東，等. 新疆大蒜根腐型病害根際土壤微生物群落多樣性初探[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50（11）：2109-2117.

[9]沙榮艷，徐紅霞. 地膜大蒜根腐病的發(fā)生及防治技術(shù)[J]. 長江蔬菜，2009，23：30-31.

[10]陳 龍，王 勇，李旭雙，等. 大蒜干腐病原菌分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 北方園藝，2015（6）：110-113.

[11]蔣承歡，瞿鴻飛，王忠宇，等. 一種煙草細(xì)菌性病害病原菌分離培養(yǎng)及致病性測定[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（11）：72-75.

[12]趙金梅，高貴田，谷留杰，等. 中華獼猴桃褐斑病病原菌鑒定及抑菌藥劑篩選[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，4（23）：4916-4925.

[13]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X Windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[14]Zhang W，Sun Z R. Random local neighbor joining：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2008，47（1）：117-128.

[15]Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary ?genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[16]謝玉清，張麗娟，茆 軍，等. 新疆地區(qū)根腐病大蒜根際土壤微生物群落特征研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（21）：133-136.

[17]張 麗，耿肖兵，王春玲，等. 黑龍江省大豆鐮孢根腐病菌鑒定及致病力分析[J]. 植物保護(hù)，2014，40（3）：165-168.

[18]張德珍，李鵬昌，陳曉霞，等. 山東省小麥根腐病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2016，43（2）：233-240.

[19]王容燕，高 波，陳書龍，等. 河北省甘薯鐮孢菌腐爛與潰瘍病的病原鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2016，43（2）：241-247.