王 靜，肖秋肖，肖紅琴，康寧芳，鞏仔鵬，鄭 林，王愛民，李勇軍，黃 勇，李月婷*

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

0 引言

【研究意義】山慈菇又名毛慈菇，為蘭科植物杜鵑蘭[Cremastraappendiculata(D. Don) Makino]、獨(dú)蒜蘭[Pleionebulbocodioides(Franch) Rolfe]和云南獨(dú)蒜蘭[PleioneyunnanensisRolfe]的干燥假鱗莖[1]，主要分布在貴州、山西、陜西、甘肅、四川等地區(qū)，是我國的瀕危藥用植物[2]。山慈菇中含有黃酮類、生物堿、酚類、糖類等多種化合物[3-5]，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗血管生成、降低血壓血糖等多種藥理活性[5-9]。多糖作為山慈菇中的一種天然活性成分，因其具有的多種生物活性(降血脂、抗腫瘤、提高免疫功能)和無毒無害、無抗藥性等作用[10]，近年來已成為多個(gè)行業(yè)(食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥)關(guān)注的焦點(diǎn)。開展山慈菇活性物質(zhì)提取方面的研究，對進(jìn)一步促進(jìn)其在食品加工、生物制藥等方面的開發(fā)應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，提取多糖的新興工藝主要有超聲輔助提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法等[11-19]。其中超聲輔助提取法反應(yīng)速度快，但只適用于物理穩(wěn)定性的藥材；而酶提取法雖提取率高，但要求酶活力很高，且酶的價(jià)格昂貴?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】山慈菇多糖的提取工藝鮮有報(bào)道，而酶法和超臨界流體萃取法要求高、成本高、難以普遍使用；超聲波輔助提取法威力過大又容易破壞多糖結(jié)構(gòu)[20]。相比之下，傳統(tǒng)的水提醇沉法具有操作簡單、成本低、對多糖結(jié)構(gòu)影響小等優(yōu)點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于目前山慈菇多糖提取工藝的研究狀況，擬采用經(jīng)典方法(水提醇沉)對山慈菇的多糖類物質(zhì)進(jìn)行提取，為山慈菇多糖進(jìn)一步應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 山慈菇 購自毫州市永剛飲片廠有限公司。

1.1.2 試劑 無水-D葡萄糖對照品，貴州省貴陽市凱信生物工程有限公司；乙醇、苯酚、濃硫酸等，國產(chǎn)分析純，均為市購。

1.1.3 儀器設(shè)備 FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；EL-204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ALLEGRA X-30A離心機(jī)，貝克曼庫爾特有限公司；UV-2700紫外分光光度計(jì)，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山慈菇多糖的提取流程 干燥山慈菇藥材→粉碎機(jī)粉碎→過40目篩(山慈菇粉末)→水浴鍋回流提取→轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，過濾→取濾液→加乙醇進(jìn)行多糖沉淀→冷凍→離心(10 000 r/min，5 min)→取多糖沉淀→真空干燥→山慈菇粗多糖。

1.2.2 山慈菇多糖含量的測定

1) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用苯酚硫酸法測定山慈菇多糖含量[21]。先配制100 μg/mL的葡萄糖對照品溶液，存于4℃冰箱備用。精密吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL上述溶液于5支1 mL的已編號(hào)試管中，不足1 mL的加水補(bǔ)足，輕輕晃蕩，快速加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，將具塞試管置于沸水中保溫20 min，取出冷卻，在490 nm處測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合吸光度(y)與多糖濃度(x)的回歸方程。

2) 測定山慈菇樣品多糖含量。稱取0.5 g山慈菇粉末回流提取120 min，將提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容，過濾，在濾液中加醇使醇含量為80%，4℃冰箱醇沉過夜，取出，以10 000 r/min的速度離心5 min，取沉淀放于量瓶中定容，取1 mL置試管中，按上述方法進(jìn)行山慈菇多糖顯色并測定其吸光度，計(jì)算多糖的提取率。

提取率=(CVN/m)×100%

式中，C為待測溶液葡萄糖的濃度(μg/mL),V為待測溶液體積(mL),N為稀釋倍數(shù),m為山慈菇粉末質(zhì)量(g)。

1.2.3 山慈菇多糖的提取因素

1) 固液比。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個(gè)錐形瓶中，分別按固液比(g∶mL)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入不同比例的水，沸水浴回流120 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達(dá)80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復(fù)。

2) 提取溫度。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個(gè)錐形瓶中，按固液比1∶30 加入水，分別在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃等不同提取溫度下回流提取120 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達(dá)80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復(fù)。

3) 提取時(shí)間。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個(gè)錐形瓶中，按固液比1∶30加入水，沸水浴中分別回流提取30 min、60 min、90 min、120 min和150 min，提取液轉(zhuǎn)至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加95%醇使終濃度含醇量達(dá)80%，4℃醇沉過夜備用，3次重復(fù)。

4) 醇沉濃度。稱取5份0.5 g山慈菇粉末分別置于5個(gè)錐形瓶中，按固液比1∶30加入水，沸水浴回流120 min，提取液移至量瓶中定容至50 mL，過濾，分別加入95%醇使終濃度達(dá)70%、75%、80%、85%和90%，4℃冰箱醇沉過夜備用，3次重復(fù)。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合BOX-Behnken Design設(shè)計(jì)原理，以固液比、提取溫度和提取時(shí)間為考察對象，多糖提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行33的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以確定山慈菇多糖的最佳提取條件，試驗(yàn)編碼詳見表1。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合。通過響應(yīng)曲面圖和等高線圖可反映固液比、提取溫度、提取時(shí)間對山慈菇多糖提取率的影響，也可同時(shí)反應(yīng)影響因素間的相互作用。響應(yīng)曲面圖曲線越彎越陡，說明該條件對響應(yīng)值影響越大；反之曲線越平，說明該條件對響應(yīng)值的影響越小。等高線反應(yīng)因素間的交互強(qiáng)弱，等高線越密集，呈橢圓狀，表示交互越明顯，反之則表示交互不明顯[22]。

表1 山慈菇多糖提取的山慈菇多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6和Spss進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山慈菇多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在490 nm處測得不同濃度吸光度值，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，多糖濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。經(jīng)擬合得回歸方程：y=0.068 5x+0.038，R2=0.998 5。說明多糖濃度在2.857～14.286 μg/mL時(shí)吸光度與多糖濃度存在良好的線性關(guān)系。

圖1 山慈菇多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同提取條件山慈菇多糖的提取率

從圖2可知，固液比、提取溫度、提取時(shí)間和醇沉濃度等不同提取條件山慈菇多糖的提取率存在差異。

圖2 不同提取條件山慈菇多糖的提取率

2.2.1 固液比 隨著固液比的增加，山慈菇多糖的提取率呈先增后減趨勢，提取率為6.58%～7.63%，其中，固液比為1∶30時(shí)多糖提取率最高，1∶40時(shí)其次，1∶60時(shí)最低，依次為1∶30>1∶40>1∶20>1∶50>1∶60。在固液比1∶30時(shí)，多糖的提取率達(dá)最大，表明提取山慈菇多糖固液比以1∶30為宜。原因可能是固液比小時(shí)，山慈菇多糖溶出不充分；而固液比過大時(shí)，受溶解度的影響，山慈菇多糖的提取率變低[23]。因而，選取固液比為1∶20、1∶30和1∶40進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 提取溫度 山慈菇多糖的提取率隨溫度升高呈先增后減趨勢，提取率為6.74%～7.89%，其中，提取溫度為80℃時(shí)多糖提取率最高，70℃時(shí)其次，100℃時(shí)最低，依次為80℃>70℃>60℃>90℃>100℃。溫度為80℃時(shí)山慈菇多糖的提取率最大，表明提取溫度以80℃為宜。原因可能是山慈菇多糖在一定溫度范圍內(nèi)，溶解度增加，提取率增高，當(dāng)溫度超過適宜溫度時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致多糖提取率降低[24-25]。因而，選取提取溫度為70℃、80℃和90℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 提取時(shí)間 山慈菇多糖的提取率隨提取時(shí)間延長呈先增后減趨勢，提取率為6.83%～7.75%，其中，提取時(shí)長為120 min時(shí)多糖提取率最高，90 min時(shí)其次，150 min時(shí)最低，依次為120 min>90 min>60 min>30 min>150 min。在120 min時(shí)，山慈菇多糖的提取率最大，表明120 min為最佳提取時(shí)間。原因可能是山慈菇回流提取時(shí)間過短，多糖溶出不充分，提取率低；當(dāng)提取時(shí)間過度延長時(shí)，溶液又達(dá)飽和狀態(tài)，使得多糖溶出減少，且時(shí)間過長又會(huì)導(dǎo)致山慈菇的糖蛋白變性，析出沉淀，提取率變低[25]。因而，選取提取時(shí)間為90 min、120 min和150 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 醇沉濃度 山慈菇多糖的提取率隨醇沉濃度增加呈先增后減趨勢，提取率為7.08%～7.85%，其中，醇沉濃度為80%時(shí)多糖提取率最高，85%時(shí)其次，90%時(shí)最低，依次為80%>85%>75%>70%>90%。在濃度為80%時(shí)，多糖提取率達(dá)最大，表明醇沉濃度以80%為宜。原因可能是一定范圍內(nèi)的醇沉濃度可以降低山慈菇多糖的溶解度，利于山慈菇多糖的沉淀；而當(dāng)醇沉濃度過高時(shí)，會(huì)使一些雜質(zhì)一起沉淀，從而導(dǎo)致多糖不純，影響提取率[23]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果 從表2看出，17個(gè)處理山慈菇多糖提取率為6.89%～7.77%，其中，處理5和處理17，即固液比1∶30，提取溫度80℃，提取時(shí)間120 min時(shí)山慈菇多糖提取率最高，均為7.77%；處理15、處理1和處理12的試驗(yàn)條件與處理5和處理17相同，但山慈菇多糖提取率稍低，為7.65%～7.75%。各處理山慈菇多糖提取率依次為處理5=處理17>處理15>處理1>處理12>處理14>處理3>處理6=處理16>處理4=處理8>處理13>處理11>處理9>處理2>處理10>處理7。

表2 山慈菇多糖提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 Box-Behnken模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)對上述提取結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到山慈菇多糖提取率(Y)與提取因素 固液比(A)、溫度(B)和提取時(shí)間(C)的回歸擬合方程：

Y=7.73-0.060A-0.079B+0.049C-

0.002 5AB+0.013AC+0.22BC-0.056A2-

0.24B2-0.25C2

從表3看出，模型P<0.000 1，F(xiàn)=44.68，表明，試驗(yàn)二次模型可信度高，可用于描述因素與響應(yīng)值間的變化關(guān)系。決定系數(shù)R2=0.982 9，校正決定系數(shù)Radj2為0.960 9，變異系數(shù)CV為0.64%(較小)，失擬項(xiàng)0.625 7(>0.05)，說明模型擬合好，穩(wěn)定、可靠。同時(shí)，固液比與提取溫度的交互、固液比與提取時(shí)間的交互對山慈菇多糖提取率無顯著影響，而固液比、提取溫度、提取時(shí)間及固液比的交互對山慈菇多糖提取率影響顯著，提取溫度交互、提取時(shí)間交互及提取溫度與提取時(shí)間的交互對山慈菇多糖提取率影響極顯著。從A、B和C的F值大小可以判斷各因素對提取率的影響大小為B>A>C。

表3 Box-Behnken模型的方差分析結(jié)果

2.3.3 響應(yīng)面因素間交互作用 從圖2看出固液比、提取溫度、提取時(shí)間對山慈菇多糖提取率影響的變化及影響因素間的相互作用。

1) 固液比與提取溫度。2個(gè)影響因素有交互作用，提取率均隨影響因素的遞增呈先增后減趨勢，曲面圖呈現(xiàn)一種彎曲且陡峭的狀態(tài)。同時(shí)，等高線在提取溫度側(cè)較多，呈長圓形，說明，回流提取溫度對多糖提取率的影響優(yōu)于固液比。

2) 固液比與提取時(shí)間。響應(yīng)面曲面彎曲，2個(gè)影響因素有交互作用，多糖提取率隨影響因素的遞增呈先增后減趨勢。等高線在固液比一側(cè)聚集，呈長圓形，說明，固液比對多糖提取率的影響大于提取時(shí)間對多糖提取率的影響。

3) 提取溫度與提取時(shí)間。響應(yīng)面曲面彎曲呈弧狀，表明溫度和提取時(shí)間的交互作用十分明顯，多糖提取率均隨提取溫度與提取時(shí)間增加呈先增后減趨勢。等高線呈長橢圓狀，表明，二者交互作用十分明顯，但等高線更多聚集在溫度側(cè)，說明提取溫度對多糖提取率的作用占優(yōu)勢。

綜合看，Design-Expert 8.0.6優(yōu)化出的山慈菇多糖最佳提取工藝為固液比1∶40，提取溫度為78.61℃，提取時(shí)間為121.85 min，此時(shí)山慈菇多糖的預(yù)測提取率為7.62%。

圖3 不同處理?xiàng)l件山慈菇多糖提取率及其響應(yīng)面與等高線

2.4 提取工藝驗(yàn)證

由于試驗(yàn)操作條件有限，將提取工藝稍作修改，在提取條件為固液比1∶40、提取溫度79℃、提取時(shí)間122 min下重復(fù)試驗(yàn)3次，得山慈菇多糖提取率為7.04%，與預(yù)測值(7.62%)相比誤差小于1%。表明，使用該方法優(yōu)化山慈菇多糖提取工藝可靠、真實(shí)且具有代表性。

3 討論

山慈菇多糖的提取工藝在我國目前還處于初步階段，而實(shí)際上，國內(nèi)外研究提取多糖工藝已出現(xiàn)新興方法[13-20]，如水提醇沉法、溶劑提取法、酶提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、超高壓提取法及復(fù)合提取法等，每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。為了充分利用瀕危藥用植物山慈菇，為其多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)，該研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取山慈菇多糖，通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面法相結(jié)合優(yōu)化了山慈菇多糖提取條件，在此最佳提取條件下山慈菇多糖提取率為7.62%。較之房宇坤等[13]的水提醇沉法研究，提取條件得到進(jìn)一步優(yōu)化，為提高提取率奠定了一定基礎(chǔ)，也為食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域利用山慈菇多糖提供了一種提取方式。雖然傳統(tǒng)的水提醇沉法簡單、方便，但隨著時(shí)代的發(fā)展與進(jìn)步，今后應(yīng)順應(yīng)時(shí)代，嘗試多種新方法對提取工藝進(jìn)行考察、改進(jìn)，為縮短提取時(shí)間，獲得山慈菇多糖高提取率提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用最經(jīng)典的水提醇沉法和響應(yīng)面法結(jié)合優(yōu)化山慈菇多糖的提取工藝，獲得最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，即固液比(g∶mL)為1∶40、提取溫度為78.61℃、提取時(shí)間為121.85 min，山慈菇多糖的預(yù)測提取率為7.62%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化山慈菇多糖提取工藝得出，固液比、提取時(shí)間及提取溫度對山慈菇多糖提取率的影響依次為提取溫度>固液比>提取時(shí)間，提取溫度與提取時(shí)間的交互對山慈菇多糖提取率的影響較顯著，固液比與提取溫度的交互及固液比與提取時(shí)間的交互對山慈菇多糖提取率幾乎無影響?？紤]到實(shí)際操作限制，將提取工藝參數(shù)修改為固液比(g∶mL)1∶40、提取時(shí)間122 min、提取溫度79℃，此時(shí)山慈菇多糖的實(shí)際提取率為7.04%，與預(yù)測值基本一致。表明，該方法結(jié)果可靠，準(zhǔn)確，且具有操作簡單、方便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適用于山慈菇多糖的提取。