王雨凡 王津果 王靜文 周偉 易樂飛 蔣書英

摘要：真江蘺是我國重要的栽培藻類，具有較高的經(jīng)濟價值、藥用價值和生態(tài)價值。為了優(yōu)化真江蘺四分孢子放散、附著、萌發(fā)和生長等過程的培養(yǎng)條件，選擇溫度、光照度和鹽度3個環(huán)境因子，采用單因素試驗研究不同環(huán)境因子對真江蘺四分孢子放散和發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：溫度、光照度和鹽度對真江蘺四分孢子放散和發(fā)育具有顯著影響（P<0.05），當溫度為20～25 ℃、光照度為15～60 μmol/（m2·s）、鹽度為28‰～36‰時，真江蘺孢子放散量達到最大值2.8～3.3×106個/g;低溫（15～25 ℃）、低光[15～60 μmol/（m2·s）]和低鹽（24‰～32‰）有利于四分孢子的附著和萌發(fā)，真江蘺孢子附著率高于85%，萌發(fā)率高于90%;中溫（20～25 ℃）、高光[60～100 μmol/（m2·s）]和低鹽（24‰～32‰）有利于真江蘺孢子后期（直立體階段）幼苗的生長發(fā)育，線性生長速率最高可達（148.95±4.28） μm/d。研究優(yōu)化了真江蘺四分孢子放散和培育的條件，為探索真江蘺室內(nèi)采孢子育苗提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：真江蘺;江蘺;四分孢子;孢子放散;采孢子育苗

中圖分類號： S968.43+4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）14-0160-06

作為世界范圍內(nèi)廣泛分布的海洋大型藻類，江蘺屬海藻目前已記錄的種類超過100個[1-2]，其中國內(nèi)有30余種[3]。江蘺屬海藻含有豐富的瓊膠，占干質(zhì)量的20%～30%，是提取瓊膠的重要原料，具有重要的經(jīng)濟價值。世界瓊膠含量的53%來源于江蘺屬海藻，其所產(chǎn)瓊膠質(zhì)量好，品質(zhì)僅次于石花菜[4]。同時，藻體內(nèi)一些天然生物活性物質(zhì)，如藻紅素、?；撬岷涂寡趸傅?，可用于保健和食品領(lǐng)域[2，4]。作為重要的藍色碳匯，江蘺生長可吸收海水中大量的CO2，對于維系生態(tài)系統(tǒng)中碳氧平衡具有重要的生態(tài)意義[5]。

江蘺具有典型的三世代型生活史，包含四分孢子體世代（2n）、果孢子世代（2n）和配子體世代（n）3個交替的世代，其中成熟的四分孢子體形成四分孢子囊，經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分孢子（n），通過四分孢子釋放、附著、萌發(fā)、盤狀體階段和直立體階段發(fā)育為雌雄配子體;配子體成熟后產(chǎn)生不動精子和果胞，通過受精作用形成合子，繼而發(fā)育為果孢子體，寄生在雌配子體上;待果孢子體發(fā)育成熟后釋放果孢子（2n），最終形成四分孢子體[6]。完成整個生活史需要大概1年左右時間。

我國江蘺規(guī)?；耘嚅_始于20世紀70年代，經(jīng)過半個世紀的發(fā)展，目前全國江蘺產(chǎn)量約35萬t（干質(zhì)量），栽培規(guī)模接近1萬hm2[7]，成為全國第二大栽培藻類，栽培物種主要包括龍須菜、真江蘺、脆江蘺、俄羅斯江蘺等。傳統(tǒng)江蘺栽培主要依靠營養(yǎng)繁殖，利用筏式栽培技術(shù)，采用藻段夾苗、水平或垂掛養(yǎng)方式。該方式具有生長快速、操作簡單、易于收獲等優(yōu)勢，然而也存在占用大量起始材料、勞動力和場地等弊端[8]。據(jù)估計，收獲藻體的30%將被留作苗種，用作下一季江蘺栽培的苗種[9]。規(guī)?；耘嗨妹绶N的來源成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。采孢子育苗是有效的解決途徑之一，在一些規(guī)?；耘嗪Ｔ逯幸驯怀晒?yīng)用[8，10-11]，在江蘺物種中也有應(yīng)用的可能性[12-13]。該方法可以利用較少的藻體材料，生產(chǎn)大量均一的材料，有利于改善和緩解江蘺的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀。

采孢子育苗涉及一些重要過程，如孢子放散、附著、萌發(fā)、直立體生長等。真江蘺是江蘺屬的典型物種，也是我國規(guī)?；耘嗟闹匾孱愔?。目前，有關(guān)多因子對其四分孢子放散和孢子影響的研究有待進一步完善。鑒于此，本研究選擇溫度、光照度和鹽度3個環(huán)境因子，研究不同環(huán)境因子對真江蘺四分孢子放散和發(fā)育的影響，以期得到適宜的培養(yǎng)條件，旨在為探索真江蘺室內(nèi)采孢子育苗提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料采集及預(yù)處理

野生的真江蘺四分孢子體于2019年11月10日采自青島市湛山灣潮間帶礁石（地理位置為36° 03′ N、120° 22′ E），加冰冷藏后帶回實驗室用于下一步試驗。用毛刷清潔藻體、去除泥沙后，在0.7%次氯酸鈉溶液中放置2 min，隨后用滅菌海水沖洗2次。用含有0.1 g/L卡那霉素、0.02 g/L頭孢菌素、0.2 g/L 制霉菌素、1.0 g/L硫酸鏈霉素和0.3 g/L青霉素的滅菌海水處理藻體6 h，預(yù)防藻體表面菌對四分孢子放散產(chǎn)生影響。將處理后的藻體在20 ℃、30 μmol/（m2·s）、鹽度32‰、光—暗周期為12 h—12 h 的條件下預(yù)培養(yǎng)1周待用，培養(yǎng)過程使用PES培養(yǎng)基[5]。

1.2 試驗設(shè)計及處理

選擇3個環(huán)境因子（溫度、光照度和鹽度），每個因子設(shè)置5個不同水平，其中溫度處理設(shè)置為15、20、25、30、35 ℃[其余條件：光照30 μmol/（m2·s）、鹽度32‰、光—暗周期12 h—12 h];光照度處理水平設(shè)置為15、30、45、60、100 μmol/（m2·s）（其余條件：溫度20 ℃、鹽度32‰、光—暗周期12 h—12 h）;鹽度處理水平設(shè)置為24‰、28‰、32‰、36‰、40‰[其余條件：溫度 20 ℃、30 μmol/（m2·s）、光—暗周期 12 h—12 h]。將預(yù)培養(yǎng)藻體的一級分枝切成2 cm長的小段，隨機取10段（質(zhì)量約為0.5 g）放入9 cm玻璃培養(yǎng)皿中，加入30 mL含PES培養(yǎng)基的滅菌海水，置于事先設(shè)計的條件組合下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次，每3 d更換1次培養(yǎng)基。

1.3 孢子放散量的統(tǒng)計

每天觀察藻體表面變化，待四分孢子囊發(fā)育成熟且開始放散時，逐日統(tǒng)計四分孢子的放散量，直至放散結(jié)束，采用加和方式計算每個處理組藻體的總四分孢子放散量（Trel）。

1.4 孢子附著率的統(tǒng)計

利用倒置顯微鏡觀察四分孢子附著情況，統(tǒng)計24 h內(nèi)四分孢子的附著總量（Tad），用以下公式計算孢子附著率（Rad）：Rad=Trel/Tad×100%。

1.5 孢子萌發(fā)率的統(tǒng)計

用倒置顯微鏡觀察四分孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計附著后開始分裂并長成盤狀體的數(shù)目（Tgerm），用以下公式計算孢子附著率（Rgerm）：Rgerm=Tgerm/Tad×100%。

1.6 生長速率的測定

當孢子發(fā)育為直立體階段時，統(tǒng)計幼苗的長，計算相應(yīng)的線性生長速度（VL），公式如下[7-9]：

VL（μm/d）=（Ln-L0）/T。

式中：Ln為試驗結(jié)束時藻體的長度，μm;L0為試驗開始時藻體的長度，μm;T為培養(yǎng)時間，d。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件執(zhí)行單因素方差分析，用Tukeys HSD法進行組間均值的配對比較，顯著性水平為0.05;所有數(shù)據(jù)均表示為“x±s”。用OriginPro 9.0繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對真江蘺四分孢子放散和生長的影響

如圖1-A所示，溫度對真江蘺四分孢子的放散具有顯著影響（P<0.05），在15～35 ℃的溫度范圍內(nèi)，四分孢子總放散量范圍為0.4×106～3.3×106 個/g，隨著溫度升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢;當溫度為20、25 ℃時，放散量達到峰值，分別為（3.2±0.3） ×106、（3.3±0.2）×106 個/g，二者之間沒有顯著性差異;當溫度達到30 ℃時，孢子放散量呈現(xiàn)明顯的受抑制現(xiàn)象，并且隨溫度升高受抑制現(xiàn)象明顯增強;當溫度為35 ℃時，孢子放散量達到最低值[（0.4±0.08）×106 個/g]，顯著低于其他處理組（P<0.05）。

如圖1-B所示，真江蘺四分孢子放散后24 h內(nèi)附著，附著率隨著溫度的變化而變化，在15～25 ℃ 溫度范圍內(nèi)，四分孢子附著率為85.60%～90.56%，顯著高于其他處理（P<0.05）;隨著溫度繼續(xù)升高，孢子附著率呈現(xiàn)顯著下降趨勢，當溫度為30 ℃時，孢子附著率為（63.20±2.84）%，約為25 ℃時附著率的2/3;附著率最低值出現(xiàn)在35 ℃時，為（16.10±2.42）%，顯著低于其他處理組（P<0.05）。

真江蘺孢子放散后不經(jīng)休眠立即分裂，經(jīng)多次分裂發(fā)育成盤狀體，繼而生長為直立體幼苗。溫度對附著后孢子的發(fā)育具有明顯影響，萌發(fā)率出現(xiàn)顯著變化（P<0.05），趨勢與附著率高度相似。如圖

2-A所示，在15～25 ℃溫度范圍內(nèi)，四分孢子的萌發(fā)率為90.55%～94.80%，顯著高于其他處理（P<0.05）;隨著溫度繼續(xù)升高，孢子附著率呈現(xiàn)顯著下降趨勢，當溫度為30 ℃時，孢子萌發(fā)率為（58.90±2.92）%，約為20 ℃時萌發(fā)率的63.1%;萌發(fā)率最低值出現(xiàn)在溫度為35 ℃時，為（0.50±0.03）%，顯著低于其他處理組（P<0.05）。

如圖2-B所示，溫度對萌發(fā)后的幼苗生長具有明顯影響，幼苗線性生長速率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，具有明顯的峰值，在15～25 ℃溫度范圍內(nèi)，幼苗線性生長速率隨溫度升高逐漸升高，當溫度為25 ℃時達到最大值，為（146.39±7.16） μm/d，顯著高于其他處理組（P<0.05）;隨著溫度的繼續(xù)升高，生長速率呈顯著下降趨勢，35 ℃時達到最低值，為（5.47±2.38） μm/d，僅為最高值的3.7%。

2.2 光照度對真江蘺四分孢子放散和生長的影響

如圖3-A所示，真江蘺四分孢子的放散受光照的影響，在光照度為15～60 μmol/（m2·s）范圍內(nèi)，四分孢子總的放散量為2.9×106～3.2×106 個/g，區(qū)間內(nèi)各處理組間孢子放散量的變化無顯著差異;當光照度升高至100 μmol/（m2·s）時，光照顯著抑制了真江蘺孢子放散，放散量為（2.4 ± 0.192）×106 個/g，達到最低值，顯著低于其他處理組（P<0.05）。在不同光照度下，真江蘺四分孢子的附著率為76.8%～93.4%，各處理組間沒有顯著性差異（圖3-B）。

光照度對真江蘺孢子萌發(fā)的影響趨勢與光照度對孢子放散的影響趨勢相類似，表現(xiàn)為在高光照度下抑制孢子萌發(fā)的現(xiàn)象。如圖3-A和圖4-A所示，在 15～60 μmol/（m2·s）光照度范圍內(nèi)，孢子萌發(fā)率為89.00%～94.30%，各處理組之間沒有顯著性差異;當光照度升高至100 μmol/（m2·s）時，孢子萌發(fā)受到顯著抑制（P<0.05），萌發(fā)率為（76.40±4.05）%，達到最低值。

如圖4-B所示，隨著光照度的升高，幼苗生長呈逐漸增快的趨勢，當光照度為15 μmol/（m2·s）時，幼苗線性生長速率出現(xiàn)最低值，為（85.75±4.60） μm/d，顯著低于其他處理組（P<0.05）;當光照度升高至30 μmol/（m2·s）時，幼苗生長速率增加了37.6%，為（118.02±7.19） μm/d，與 45 μmol/（m2·s） 光照度處理間無顯著性差異; 當光照度為60、100 μmol/（m2·s） 時幼苗生長速率達到最大值，分別為（148.95± 4.28）、（145.47± 10.38） μm/d，2組之間無顯著性差異，但顯著高于其他處理組（P<0.05）。

2.3 鹽度對真江蘺四分孢子放散和生長的影響

如圖5-A所示，鹽度對真江蘺四分孢子放散具有明顯影響，在鹽度為24‰～36‰范圍內(nèi)，真江蘺孢子放散量為2.8×106～3.2×106 個/g，各處理組間沒有顯著性差異;隨著鹽度繼續(xù)升高，孢子放散量急劇下降，當鹽度為40‰時，放散量達到最低值（1.8±0.576）×106個/g，顯著低于其他處理組（P<0.05）。鹽度對真江蘺孢子附著率的影響也呈現(xiàn)相似的變化（圖5-B），當鹽度為24‰～36‰時，附著率為83.5%～92.5%，顯著高于鹽度為40‰時的孢子附著率（42.1 ± 6.32）%（P<0.05）。

如圖6所示，真江蘺孢子萌發(fā)率和生長速率隨鹽度的變化而發(fā)生顯著變化（P<0.05），當鹽度為24‰～32‰時，孢子萌發(fā)率、生長速率分別為92.4%～94.2%、129.43～138.02 μm/d，各處理組間無顯著性差異;當鹽度為36‰ 時，萌發(fā)率為（76.4±3.78）%，約為鹽度為32‰時的80%，顯著低于鹽度為24‰～32‰時的處理組，此時生長速率為（118.95±5.44） μm/d，也受到高鹽度抑制;生長速率和萌發(fā)率在鹽度為40‰時達到最低值，分別為（35.47±5.38） μm/d、（2.40±0.13）%，顯著低于其他處理組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

主要環(huán)境因子對海洋大型經(jīng)濟海藻孢子放散的影響已有報道[2，5，10，14-15]。本研究結(jié)果顯示，溫度、光照度和鹽度等對真江蘺四分孢子放散均具有顯著影響。當溫度為20～25 ℃、光照度為15～60 μmol/（m2·s）、鹽度為24‰～36‰時，真江蘺四分孢子放散量達到最大值2.8～3.3×106個/g，高達106個/g數(shù)量級，與龍須菜（2.70×106個/g）[2，14]、皮江蘺[16]的放散量相當。孢子是全人工育苗的重要材料，大量孢子為新個體的產(chǎn)生提供了種源，并在海帶、裙帶菜、條斑紫菜和壇紫菜中有大量應(yīng)用。目前，江蘺主要的繁育方式是營養(yǎng)繁殖，采用人工夾段的方式實現(xiàn)，栽培季節(jié)大量苗種的來源成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸環(huán)節(jié)。真江蘺具有典型的三世代型生活史，其中四分孢子體世代（2n）在表皮可形成大量四分孢子囊，完全發(fā)育成熟后釋放四分孢子繼而發(fā)育成雌雄配子體新個體[6]。Destombe等研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下，真江蘺雌雄配子體（n）在生長穩(wěn)定性方面更勝于四分孢子體（2n）[17]。Zhou等利用四分孢子實現(xiàn)了龍須菜的室內(nèi)采孢子育苗，并在小規(guī)模試驗中取得了成功[8]。真江蘺與龍須菜屬于近緣物種，具有相似的生物學(xué)特性和相似的四分孢子放散誘導(dǎo)條件，如具有相同的溫度、相似的鹽度和相近的光照度[8，16]，結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真江蘺釋放的大量孢子可作為實現(xiàn)室內(nèi)采孢子育苗的重要原料，為實現(xiàn)真江蘺有性生殖育苗提供了可能。

在采孢子育苗過程中，孢子附著率、萌發(fā)率和生長速率是重要的3個指標。本研究結(jié)果顯示，低溫（15～25 ℃）、低光照度[15～60 μmol/（m2·s）]和低鹽（24‰～32‰）有利于四分孢子的附著和萌發(fā)，真江蘺孢子附著率高于85%，萌發(fā)率高于90%，與龍須菜四分孢子的發(fā)育較為類似[5，14]，表明真江蘺四分孢子具有較高的活性和適應(yīng)性，可在較寬的溫度、光照度和鹽度范圍內(nèi)生存，為保障孢子發(fā)育成新個體提供了良好的基礎(chǔ)。中溫（20～25 ℃）、高光照度[60～100 μmol/（m2·s）]和低鹽度（24‰～32‰）有利于真江蘺孢子后期（直立體階段）幼苗的發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，在適宜環(huán)境下真江蘺的線性生長速率高達（148.95±4.28） μm/d，與龍須菜較為類似[14]，這暗示真江蘺采孢子育苗暫養(yǎng)時間可在較短時間（不超過10 d）內(nèi)完成。

我國江蘺的栽培以龍須菜、真江蘺和脆江蘺等為主，調(diào)研發(fā)現(xiàn)，受營養(yǎng)繁殖方式的影響，產(chǎn)業(yè)上江蘺栽培存在長期單一苗種使用的現(xiàn)象，這為產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了諸多弊端。在智利共和國沿海，單一智力江蘺苗種的使用會導(dǎo)致江蘺栽培產(chǎn)量的急劇下滑，Buschman等分析認為，多年營養(yǎng)繁育導(dǎo)致的藻齡偏高是減產(chǎn)的重要原因，并提出采孢子育苗是重要的解決途徑之一[18]。傳統(tǒng)的育苗占用大量的起始材料、勞動力和場地，在育苗成本上，采孢子育苗比傳統(tǒng)的營養(yǎng)繁殖育苗更具優(yōu)勢[19]。目前，基于采孢子育苗等技術(shù)手段的遺傳育種，已應(yīng)用在多個海洋藻類物種中，如智力江蘺[18]、龍須菜[5]。在野生生物資源的修復(fù)中，采孢子繁育也發(fā)揮了重要作用，采用混合采孢子方式，可在短期內(nèi)恢復(fù)可自我繁殖的自然群體[20]。諸多優(yōu)勢為探索真江蘺采孢子育苗及優(yōu)化過程中的培育條件等提供了更加廣闊的空間。本研究中，筆者選擇了溫度、光照度和鹽度3個環(huán)境因子，重點探討了單因素對采孢子重要過程包括孢子放散、附著、萌發(fā)和生長等階段的影響，得到了較優(yōu)的培養(yǎng)條件，并為真江蘺采孢子育苗提供了可行性和理論支持。

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