褚曉潔 蘆濤 葉涵斐 王盛 林晗 吳先美 何瑞 嚴鋼 王躍星 李三峰 路梅 胡海濤,* 楊窯龍,* 饒玉春,*

水稻葉片衰老基因的克隆與功能研究

褚曉潔1蘆濤1葉涵斐1王盛1林晗1吳先美2何瑞2嚴鋼1王躍星2李三峰2路梅1胡海濤1,*楊窯龍2,*饒玉春1,*

(1浙江師范大學化學與生命科學學院, 浙江金華 321004；2中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006；*通信聯(lián)系人, E-mail:ryc@zjnu.cn, yangxiao182@126.com, haitao-hu@zjnu.cn)

【目的】早衰突變體是研究早衰機制的良好載體，對于探究早衰的遺傳機理與作用機制及提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用?！痉椒ā勘狙芯坷肊MS誘變獲得了一個早衰突變體，并對該突變體及其野生型進行表型觀察、細胞學及組織化學分析、生理生化分析、遺傳分析、基因定位和激素處理?！窘Y果】的葉片從3葉期開始發(fā)黃，成熟期株高、有效分蘗數(shù)、結實率、千粒重等極顯著降低。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)葉表面光滑，硅質(zhì)化突起和葉綠體數(shù)目減少、片層結構紊亂。生理生化分析表明中有大量的活性氧積累，同時伴有蛋白質(zhì)的降解、細胞膜的損傷以及大規(guī)模的細胞死亡。遺傳分析表明該早衰表型受單隱性核基因控制，并且其在第5染色體上編碼了一個泛素結合酶。亞細胞定位結果證明LPS1蛋白在細胞質(zhì)與核中均有表達。外源激素處理發(fā)現(xiàn)，對外源激素的處理更為敏感，且突變促進了ABA合成相關基因的表達。【結論】突變使水稻ABA合成信號途徑異常，進而引發(fā)H2O2等一系列與衰老相關生理指標的異常變動，導致過早衰老，最終造成水稻產(chǎn)量嚴重降低。

水稻；早衰；遺傳分析；亞細胞定位；激素

植物的衰老是植株在生長發(fā)育的最后階段自發(fā)啟動的一種程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）的過程[1]。這一過程可以使衰老部位中的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等轉移至其他部位繼續(xù)參與植物體的生長發(fā)育，對植物的生長發(fā)育起著不可替代的作用[2]。衰老的有序進行在很大程度上保障了作物的產(chǎn)量及品質(zhì)安全。植物衰老的主要表現(xiàn)形式是葉片衰老[3-4]，葉片是水稻進行光合作用和呼吸作用最為重要的源器官，直接關系著水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量安全。葉片發(fā)生早衰是影響水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要決定因素之一[5]，水稻葉片發(fā)生早衰會嚴重影響葉片進行光合作用的效率，進而制約水稻產(chǎn)量的提高。因此，深入研究水稻葉片早衰的調(diào)控模型和分子機制具有重要意義。

目前對水稻葉片衰老的研究主要是利用衰老突變體鑒定葉片衰老相關基因（senescence- associated genes, SAGs）來解析水稻衰老的分子機制，在植物葉片衰老數(shù)據(jù)庫LSD 3.0（https:// bigd.big.ac.cn/lsd/index.php）中共收集了5853個與衰老相關的基因[6]，其中有188個是在水稻中鑒定的，這表明調(diào)控植物葉片衰老的基因涉及復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。根據(jù)SAGs所屬功能的不同，水稻葉片衰老相關基因主要分為轉錄因子基因（[7]、[8]、[9]、[10]、[11]等）、葉綠體發(fā)育及葉綠素降解相關基因（[12]、[13]、[14]、[15]等）、激素代謝相關基因（[16]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]等）和蛋白酶或物質(zhì)轉運代謝相關基因（[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、與[26]等）五類。

水稻生長發(fā)育的過程是一個不斷對抗和適應生物脅迫與非生物脅迫等不利環(huán)境的過程，這一過程由基因控制，并受內(nèi)外部環(huán)境因素的影響和誘導。植物激素在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、參與植物抗逆性方面有著不可缺少的作用[27]。一般來說，脫落酸（abscisic acid，ABA）[28]、乙烯（ethylene，ETH）[29]和茉莉酸類物質(zhì)（jasmonates，JAs）[30]等激素可加快葉片衰老，細胞分裂素（cytokinin，CTK）[31]、生長素（auxins，IAA）[32]和赤霉素(gibberellins，GAs)[33]等激素可以延緩葉片衰老[34]。ABA是植物生長發(fā)育、抵抗逆境的重要激素，具有調(diào)節(jié)植物生長、抑制種子萌發(fā)以及加快衰老等效應[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以有效抑制水稻幼苗地上部的生長[37]。低濃度的ABA可以促進初生根的生長，而高濃度的ABA則抑制初生根的生長[38-39]。Hung等[40]研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以通過誘導H2O2的產(chǎn)生，引起植物葉片的衰老。水稻離體葉片進行ABA處理后，引起離體葉片中H2O2和MDA含量顯著升高，葉綠素含量下降，進而加速葉片衰老[41]。然而現(xiàn)有研究中，水稻ABA信號途徑中僅有少數(shù)基因的功能被清晰闡釋，關于控制ABA合成和代謝相關基因尚缺乏充分研究。

為進一步研究水稻葉片衰老的分子機制，同時探究激素參與水稻衰老的調(diào)控機理，本研究利用EMS誘變獲取一個葉片早衰突變體，通過對其進行表型考查、生理生化分析、組織學及細胞學分析、基因精細定位以及表達分析等，以期進一步解析的功能，為今后建立水稻葉片衰老的調(diào)控網(wǎng)絡提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變龍粳31，從其突變體庫中篩選出一個葉片早衰突變體，通過多代自交發(fā)現(xiàn)其早衰表型可穩(wěn)定遺傳，將其命名為（）。將與秈稻品種浙輻802雜交，利用F1與F2群體進行遺傳分析與基因定位。2016–2020年，將材料種植于浙江省金華市浙江師范大學試驗田、中國水稻研究所杭州試驗基地以及海南陵水試驗基地，常規(guī)水肥管理。

1.2 農(nóng)藝性狀的觀察統(tǒng)計

在水稻成熟期選取野生型和各10株，對株高、分蘗、結實率、粒長、粒寬、粒厚、千粒重等農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，并利用GraphPad Prism 6軟件及Excel進行統(tǒng)計分析。

1.3 葉綠素含量測定

取分蘗期長勢一致的野生型和葉片，去除葉脈，分別稱取野生型和倒一、倒二、倒三葉0.3 g，每組3份樣品。置于10 mL離心管中，并加入5 mL 95%乙醇，4℃下避光處理24 h，期間輕微上下顛倒數(shù)次，使光合色素充分浸提在溶液中。取上清，分別測定其在波長為665 nm、649 nm和470 nm處的吸光值，然后參照Lichtenthaler[42]的方法計算葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素的含量。

1.4 水稻葉片電鏡觀察

1.4.1 水稻葉片掃描電鏡觀察

取分蘗期野生型和倒2葉葉片，去除葉脈，剪成0.5 cm的小段，立即置于裝有2.5%戊二醛固定液的2 mL離心管中，抽真空1～2 h使樣品沉于管底，4℃下保存過夜。二次固定、脫水、臨界點干燥、鍍膜及電鏡觀察交由浙江大學電鏡中心完成。

1.4.2 水稻葉片透射電鏡觀察

取樣及固定方法同1.4.1，4℃下過夜固定后，委托浙江大學電鏡中心完成漂洗、脫水、包埋、切片、染色及電鏡觀察等工作。

1.5 組織化學分析

1.5.1 H2O2積累檢測

使用二氨基聯(lián)苯（Diamino benzidine, DAB）可以直接觀察水稻葉片組織中H2O2積累。參考游均等[43]進行DAB染色，取分蘗期野生型和倒2葉葉片完全浸泡在0.5 mg/mL DAB染液中，抽真空15～30 min，室溫孵育過夜。倒掉染液，用清水沖洗干凈，將葉片移入含有95%乙醇的管中，沸水浴煮至完全脫色后拍照。

1.5.2 氧自由基含量檢測

使用氮藍四唑（nitrotetrazolium blue chloride, NBT）染液可以直接反映水稻葉片中細胞內(nèi)的氧自由基含量。參考游均等[43]進行NBT染色，取分蘗期野生型和倒2葉葉片完全浸泡在1 mg/mL NBT染液中，抽真空15～30 min，室溫孵育過夜。倒掉染液，用清水沖洗干凈，將葉片移入含有95%乙醇的管中，沸水浴煮至完全脫色后拍照。

1.5.3 細胞凋亡檢測

取分蘗期的野生型和相同部位的葉片，放入裝有2 mL FAA固定液的離心管中[44]。抽真空至樣本沉淀，然后按照Promega公司的TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）細胞凋亡檢測試劑盒對樣品進行檢測。

1.6 生理指標測定

取分蘗期野生型和倒2葉葉片，采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒，測定過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，以及過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的含量等與衰老相關的生理指標，每個樣品3次重復。

1.7 遺傳分析與基因定位

將與秈稻品種浙輻802進行正反交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，觀察F1和F2表型，并統(tǒng)計F2代正常表型與早衰表型分離比，進行遺傳分析。采用TPS法提取水稻葉片DNA。利用本實驗室已有的平均分布于12條染色體上的268對SSR標記引物，對親本以及F1進行多態(tài)性分析。選取多態(tài)性較好的分子標記，利用F2群體中與突變體表型一致的植株的DNA，對目的基因進行連鎖分析。將目的基因初步定位到染色體的某一個區(qū)域內(nèi)，并繼續(xù)設計新的分子標記，用于精細定位。通過對已公布的日本晴序列與秈稻9311序列的差異比對，利用Primer 3網(wǎng)站(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線設計引物，進一步對目的基因進行基因定位。相關引物序列見表1。

1.8 候選基因分析及測序

精細定位將目的基因縮小在一個小區(qū)間內(nèi)，根據(jù)水稻基因注釋網(wǎng)站RGAP（Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/），分析該區(qū)段內(nèi)所有的開放閱讀（ORF, open reading frame），找到候選基因，設計測序引物對野生型和的候選基因序列進行測序，利用SeqMan軟件進行序列比，找到突變位點，構建遺傳圖譜。

1.9 亞細胞定位

為了檢測蛋白表達的位置，我們利用-F和-R引物對擴增的基因的CDS為模板，進一步運用帶有相關接頭的引物擴增目的片段，通過In-fusion酶連接Ⅰ和Ⅰ線性化的載體，獲得載體。通過農(nóng)桿菌（EHA105）介導煙草的瞬時轉化，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白。引物序列參見表1。

1.10 外源激素處理

將野生型與突變體成熟的種子去殼后，用70%的酒精消毒2 min，再用30%的次氯酸鈉溶液消毒30 min，然后用蒸餾水沖洗干凈，分別接種于含有0、0.2 μmol/L和0.25 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上，放在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計根長和株高并拍照。培養(yǎng)箱光周期為光照14 h/黑暗10 h，溫度為30℃，相對濕度為70%。

1.11 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

利用AXYGEN試劑盒提取水稻植株總RNA，使用TOYOBO試劑盒逆轉錄為cDNA。采用qRT-PCR檢測野生型與突變體中葉綠體相關基因與ABA代謝相關基因的表達水平，以水稻為內(nèi)參基因。反應體系包括1 μL cDNA模板，5 μL 2×SYBR混合液，上下游引物各1 μL，ddH2O補至10 μL。反應程序為：95℃下30 s，95℃下5 s，55℃下10 s，72℃下5 s，40個循環(huán)。每個反應3次重復，以2計算基因相對表達水平。運用GraphPad Prism 6軟件和Excel 2010軟件分析數(shù)據(jù)，通過測驗進行差異顯著性分析。qRT-PCR所用引物見表1。

2 結果與分析

2.1 早衰突變體lps1的表型鑒定及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

無論是在浙江金華、杭州還是在海南種植，早衰表型都非常穩(wěn)定。自然生長條件下，3葉期時，野生型與的株高無顯著差異（圖1-A），但開始出現(xiàn)葉片發(fā)黃表型（圖1-B）。隨著植株的生長發(fā)育，葉片發(fā)黃的面積逐漸變大，葉尖開始枯死，但基部持綠。分蘗期，的株高變矮，這種表型一直持續(xù)到成熟期（圖1-C、D）。

此外，在成熟期的株高、有效分蘗、結實率、千粒重等均極顯著降低（圖1-F～I）；在粒型方面，的粒長和粒厚也顯著低于野生型（圖1-E、J～L），這也是導致其千粒重顯著下降的重要原因。

表1 本研究所用引物及序列

2.2 lps1的葉綠素含量及相關基因表達分析

葉綠素在光合作用中起著核心作用。為了探究的葉黃表型是否與葉綠素水平相關，我們測定了分蘗期在未出現(xiàn)黃葉表型的倒1葉（L1），剛出現(xiàn)黃葉表型的倒2葉（L2）和明顯出現(xiàn)黃葉表型的倒3葉（L3）葉綠素含量（圖2-A）。結果發(fā)現(xiàn)，除類胡蘿卜素的含量明顯增加外，的葉綠素a和葉綠素b含量均極顯著降低，并隨著葉片的衰老下降。而野生型中葉綠素含量無明顯變化（圖2-B～D）?？偟膩碇v，的葉綠素含量顯著降低。

A?3葉期植株表型(標尺=3 cm)；B?3葉期葉片表型(標尺=1 cm)；C?分蘗期表型(標尺=6 cm)；D?成熟期表型(標尺=8 cm)；E?籽粒表型(標尺=10 cm); F～I?野生型與lps1的農(nóng)藝性狀(株高、分蘗、結實率、千粒重)；J～L, 粒厚、粒長和粒寬。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.1.Phenotype and agronomic traits of the wild type and.

為了進一步探索中葉綠素水平降低的原因，我們對分蘗期野生型和倒2葉葉綠素代謝相關基因的表達進行了檢測。發(fā)現(xiàn)中與葉綠素合成相關的基因的表達水平均極顯著下調(diào)，而與葉綠素降解相關的基因僅的表達水平顯著下調(diào)，的表達沒有顯著差異（圖2-E）。說明基因突變可以影響水稻葉片中葉綠素的合成與降解，進而誘導葉片發(fā)生衰老。

A?分蘗期野生型與lps1不同部位葉表型，標尺為2 cm；B～D?野生型與lps1葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量測定；E?葉綠素合成與代謝相關基因表達水平。L1―倒1葉；L2―倒2葉；L3―倒3葉。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著

Fig.2.Chlorophyll contents and related gene expression analysis at the tillering stage.

2.3 水稻早衰突變體lps1的電鏡分析

為了觀察葉片表面的微觀特征，我們對野生型和分蘗期的葉片進行了掃描電鏡觀察。結果發(fā)現(xiàn)，由于缺少針狀突起，葉表面較野生型光滑；的硅質(zhì)化突起排列雜亂，且氣孔周圍的硅質(zhì)化突起顯著減少，氣孔孔徑也明顯大于野生型（圖3）。

圖3 水稻野生型（A～C）和早衰突變體lps1（D～F）葉片下表皮的掃描電鏡（SEM）觀察

Fig.3.Scanning electron microscope (SEM) observations of the epidermis of the wild type (A?C) and(D?F).

為了進一步探討衰老期間中葉綠素水平降低的原因，我們通過透射電鏡（TEM），比較了分蘗期和野生型中相同部位葉片的葉綠體超微結構，發(fā)現(xiàn)的葉綠體數(shù)目明顯減少，同時葉綠體中的嗜鋨顆粒數(shù)明顯增多變大，且淀粉顆粒明顯增多，葉綠體內(nèi)部的片層結構紊亂。這些特征表明，突變可能導致葉綠體發(fā)育不良（圖4）。

N?細胞核; C?葉綠體; Thy?類囊體; S?淀粉顆粒; Og?嗜鋨顆粒。

Fig.4.Transmission electron microscopy (TEM) observation of the wild type (A-C) and(D-F) leaves.

2.4 lps1的衰老生理指標分析

活性氧與植物的衰老密切相關，其過多積累會直接殺死細胞。為了進一步探索過早衰老的原因，我對分蘗期相同部位的葉片進行了DAB和NBT染色，結果發(fā)現(xiàn)在葉片中確實有大量的棕色和藍色沉積物（圖5-A、B）。

A?DAB染色; 標尺為2 cm；B?NBT染色, 標尺為2 cm；C?衰老相關生理指標（過氧化氫、丙二醛、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性）的測定。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.5.Physiological and biochemical detection of the wild type and.

同時，我們也檢測了野生型與中與衰老相關的生理指標，結果表明，中H2O2和MDA含量顯著升高，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，活性氧清除酶CAT、POD、SOD的活性均顯著下降（圖5-C～H）。這些說明中確實有大量的活性氧積累，同時可能伴有蛋白質(zhì)的降解和細胞膜的損傷。

2.5 lps1中的細胞死亡信號分析

為了檢測和野生型葉片中的細胞凋亡情況，我們利用TUNEL檢測了分蘗期倒2葉中的細胞死亡水平。若植物體細胞出現(xiàn)衰老，基因組DNA會出現(xiàn)斷裂，通過染色可以將這些片段染成綠色。檢測結果顯示在野生型的葉片細胞中，極少數(shù)呈現(xiàn)陽性，少數(shù)呈現(xiàn)陽性的細胞較小信號較弱（圖6-A、B），而在中，TUNEL信號增強且隨機分布（圖6-C、D），這表明水稻突變誘發(fā)大規(guī)模的細胞死亡。

2.6 lps1的早衰表型受單隱性核基因控制

通過觀察和浙輻802正反交后得到的F1代植株，發(fā)現(xiàn)F1代植株的表型均與野生型一致。F1代植株自交后產(chǎn)生的F2代植株出現(xiàn)早衰表型，進一步的觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，正常表型與早衰表型的比例接近3∶1（表2）。經(jīng)卡方檢驗，證明確實受一對隱性單基因控制。

A-D，標尺為100 μm。藍色熒光代表正常細胞，綠色熒光代表凋亡細胞。

Fig.6.TUNEL treatment results of the wild type (A and B) and(C and D) leaves.

表2 F2代分離群體統(tǒng)計結果

2.7 LPS1編碼一個泛素結合酶

我們運用F2分離群體對基因進行初步定位，并將其定位到第5染色體長臂上的2個分子標記（B5-18與B5-19）之間（圖7-A）。通過開發(fā)新的多態(tài)性標記，我們最終將其限定在M4與M5之間的77.5 kb的區(qū)間內(nèi)（圖7-B），該區(qū)域包含15個ORF（圖7-C）。通過測序比對，發(fā)現(xiàn)基因的第1外顯子的566 bp處G突變成A，導致其編碼的氨基酸序列提前終止（圖7-D～F）。研究發(fā)現(xiàn)編碼一個泛素結合酶基因（），說明是已克隆的一個新的等位基因。

圖7 LPS1基因的圖位克隆

Fig.7.Map-based cloning ofgene.

2.8 LPS1蛋白的亞細胞定位

將構建好的-GFP載體與空載轉入農(nóng)桿菌中，侵染煙草。通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)LPS1在細胞質(zhì)和核中表現(xiàn)出較強的熒光信號。由此推測LPS1蛋白在細胞質(zhì)與細胞核中均有表達（圖8）。

圖8 LPS1蛋白的亞細胞定位

Fig.8.Subcellular localization ofprotein.

2.9 LPS1對外源激素的響應情況

葉衰老是一種基因控制的發(fā)育過程，可由各種激素和環(huán)境因子調(diào)節(jié)。為了探究突變后對外源激素的響應情況，我們將野生型和接種在含有不同濃度外源激素的1/2 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d 后分別統(tǒng)計株高和根長。結果發(fā)現(xiàn)，在0.2 μmol/L ABA處理下野生型的株高和根長為無ABA處理的52%和90%，而的株高和根長分別為無ABA處理的41%和160%；在0.25 μmol/L ABA處理下野生型的株高和根長為無ABA處理的47%和76%，而的株高和根長分別為無ABA處理的34%和93%；不同濃度的ABA處理極大地抑制了的株高，但是在0.2 μmol/L ABA處理下，的根長明顯伸長；隨著ABA處理濃度的升高，其根長又被顯著抑制（圖9）。

A?外源激素處理對野生型WT(左)和lps1(右)表型的影響，標尺為3 cm；B?激素處理后地上部分長度；C?激素處理后地下部分長度。*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.9.Effect of exogenous hormone treatment on the wild type andseedlings.

2.10 LPS1影響ABA的代謝

在ABA處理前，與野生型相比，中與ABA合成相關基因和的表達量顯著下調(diào)，與ABA降解相關基因和的表達水平顯著下調(diào)（圖10-A）；在ABA處理后，中與ABA合成相關基因的表達水平顯著上調(diào)，而的表達水平下調(diào)，同時與ABA降解相關基因顯著下調(diào)（圖10-B）。結果證實，在ABA處理前，中與ABA合成和代謝相關基因的表達受到抑制，而在ABA處理后，與ABA合成相關基因（）的表達水平被顯著上調(diào)，說明可以通過影響ABA的合成途徑響應外源ABA的處理。

A?處理前野生型（WT）和lps1中ABA相關基因表達水平；B?處理后野生型（WT）和lps1中ABA相關基因表達水平；*和**分別表示野生型與lps1在0.05和0.01水平上差異顯著。

Fig.10.ABA synthesis and degradation related gene expression levels.

3 討論

植物衰老是一個受基因調(diào)控的高度復雜和有序的過程，具有多層次、多途徑的特點，葉片衰老是水稻衰老的主要表現(xiàn)形式。在3葉期就出現(xiàn)黃葉表型，并且隨著植株的生長，其黃化的面積逐漸增大，葉尖出現(xiàn)枯死現(xiàn)象（圖1）。伴隨著葉色的改變，結構與生理生化方面亦發(fā)生諸多變化。電鏡結果顯示，的硅質(zhì)化突起與葉綠體的數(shù)量明顯減少，一般認為水稻表皮硅質(zhì)化特性具有屏障保護作用，并與葉片機動細胞的開閉有關，從而影響水稻的蒸騰作用[45]。早有研究表明，葉片表面硅質(zhì)化突起數(shù)目的減少不僅使植株變矮，而且還影響根系生長，導致結實率下降[46-48]。葉綠體是光合作用的主要器官，也是ROS產(chǎn)生的重要部位。葉綠體結構破壞，導致H2O2、O2?和MDA大量積累[49]。細胞內(nèi)大量的MDA可以破壞蛋白質(zhì)、脂類和葉綠素等的活性，使細胞喪失多種生理功能引起細胞過氧化，導致細胞死亡信號增強，加劇水稻葉片的衰老進程[50]。

本研究利用圖位克隆的手段將該基因定位到第5染色體上，并通過測序比對發(fā)現(xiàn)是的一個等位基因。但是由于其突變方式以及突變位點的差異，導致其編碼產(chǎn)物產(chǎn)生較大差異。同時，它們的衰老表型亦有所不同。在成熟期表現(xiàn)出葉尖枯死表型[51]，而從3葉期就表現(xiàn)出黃葉與葉尖枯死，并且一直持續(xù)到成熟期。Hu等[48]研究發(fā)現(xiàn)是miR399下游的一個關鍵的Pi饑餓信號成分，參與水稻多種Pi饑餓反應的調(diào)節(jié)。突變導致Pi的吸收和轉運異常，Pi在嫩葉中的過度積累，最終導致葉尖枯死。

ABA一直被認為是促進植物衰老的正向調(diào)節(jié)物質(zhì)[52]。本研究發(fā)現(xiàn)的早衰表型可能是由于突變，體內(nèi)ABA代謝信號異常所致。早有研究表明，ABA可以通過誘導H2O2的產(chǎn)生，引起植物葉片的衰老。對玉米、水稻的離體葉片進行ABA處理后，顯著引起離體葉片中H2O2和MDA含量升高，葉綠素含量下降，進而加速葉片衰老[40-41]。本研究通過不同濃度的ABA處理水稻幼苗，發(fā)現(xiàn)對ABA異常敏感，并且ABA處理后，中的表達水平顯著上調(diào)，說明突變可以促進ABA的合成。與此同時，研究表明中類胡蘿卜素含量極顯著升高，而類胡蘿卜素為ABA合成的前體物質(zhì)。因此我們推測，突變導致體內(nèi)類胡蘿卜素含量異常升高，促使內(nèi)源ABA合成增多，進而引發(fā)H2O2、MDA等一系列與衰老相關生理指標的升高和降低，最終導致過早衰老。

4 結論

本研究通過EMS誘變得到一份早衰突變體，發(fā)現(xiàn)從3葉期開始衰老，葉表面硅質(zhì)化突起及葉綠體數(shù)目減少、片層結構紊亂，最終導致植株結實率降低、產(chǎn)量減少。生理實驗表明，中葉綠素水平下降，ROS過量積累，細胞死亡加重。遺傳分析與圖位克隆發(fā)現(xiàn)，位于第5染色體，是泛素結合酶基因的新等位基因，其編碼的蛋白在細胞質(zhì)與細胞核中均有表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，可能參與ABA的代謝途徑，最終導致產(chǎn)生早衰表型。本研究為激素介導水稻葉片衰老提供了新思路，并進一步豐富了調(diào)控水稻葉片早衰的網(wǎng)絡機制。

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Cloning and Functional Analysis of Leaf Senescence Genein

CHU Xiaojie1, LU Tao1, YE Hanfei1, WANG Sheng1, LIN Han1, WU Xianmei2, HE Rui2, YAN Gang1,WANG Yuexing2, LI Sanfeng2, LU Mei1, HU Haitao1, *, YANG Yaolong2, *, RAO Yuchun1, *

(1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2China National Center for Rice Improvement / State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: ryc@zjnu.cn, yangxiao182@126.com, haitao-hu@zjnu.cn)

【Objective】As a good carrier, the premature aging mutant plays an important role in exploring the genetic mechanism and mechanism of action on premature aging, as well as improving grain yield and quality of rice.【Method】In this study, a prematuresenescence mutantwas obtained by EMS mutagenesis, and phenotypic observation, cytological and histochemical analysis, physiological and biochemical analysis, genetic analysis, gene localization and hormone treatment were performed on wild-type and mutants.【Result】The leaves ofbegan to turn yellow during the three-leaf stage, and the plant height, effective tiller number, seed-setting rate, and thousand-grain weight were extremely significantly reduced in the maturing stage.Electron microscopy observation found that the surface ofleaves was smooth, the numbers of silicified protrusions and chloroplasts decreased, and the lamella structure was disordered.Physiological and biochemical analysis showed that a large amount of reactive oxygen species accumulated in mutant, accompanied by protein degradation, cell membrane damage and large-scale cell death.Genetic analysis showed that the progeria phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene, which encodes an ubiquitin conjugating enzyme on chromosome 5.The subcellular localization results prove that LPS1 protein is expressed in both the cytoplasm and the nucleus.Exogenous hormone treatment demonstrated that thewas more sensitive to exogenous hormone treatment, and themutation promoted the expression of genes related to ABA synthesis.【Conclusion】mutation makes the rice ABA synthesis signal pathway abnormal, which in turn triggers abnormal changes in a series of aging-related physiological indicators such as H2O2, leading to premature senescence of, and ultimately resulting in a serious decrease in rice yield.

rice; premature senescence; genetic analysis; subcellular localization; hormone

10.16819/j.1001-7216.2021.210303

2021-03-04；

2021-04-12。

國家科技重大專項(2016ZX08009003-003-008)；國家自然科學基金資助項目(31971921)；廣西水稻遺傳育種重點實驗室開放基金資助項目；中國水稻生物學國家重點實驗室開放項目(20200102)。