戊唑醇（Tebuconazole）是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，具有活性高、防治效果好、性價(jià)比高等優(yōu)勢(shì)。戊唑醇的大量使用和丟棄使其通過多種途徑進(jìn)入水體，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大危害，并可通過食物鏈在魚類等水生生物體內(nèi)富集并最終進(jìn)入人體，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[1-2]。戊唑醇主要在肝臟中代謝，分子中特丁基結(jié)構(gòu)的一個(gè)甲基可被氧化后羥化，隨后與葡萄糖醛酸或硫酸發(fā)生結(jié)合反應(yīng)[3]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，氧化產(chǎn)物可進(jìn)一步代謝為三元醇或酮類衍生物。然而，當(dāng)各個(gè)臟器和解毒酶系統(tǒng)未發(fā)育完全前，尤其是對(duì)于體外胚胎發(fā)育的動(dòng)物，戊唑醇對(duì)其胚胎發(fā)育的影響尚不清楚。

本文探究了戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的潛在影響。使用不同濃度的戊唑醇（10，20，40 mg/L）處理處于囊胚末期的熱帶爪蟾胚胎，持續(xù)至裂縫胚孔期結(jié)束。統(tǒng)計(jì)胚胎的死亡率、畸形率；檢測(cè)胚胎中NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達(dá)情況及DNA損傷效應(yīng)。當(dāng)戊唑醇濃度為20 mg/L時(shí)，胚胎出現(xiàn)大量畸形；當(dāng)戊唑醇濃度達(dá)到40 mg/L時(shí)，胚胎的存活率顯著下降；戊唑醇對(duì)DNA存在一定的損傷作用；體內(nèi)NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達(dá)水平隨著戊唑醇濃度的增加而下降。戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎有顯著毒性作用，干擾原腸運(yùn)動(dòng)，影響器官發(fā)育，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育畸形甚至死亡。

熱帶爪蟾?jìng)€(gè)體小、生長(zhǎng)周期短、胚胎發(fā)育模式與人類相似，且基因組簡(jiǎn)單，爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)（FETAX）是檢測(cè)污染物發(fā)育毒性的常用檢測(cè)方法[4-5]。本文通過戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響研究，進(jìn)一步確定戊唑醇的毒性作用，以探究環(huán)境中戊唑醇對(duì)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的潛在影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑

人絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)于寧波第二激素廠，半胱氨酸和戊唑醇購(gòu)于生工生物公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)熱帶爪蟾由溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)院羊棲菜研究所實(shí)驗(yàn)室培育。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1胚胎獲取

選取本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的多對(duì)雌雄熱帶爪蟾，采用人工注射HCG的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)卵，使用2%半胱氨酸溶液去除卵外膠質(zhì)膜，待發(fā)育到囊胚末期、原腸胚前期對(duì)正常胚胎進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。

1.2.2胚胎暴露實(shí)驗(yàn)

使用熱帶爪蟾培養(yǎng)液將戊唑醇稀釋成0、10、20、40 mg/L等4個(gè)濃度，為了避免受精過程的不確定性帶來的誤差，在囊胚期于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎，并從囊胚期開始處理至原腸期結(jié)束。向培養(yǎng)皿中加入50 mL戊唑醇溶液，于恒溫培養(yǎng)箱（26±0.5）℃黑暗培養(yǎng)12 h，之后每24 h更換培養(yǎng)液。

1.2.3顯微觀察

每間隔6 h記錄各濃度組胚胎死亡、畸形、孵化情況，于體視顯微鏡下觀察胚胎并拍照記錄。

1.2.4Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

根據(jù)NCBI和Xenbase數(shù)據(jù)庫(kù)獲取編碼熱帶爪蟾Nrf2、SOD、CAT、NQO1和β-actin的完整序列，并設(shè)計(jì)引物（見表1）。選取試驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)育的胚胎，通過Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.5 DNA損傷效應(yīng)檢測(cè)

連續(xù)培養(yǎng)96 h后，每組隨機(jī)挑選10只熱帶爪蟾胚胎，提取胚胎總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶的拖尾情況，比較不同濃度戊唑醇對(duì)胚胎DNA的損傷效應(yīng)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，結(jié)果以平均值±SD表示。

2結(jié)果與分析

2.1熱帶爪蟾胚胎形態(tài)變化

在胚胎發(fā)育至Stage 9-10時(shí)，使用戊唑醇染毒處理后，爪蟾胚胎后期的發(fā)育受到不同程度的影響。如圖1所示，與對(duì)照組相比，染毒6 h，胚胎表現(xiàn)為原腸運(yùn)動(dòng)受干擾，細(xì)胞遷移和胚孔閉合無法正常進(jìn)行，嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡；染毒后24 h，部分胚胎出現(xiàn)尾部上彎、短尾等畸形變性，更嚴(yán)重的導(dǎo)致胚胎異常及死亡；染毒后72 h，胚胎出現(xiàn)小眼、腸道水腫、尾巴彎曲、嘴巴突出和卵黃囊外漏等異常表型；染毒后96 h，已有大量胚胎死亡，存活胚胎多表現(xiàn)不同程度的異常，例如體色深、小眼癥狀及尾部下彎、嘴巴水腫等。

2.2戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率的影響

不同濃度戊唑醇處理后胚胎發(fā)育死亡率和畸形率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2所示，隨著戊唑醇濃度的升高，胚胎死亡率呈上升趨勢(shì)，且當(dāng)濃度為20 mg/L時(shí)有極顯著差異（P<0.01）。胚胎畸形率隨戊唑醇濃度增加呈上升趨勢(shì)，但沒有呈明顯正相關(guān)，且當(dāng)濃度為40 mg/L時(shí)具有極顯著差異（P<0.01）。在染毒后96 h，胚胎存活率隨戊唑醇濃度增加而逐漸下降，當(dāng)濃度為20 mg/L時(shí)有極顯著差異（P<0.01），當(dāng)濃度為40 mg/L存在顯著差異（P<0.05）。綜上，戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率有顯著影響，導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)不同程度的畸形甚至導(dǎo)致死亡。戊唑醇毒性存在累積效應(yīng)，胚胎存活率隨時(shí)間推移逐漸降低直至全部死亡。

2.3戊唑醇誘導(dǎo)熱帶爪蟾細(xì)胞氧化損傷

為了進(jìn)一步探索戊唑醇對(duì)胚胎發(fā)育致畸作用的分子機(jī)制，在戊唑醇處理6 h后，檢測(cè)了NRF2、SOD、CAT及NQO1幾種編碼與機(jī)體氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)的II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3及圖4所示，當(dāng)胚胎處于Stage 13時(shí)，其體內(nèi)Nrf2、SOD和CAT表達(dá)量相對(duì)較低，在經(jīng)過戊唑醇處理后，NRF2和CAT的表達(dá)受到進(jìn)一步抑制。與之對(duì)應(yīng)，NQO1的表達(dá)量在對(duì)照組中較高，經(jīng)戊唑醇處理后，表達(dá)水平隨濃度增加顯著降低（P<0.01）。綜上所述，熱帶爪蟾胚胎中抗氧化系統(tǒng)在胚胎發(fā)育早期尚未完善，且戊唑醇能顯著抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞的氧化損傷。

2.4戊唑醇誘導(dǎo)熱帶爪蟾胚胎染色體DNA損傷

在戊唑醇處理后96 h，提取熱帶爪蟾胚胎的基因組DNA，并檢測(cè)戊唑醇對(duì)胚胎DNA造成的損傷。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，10、20 mg/L實(shí)驗(yàn)組DNA條帶出現(xiàn)明顯拖尾，說明戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎DNA產(chǎn)生較大損傷。

3討論與結(jié)論

在戊唑醇對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，戊唑醇比較穩(wěn)定，但過量則易殘留在土壤和水中，對(duì)魚類等水生生物造成危害[6- 7]。不同濃度戊唑醇處理均會(huì)對(duì)熱帶爪蟾胚胎產(chǎn)生影響，10 mg/L戊唑醇就開始對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生顯著影響；20 mg/L戊唑醇會(huì)造成胚胎出現(xiàn)不同程度的畸形，例如脊柱彎曲、尾部彎曲、腸道水腫、小眼和體色異常等。其潛在機(jī)制可能與戊唑醇抑制了胚胎細(xì)胞中Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)有關(guān)。Nrf2是抗氧化系統(tǒng)主要的調(diào)控因子，而醌氧化還原酶（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶對(duì)活性氧清除具有重要作用[8]。當(dāng)胚胎受到外界強(qiáng)烈刺激時(shí)，Nrf2、NQO1、CAT、SOD等基因的表達(dá)被顯著抑制從而誘導(dǎo)胚胎氧化損傷。通過該實(shí)驗(yàn)，既探究了戊唑醇對(duì)熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響，同時(shí)也為戊唑醇對(duì)人類及脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的影響提供借鑒。值得注意的是，低濃度戊唑醇即會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生較大影響，因此需合理預(yù)估其安全使用濃度。

參考文獻(xiàn)

[1]龔會(huì)琴，楊鴻波，鷹申，等.戊唑醇對(duì)2種水生生物的毒性試驗(yàn)研究[J].貴州科學(xué)，2014，32（2）：74-77.

[2]王曉琳，劉玉霞，高素霞，等.金銀花中戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑的殘留分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（19）：143.

[3]MANN R M，HYNE R V，CHOUNG C B， et al. Am‐phibians and agricultural chemicals： review of the risks in a complex environment [J]. Environmental pollution，2009，157（11）：2 903.

[4]HI H，QIAN L，GUO S， et al. Teratogenic effects of tetrabromobisphenol [J]. Comparative biochemistry and physiology Toxicology & pharmacology ： CBP， 2010， 152（1）： 62.

[5]來松濤，魏于全，鄧洪新，等.模式生物——爪蟾在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2006，16（9）：1 074.

[6]陳迎麗，段亞玲.戊唑醇對(duì)斑馬魚的急性毒性與安全評(píng)價(jià)[J].貴州科學(xué)，2013，32（6）：72.

[7]錢麗娟，劉青坡，郭素珍，等.爪蟾胚胎致畸實(shí)驗(yàn)（FE‐TAX）在檢測(cè)污染物發(fā)育毒性中的應(yīng)用[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，9（4）：24.

[8]胡流芳. Keap1_Nrf2_ARE信號(hào)通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機(jī)制[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016，43（1）：146.

（溫州大學(xué)徐曼，朱振濤）