張稚蘭 邢炳鵬

摘要：為探討小球藻鑒定的新方法以及評(píng)估小球藻屬D NA條形碼候選序列的鑒定作用，文章對(duì)2 0株小球藻的線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（ C O I）、核基因組r D NA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ I T S）以及核酮糖1， 5 -二磷酸羧化酶（ r b c L） 3個(gè)片段進(jìn)行P C R擴(kuò)增測(cè)序，并對(duì)各序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果表明： C O I、I T S和r b c L序列在2 0株小球藻中的擴(kuò)增和測(cè)序效率均呈陽(yáng)性，擴(kuò)增成功率分別為7 6%、8 3%和7 0%；經(jīng)評(píng)估， C O I、I T S和r b c L序列作為D NA條形碼在小球藻分類鑒定中均不適合較低的分類單位，但可參考動(dòng)植物的分類方法，將多個(gè)片段組合應(yīng)用，從而篩選不同進(jìn)化級(jí)別的D NA條形碼。

關(guān)鍵詞：小球藻； D NA條形碼；分類鑒定；物種；基因

中圖分類號(hào)： Q 9 4 9.2 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1 0 0 5-9 8 5 7（ 2 0 2 1） 0 2-0 0 6 9-0 8

基金項(xiàng)目：自然資源部第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（海三科2 0 1 5 0 1 2、海三科2 0 1 9 0 1 5）.

A s s e s s m e n t o fC a n d i d a t eD N AS e q u e n c e s f o rB a r c o d i n go f t h eG e n u sC h l o r e l l a

Z HAN GZ h i l a n1， X I N GB i n g p e n g1， 2

（ 1 .T h i r dI n s t i t u t eo fO c e a n o g r a p h y，MN R， X i a m e n3 6 1 0 0 5， C h i n a； 2 .O b s e r v a t i o na n dR e s e a r c hS t a t i o no fC o a s t a lW e t l a n dE c o s y s t e mi nB e i b uG u l f，MN R， B e i h a i 5 3 6 0 1 5， C h i n a）

A b s t r a c t：T o e v a l u a t et h e v a l i d a t i o n o f D NA b a r c o d i n g c a n d i d a t e s e q u e n c ei ni d e n t i f y i n g C h l o r e l l a， t od i s c u s s t h en e ww a y so f i d e n t i f y i n g， t h i sp a p e r t o o k2 0 i n d i v i d u a l s s a m p l e d f o r a n a l y -s i s， 3s e q u e n c e sc y t o c h r o m ec o x i d a s eⅠ（ C O I） ， i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r（ I T S）a n dr i b u l o s e - 1， 5 - b i s p h o s p h a t eo f c a r b o x y l a s e（ r b c L）w e r ea m p l i f i e da n ds e q u e n c e d . T h e s es e q u e n c e sw e r ea n a -l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s . T h er e s u l ts h o w e db o t ha m p l i f y i n ga n ds e q u e n c i n ge f f e c t so f C O I， I T Sa n dr b c Lt o w a r d st h es a m p l eo fc h l o r e l l aw e r ep o s i t i v e， t h ea m p l i f i c a t i o ns u c c e s sr a t e w a s7 6%， 8 3%a n d7 0%， t h e s e 3s e q u e n c e sw e r en o t s u i t a b l e f o r l o w e r t a x a l e v e l .I n t h e f u t u r e t h e c o m b i n a t i o no fm a n ys e g m e n t s c o u l db e c o n s i d e r e da n d t e s t e d， t op i c ko u t t h ed i f f e r e n t e v o l u t i o n -a r y l e v e l so fD NAb a r c o d i n g .

K e y w o r d s： C h l o r e l l a， D NAb a r c o d i n g， I d e n t i f i c a t i o n， S p e c i e s， G e n e

0 引言

小球藻（ C h l o r e l l a）是球形單細(xì)胞真核微藻，隸屬綠藻門（ C h l o r o p h y t a） ，是地球上最早出現(xiàn)的生命之一。目前已發(fā)現(xiàn)的小球藻有十?dāng)?shù)種，變種達(dá)數(shù)百種，生態(tài)分布廣泛。小球藻生長(zhǎng)速度快且光合效率高，既可以光能自養(yǎng)，又可以使用有機(jī)碳源異養(yǎng)生長(zhǎng)和繁殖，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其油脂還可轉(zhuǎn)化為生物柴油，在醫(yī)藥、化工、食品和生物能源等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[ 1-3]。

關(guān)于小球藻的分類，已有的方法側(cè)重于形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、生理生化特征、超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞壁成分等指標(biāo)[ 4-5]，這些指標(biāo)均是小球藻鑒定的重要依據(jù)，但易受環(huán)境影響。小球藻體積小、變種多且形態(tài)特征簡(jiǎn)單，分屬于共球藻綱（ T r e b o u x i o p h y c e a e）和綠藻綱（ C h l o r o p h y c e a e）[ 4]，類群之間的分類特征交叉重疊且界限模糊不清，大大增加小球藻鑒定的難度，甚至可能導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。根據(jù)對(duì)小球藻屬基因組成的研究，其屬內(nèi)成員G C含量值的分布范圍很廣，幾乎涵蓋整個(gè)真核生物的G C圖譜，表明目前對(duì)小球藻的分類并不能代表自然界的真實(shí)情況[ 4]，因此準(zhǔn)確對(duì)小球藻進(jìn)行分類鑒定目前仍是難題。

D NA條形碼技術(shù)直接利用生物的D NA信息作為分類鑒定的方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為小球藻的鑒定拓寬道路。D NA條形碼的概念于2 0 0 3年被首次提出[ 6]，此后相關(guān)研究快速發(fā)展，并成為生物分類的研究熱點(diǎn)。D NA條形碼是利用1段標(biāo)準(zhǔn)的短序列進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)[ 6]，不受個(gè)體形態(tài)和生長(zhǎng)階段的影響，具有操作簡(jiǎn)單、鑒定周期短、可重復(fù)性強(qiáng)以及可高效和準(zhǔn)確地鑒定單個(gè)物種、辨別相近物種和發(fā)現(xiàn)隱形種等優(yōu)點(diǎn)。目前在藻類分子分類研究中，學(xué)者已陸續(xù)將1 0余種基因序列作為藻類的候選D NA條形碼并在不同類群中應(yīng)用，但尚未取得統(tǒng)一的藻類條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段[ 7-1 2]，研究的基因主要包括C O I、I T S、U P A（ 2 3 S）、r b c L、L S U（ 2 8 S r D NA）、S S U（ 1 8 Sr D NA）、t u f A（ e l o n g a t i o nf a c t o r T ug e n e）。其中， C O I和I T S由于具有較高的進(jìn)化速率，常被用于近緣群體或物種的鑒定[ 1 3]； R u b i s c o酶在光合作用和光呼吸過程中發(fā)揮重要作用[ 1 4]，其大亞基基因r b c L在物種之間的保守性強(qiáng)，因此成為分子系統(tǒng)學(xué)研究中被廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)片段之一[ 1 5]。

本研究嘗試將C O I、I T S和r b c L基因作為小球藻D NA條形碼的候選序列，評(píng)估3條D NA條形碼候選序列在小球藻屬中的鑒定能力，以期為深入研究小球藻條形碼和選擇標(biāo)準(zhǔn)條形碼提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1 . 1 材料

本研究選取的所有藻種均購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，共有2 0株小球藻樣品。培養(yǎng)基為B G - 1 1，培養(yǎng)溫度為2 5℃，光照照度為45 0 0l x，光暗比為1 2h∶1 2h。小球藻株系來(lái)源如表1所示。

1 . 2 樣品D N A提取以及P C R擴(kuò)增和測(cè)序

離心采集對(duì)數(shù)期藻液，使用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組D NA提取試劑盒，提取基因組總D NA。P C R反應(yīng)的總體積為2 5mm3，其中包括2×T a qP l u sP C R M i x1 2 . 5 mm3、引物（ 0 . 0 1mm o l /d m3）各1mm3、D NA模板2mm3以及超純水8 . 5mm3。P C R擴(kuò)增的引物序列如表2所示。

C O I基因P C R循環(huán)參數(shù)設(shè)定為9 5℃， 3m i n； 3 0個(gè)循環(huán)包括： 9 5℃、0 . 5m i n， 5 0℃、1m i n， 7 4℃、1 . 5m i n， 7 4℃、7m i n。I T S基因P C R循環(huán)參數(shù)設(shè)定為9 4℃， 5 m i n； 3 0個(gè)循環(huán)包括： 9 4℃、1 m i n， 5 0℃、1m i n， 7 2℃、1 . 5 m i n， 7 2℃、8 m i n。r b c L基因P C R循環(huán)參數(shù)設(shè)定為9 4℃， 5m i n； 3 0個(gè)循環(huán)包括： 9 4℃、1 m i n， 5 3℃、1 m i n， 7 2℃、1 m i n， 7 2℃、1 0m i n。P C R產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

利用S e q u e n c h e r軟件拼接樣品的雙向測(cè)序結(jié)果，經(jīng)人工校對(duì)確定無(wú)誤后提交至G e n B a n k數(shù)據(jù)庫(kù)。利用C l u s t a lX2 . 0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并查錯(cuò)。利用ME GA7 . 0軟件對(duì)D NA序列特征進(jìn)行分析，包括序列長(zhǎng)度、G C含量、多態(tài)位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等參數(shù)。采用最大似然法進(jìn)行序列飽和性檢驗(yàn)，使用D AMB E軟件建立堿基替換飽和曲線[ 1 6]。利用K i m u r a - 2 - p a r a m e t e r（ K 2 P）[ 1 7]模型計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離。將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)信息與G e n -B a n k中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建不同序列的小球藻系統(tǒng)發(fā)育樹。采用自舉檢驗(yàn)法檢驗(yàn)鄰接法分支樹的可信度，各分支經(jīng)10 0 0次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到支持率。以計(jì)算機(jī)P e r l語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)各序列種內(nèi)和種間遺傳距離的分布頻度，評(píng)估3條D NA條形碼候選序列的間隔（ b a r c o d i n gg a p）。

2 結(jié)果分析

2 . 1 C O I、I T S和r b c L的序列結(jié)構(gòu)特征

3條D NA條形碼候選序列在2 0株小球藻中的擴(kuò)增均呈陽(yáng)性，擴(kuò)增成功率分別為7 6%、8 3%和7 0%。各條候選D NA條形碼的序列特征如表3所示。

各序列長(zhǎng)度的范圍為6 7 1～14 2 8b p，其中I T S的變化范圍最大（ 6 7 1～7 3 8b p）。實(shí)驗(yàn)所得的I T S序列包含完整的I T S 1、5 . 8 Sr D NA和I T S 2， 2 0條I T S的序列長(zhǎng)度并不一致，其中5 . 8 Sr D NA最為保守（ 1 5 9b p） ，而I T S 1和I T S 2出現(xiàn)一定的變化。3條序列的G C含量也不同，其中I T S最高（ 5 5 . 4%） ， C O I最低（ 3 7 . 0%）。

3條D NA條形碼候選序列的遺傳差異是通過p距離和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占比（ P I %）計(jì)算的，其中C O I、I T S和r b c L的平均p距離分別是0 . 0 5 7、0 . 2 2 0和0 . 0 3 3，而其P I %值分別為1 5 . 4%、3 6 . 3%和7 . 6%。其中I T S的平均p距離和P I %值最高，表明I T S在3條D NA條形碼候選序列中的遺傳變異度最高。

2.2 堿基替換飽和性

C O I、I T S和r b c L的堿基替換飽和性曲線如圖1所示。

由圖1可以看出： C O I和r b c L的轉(zhuǎn)換值略高于顛換值，而I T S的顛換值高于轉(zhuǎn)換值； I T S轉(zhuǎn)換曲線已進(jìn)入平穩(wěn)期，表明小球藻的I T S序列的轉(zhuǎn)換已達(dá)到飽和；與之相比， C O I和r b c L的轉(zhuǎn)換曲線和顛換曲線均為線性關(guān)系，表明這2個(gè)序列之間的替換尚未達(dá)到飽和，更適合用于系統(tǒng)樹的構(gòu)建。

2 . 3 C O I、I T S和r b c L的b a r c o d i n gg a p

標(biāo)準(zhǔn)D NA條形碼的種間遺傳變異應(yīng)顯著大于種內(nèi)遺傳變異，并形成1個(gè)間隔區(qū)即b a r c o d i n g g a p[ 1 8-1 9]，因此種內(nèi)變異應(yīng)集中分布于b a r c o d i n g g a p圖中數(shù)值較小的一側(cè)，而數(shù)值較大的一側(cè)應(yīng)集中顯示種間變異[ 2 0]。小球藻的3條D NA條碼候選序列的b a r c o d i n gg a p如圖2所示。

由圖2可以看出， C O I、I T S和r b c L的種內(nèi)變異和種間變異存在不同程度的重疊。其中： C O I的種內(nèi)變異超過種間變異，因此不利于小球藻的分類鑒定；而I T S和r b c L的種內(nèi)變異和種間變異雖有一定的重疊，但仍存在間隔區(qū)，且相比之下r b c L的間隔區(qū)更大，因此有利于小球藻的分類鑒定。

2 . 4 C O I、I T S和r b c L的系統(tǒng)發(fā)育

在目前對(duì)3個(gè)候選序列分別進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析中，各分支內(nèi)的聚類情況都是無(wú)序的，與各自的形態(tài)學(xué)分類地位不符。在形態(tài)學(xué)分類上，同種的小球藻沒有被完全聚為同一類，而不同種的小球藻又沒有被分開，與傳統(tǒng)分類學(xué)存在較大差異。由于3個(gè)候選片段都不能完全區(qū)分所有的小球藻種類，可能其并不適合較低的分類單位。

基于C O I、I T S和r b c L的小球藻N J系統(tǒng)樹如圖3所示，其中▲標(biāo)記的為G e n B a n k中的數(shù)據(jù)。

3 討論

理想的D NA條形碼序列應(yīng)具有易于高效擴(kuò)增、種間差異顯著和種內(nèi)變異較小等特點(diǎn)[ 2 1]。根據(jù)對(duì)小球藻不同序列的分析結(jié)果， 3條候選D NA條形碼序列均不適合單獨(dú)完成對(duì)小球藻到種水平的鑒定，但其各具特點(diǎn)。H e b e r t等[ 2 2]對(duì)動(dòng)物界中除刺胞動(dòng)物門外的所有動(dòng)物門進(jìn)行C O I基因研究，發(fā)現(xiàn)C O I基因的長(zhǎng)度較短、易于擴(kuò)增且變異率適度，適合作為物種D NA條形碼。C O I基因是目前公認(rèn)的動(dòng)物D NA條形碼基因，其有效性在對(duì)軟體動(dòng)物、鳥類[ 2 3-2 6]和鱗翅目昆蟲[ 2 7]等的研究中得到驗(yàn)證。多名學(xué)者和國(guó)際機(jī)構(gòu)分別對(duì)陸生植物D NA條形碼進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)C O I基因不僅進(jìn)化速率低，而且基因含量和結(jié)構(gòu)改變很大，因此其作為植物D NA條形碼并不合適[ 2 1， 2 8-3 0]。在藻類D NA條形碼研究中， C O I基因在硅藻、甲藻、褐藻和紅藻研究中都得到成功應(yīng)用[ 8， 3 1-3 3]；但C O I基因在綠藻中不能設(shè)計(jì)出有效的引物，因此不適合作為綠藻的條形碼[ 3 4]。本研究的分析結(jié)果也表明C O I序列不適合作為小球藻D NA條形碼，其原因可能有2點(diǎn)：①缺乏數(shù)據(jù)，即G e n B a n k數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏本研究實(shí)驗(yàn)所采用藻種的C O I基因序列；②在形態(tài)分類時(shí)，由于樣本缺少明確的形態(tài)特征或形態(tài)指標(biāo)不適合作為種的分類標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致分類出現(xiàn)偏差[ 3 5]。

I T S序列是核糖體r R NA基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含I T S 1、5 . 8 Sr D NA和I T S 2，其中I T S 1和I T S 2的進(jìn)化速率較快，而5 . 8 Sr D NA最為保守。較高的變異度使I T S在區(qū)分物種方面的能力較強(qiáng)，其在一些原生生物[ 1 0]、真菌[ 1 1-1 2]、藻類[ 1 3， 3 6-3 7]、植物[ 3 8-3 9]和動(dòng)物[ 4 0]的分類鑒定中得到成功應(yīng)用，而本研究基于I T S基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹無(wú)法將所有種類的小球藻完全分開。M u l l e r等[ 4 1]對(duì)2 9株普通小球藻的I T S序列長(zhǎng)度和基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（ A F L P）進(jìn)行分析，提出有些已由傳統(tǒng)分類方法確定的普通小球藻并不屬于此分類； H u s s等[ 4]基于小球藻的生化和分子信息，認(rèn)為蛋白核小球藻和普通小球藻同種異名，因此在系統(tǒng)樹中表現(xiàn)為I T S長(zhǎng)度相同的普通小球藻和蛋白核小球藻被聚在同一個(gè)分枝中。而在依賴小球藻類1 8 Sr R NA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中， C h l o r e l as a c c h a r o p h i l a、C h l o r e l l a e l i p s o i d e a、C h l o r e l a l u t e o v i r i d i s和C h l o r e l am i r a b -i l i s各自以很高的自展值聚在一起[ 4]，與本研究實(shí)驗(yàn)根據(jù)I T S基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果類似，表明這些小球藻具有很近的親緣關(guān)系。在本研究實(shí)驗(yàn)中， I T S的遺傳距離（p距離）和P I %值均比C O I和r b c L高很多，表明其具有較高的變異度，而堿基替換飽和性分析也證明I T S具有很高的變異度，這可能導(dǎo)致I T S序列不適合單獨(dú)用于小球藻的系統(tǒng)發(fā)育分析。

r b c L基因全長(zhǎng)約1 . 4k b，能提供較多的分子信息，在光合作用和光呼吸中占據(jù)重要地位。受到功能的限制， r b c L的進(jìn)化速率較慢，因此更適合較高分類階元的研究[ 4 2-4 4]。本研究實(shí)驗(yàn)中r b c L基因的遺傳距離（p距離）和P I %值在3個(gè)條形碼候選片段中均最低，表明其較為保守。但r b c L的引物通用性強(qiáng)且序列易比對(duì)，可參考將其與多個(gè)片段組合，以提升物種鑒定的正確率[ 4 3-4 5]。F r i e d l[ 4 6]基于1 8 Sr D NA序列的分析以及H u s s等[ 4]對(duì)生物化學(xué)、生理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和1 8 Sr D NA的研究，均將小球藻類群劃分為2個(gè)不同的綱，即綠藻綱（ C h l o r o p h y c e a e）和共球藻綱（ T r e b o u x i o p h y c e a e） ，其中H u s s等[ 4]又將共球藻綱中的小球藻分為2個(gè)類群。本研究實(shí)驗(yàn)根據(jù)r b c L基因所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與H u s s等[ 4]的分類相似，即類群Ⅰ中的C h l o r e l av u l g a r i s和C h l o r e l l ap r o t o t h e c o i d e s聚在一起，而類群Ⅱ中的C h l o r e l l ae l i p s o i d e a和C h l o r e l l as a c c h r a r o p h i l a分布在外圍；但又與H u s s等[ 4]的分類略有差別，如屬于類群Ⅱ的1株C h l o r e l ae l l i p s o i d e a和C h l o -r e l l al u t e o r i v i d i s與類群Ⅰ聚在一起，而這與孫雪等[ 2]的研究結(jié)果類似。出現(xiàn)這種情況的原因可能為實(shí)驗(yàn)所采用的藻株不同、數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息錯(cuò)誤、樣品D NA污染和分類命名錯(cuò)誤等，導(dǎo)致分析結(jié)果的可信度降低或找不到可參考的數(shù)據(jù)[ 7]。

隨著時(shí)代的發(fā)展，小球藻屬的成員不斷變化，而目前對(duì)于藻類D NA條形碼的研究還不成熟，小球藻D NA條形碼尚沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)基因片段。但可參考動(dòng)植物的分類方法，將多個(gè)片段組合應(yīng)用，以篩選不同進(jìn)化級(jí)別的D NA條形碼[ 7]。隨著小球藻類不同D NA片段信息的不斷豐富、規(guī)范化和規(guī)模化以及D NA條形碼技術(shù)的不斷成熟， D NA條形碼將在小球藻分類鑒定中得到更廣泛的應(yīng)用。

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[ 4] HU S SVAR， F R A N KC，HA R TMA N NEC， e ta l . B i o c h e m i c a l t a x o n o m ya n d m o l e c u l a rp h y l o g e n y o ft h e g e n u sc h l o r e l a s e n s u l a t o（ c h l o r o p h y t a） [ J]. J o u r n a lo fP h y c o l o g y， 1 9 9 9， 3 5（ 3） ： 5 8 7-5 9 8.

[ 5] K R I E N I T ZL， HE G EWA L DEH， HE P P E R L ED， e t a l . P h y l o -g e n e t i cr e l a t i o n s h i p o fc h l o r e l l aa n d p a r a c h l o r e l ag e n . n o v .（ c h l o r o p h y t a， t r e b o u x i o p h y c e a e） [ J]. P h y c o l o g i a， 2 0 0 4， 4 3（ 5） ： 5 2 9-5 4 2.

[ 6] HE B E R TPD， R A T NA S I N GHAM S， D EWAA R DJR. B a r -c o d i n ga n i m a l l i f e： c y t o c h r o m eco x i d a s es u b u n i t1d i v e r g e n c e s a m o n gc l o s e l yr e l a t e ds p e c i e s[ J]. P r o cB i o l S c i， 2 0 0 3， 2 7 0（ S 1） ： 9 6-9 9.

[ 7] 崔翠菊，張立楠，王娜，等.藻類D NA條形碼研究進(jìn)展[ J].中國(guó)生物工程雜志， 2 0 1 2， 3 2（ 9） ： 1 1 3-1 1 7.

[ 8] S A UN D E R SGW. A p p l y i n gD NAb a r c o d i n g t o r e dm a c r o a l g a e： ap r e l i m i n a r ya p p r a i s a lh o l d sp r o m i s ef o rf u t u r ea p p l i c a t i o n s[ J]. P h i l o sT r a n sRS o cL o n dBB i o lS c i， 2 0 0 5， 3 6 0（ 1 4 6 2） ： 1 8 7 9-1 8 8 8.

[ 9] KU C E R AH， S AUN D E R SG W. A s s i g n i n gm o r p h o l o g i c a l v a r i -a n t so ff u c u s（ f u c a l e s，p h a e o p h y c e a e）i nC a n a d i a nw a t e r st o r e c o g n i z e ds p e c i e su s i n gD NAb a r c o d i n g[ J]. B o t a n y， 2 0 0 8， 8 6（ 9） ： 1 0 6 5-1 0 7 9.

[ 1 0] S T E R N R F，AN D E R S E N R A，J AME S ON I，e t a l . E v a l u a t i n gt h e r i b o s o m a l i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r（ I T S）a s ac a n d i d a t ed i n o f l a g e l a t eb a r c o d e m a r k e r[ J]. P L o S O n e， 2 0 1 2， 7（ 8） ： e 4 2 7 8 0.

[ 1 1] S E I F E R TKA. P r o g r e s s t o w a r d sD NAb a r c o d i n go f f u n g i[ J]. M o lE c o lR e s o u r， 2 0 0 9， 9（ S 1） ： 8 3-8 9.

[ 1 2] S C HO C HCL， S E I F E R TKA， HUHN D O R FS， e t a l . N u c l e a r r i b o s o m a l i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r（ I T S）r e g i o na sau n i -v e r s a lD NAb a r c o d em a r k e r f o rF u n g i[ J]. P r o c e e d i n g so f t h e N a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i -c a， 2 0 1 2， 1 0 9（ 1 6） ： 6 2 4 1-6 2 4 6.

[ 1 3] 郭立亮.海洋微藻D NA條形碼基因的評(píng)估及環(huán)境樣本多樣性分析和定量基因的開發(fā)[ D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)， 2 0 1 5.

[ 1 4] 孫雪，馬斌，周成旭.蛋白核小球藻核酮糖- 1， 5 -二磷酸羧化/加氧酶小亞基部分基因序列的克隆與分析[ J].海洋科學(xué)， 2 0 0 8（ 3） ： 4 0-4 3.

[ 1 5] HA S E B E M， I T O M， KO F U J IR， e ta l . P h y l o g e n e t i cr e l a t i o n -s h i p s i ng n e t o p h y t ad e d u c e df r o mr b c Lg e n es e q u e n c e s[ J]. T h eB o t a n i c a lM a g a z i n e， T o k y o， 1 9 9 2， 1 0 5（ 3） ： 3 8 5-3 9 1.

[ 1 6] X I AX. D a m b e7： n e wa n d i m p r o v e dt o o l s f o rd a t aa n a l y s i s i n m o l e c u l a rb i o l o g ya n de v o l u t i o n[ J]. M o lB i o lE v o l， 2 0 1 8， 3 5（ 6） ： 1 5 5 0-1 5 5 2.

[ 1 7] K I MUR A M. As i m p l em e t h o df o re s t i m a t i n ge v o l u t i o n a r y r a t e so f b a s e s u b s t i t u t i o n s t h r o u g hc o m p a r a t i v e s t u d i e s o f n u -c l e o t i d es e q u e n c e s[ J].JM o lE v o l， 1 9 8 0， 1 6（ 2） ： 1 1 1-1 2 0.

[ 1 8] L AHAY ER， VAND E RB ANK M， B O GA R I ND， e t a l . D NA b a r c o d i n gt h ef l o r a so fb i o d i v e r s i t yh o t s p o t s[ J]. P r o c e e d i n g s o f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so f Am e r i c a， 2 0 0 8， 1 0 5（ 8） ： 2 9 2 3-2 9 2 8.

[ 1 9] ME Y E RCP， P AU L AYG. D NAb a r c o d i n g： e r r o rr a t e sb a s e d o nc o m p r e h e n s i v es a m p l i n g[ J]. P L o SB i o l， 2 0 0 5， 3（ 1 2） ： e 4 2 2.

[ 2 0] 姜黎.基于D NA條形碼技術(shù)的重樓正偽品鑒定方法研究[ D].瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院， 2 0 1 3.

[ 2 1] C B O LP l a n tW o r k i n gG r o u p1， P E T E R M H， L AUR AL， e t a l . AD NAb a r c o d e f o r l a n dp l a n t s[ J]. P r o c e e d i n g so f t h eN a -t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i c a， 2 0 0 9， 1 0 6（ 3 1） ： 1 2 7 9 4-1 2 7 9 7.

[ 2 2] HE B E R TPD， C YW I N S KAA， B A L LSL， e ta l . B i o l o g i c a l i -d e n t i f i c a t i o n s t h r o u g hD NAb a r c o d e s[ J]. P r o cB i o lS c i， 2 0 0 3， 2 7 0（ 1 5 1 2） ： 3 1 3-3 2 1.

[ 2 3] J OHN S E NA， R I N D A LE， E R I C S ONPGP， e ta l . D NAb a r -c o d i n go fs c a n d i n a v i a n b i r d sr e v e a l sd i v e r g e n tl i n e a g e si n t r a n s - a t l a n t i cs p e c i e s[ J]. J o u r n a lo fO r n i t h o l o g y， 2 0 1 0， 1 5 1（ 3） ： 5 6 5-5 7 8.

[ 2 4] P A R K H， YOO HS， J UN GG， e ta l . N e wD NAb a r c o d e s f o r i d e n t i f i c a t i o no fK o r e a nb i r d s[ J]. G e n e s&G e n o m i c s， 2 0 1 1， 3 3（ 2） ： 9 1-9 5.

[ 2 5] L I J TMA E RDA， K E R RKC， S T O E C K L E M Y， e ta l . D NA b a r c o d i n gb i r d s： f r o m f i e l dc o l l e c t i o nt od a t aa n a l y s i s[ J]. M e t h o d sM o lB i o l， 2 0 1 2， 8 5 8： 1 2 7-1 5 2.

[ 2 6] A L I A B A D I AN M， B E E N T J E SK K， R O S E L AA RCS， e ta l . D NAb a r c o d i n go fD u t c h b i r d s[ J]. Z o o k e y s，2 0 1 3（ 3 6 5） ： 2 5-4 8.

[ 2 7] HE B E R TPD， P E N T ONEH， B UR N SJM， e t a l . T e ns p e c i e s i n o n e：D NA b a r c o d i n g r e v e a l s c r y p t i c s p e c i e s i n t h e n e o t r o p i c a ls k i p p e rb u t t e r f l y A s t r a p t e sf u l g e r a t o r[ J]. P r o -c e e d i n g so f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so ft h eU n i t e d S t a t e so fAm e r i c a， 2 0 0 4， 1 0 1（ 4 1） ： 1 4 8 1 2-1 4 8 1 7.

[ 2 8] V I J A Y A NK， T S O UCH. D N Ab a r c o d i n g i np l a n t s： t a x o n o m y i n an e wp e r s p e c t i v e[ J]. C u r r e n tS c i e n e， 2 0 1 0， 9 9（ 1 1） ： 1 5 3 0.

[ 2 9] 閆化學(xué)，于杰. D NA條形碼技術(shù)在植物中的研究現(xiàn)狀[ J].植物學(xué)報(bào)， 2 0 1 0， 4 5（ 1） ： 1 0 2-1 0 8.

[ 3 0] 唐建陽(yáng)，周先治.植物D NA條形碼研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[ J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2 0 0 9， 2 5（ 2 4） ： 3 5-4 3.

[ 3 1] E VAN SK M，MANNDG. Ap r o p o s e dp r o t o c o l f o rn o m e n -c l a t u r a l l ye f f e c t i v eD NAb a r c o d i n go fm i c r o a l g a e[ J]. P h y c o l o -g i a， 2 0 0 9， 4 8（ 1） ： 7 0-7 4.

[ 3 2] E VAN SK M，WO R T L E YA H，MANNDG. A na s s e s s m e n t o fp o t e n t i a l d i a t o m“b a r c o d e”g e n e s（ c o x 1， r b c L， 1 8 Sa n d I T S r D NA） a n dt h e i re f f e c t i v e n e s s i nd e t e r m i n i n gr e l a t i o n s h i p s i n s e l l a p h o r a（b a c i l l a r i o p h y t a）[ J]. P r o t i s t，2 0 0 7，1 5 8（3） ： 3 4 9-3 6 4.

[ 3 3] R O B B AL， RU S S E L LSJ， B A R K E RGL， e t a l . A s s e s s i n g t h e u s eo f t h em i t o c h o n d r i a l c o x 1m a r k e r f o ru s e i nD NAb a r c o d -i n go fr e da l g a e（ r h o d o p h y t a） [ J]. AmJB o t， 2 0 0 6， 9 3（ 8） ： 1 1 0 1-1 1 0 8.

[ 3 4] 郭盛華. D NA條形碼技術(shù)的概況及其在大型海藻中的應(yīng)用[ J].科技資訊， 2 0 1 2（ 1 8） ： 2 4 7.

[ 3 5] F UNK D J，OML AN D K E. S p e c i e s - l e v e lp a r a p h y l y a n d p o l y p h y l y： f r e q u e n c y， c a u s e s， a n dc o n s e q u e n c e s，w i t hi n s i g h t s f r o m a n i m a l m i t o c h o n d r i a l D NA[ J]. A n n u a l R e v i e w o f E c o l o g yE v o l u t i o na n dS y s t e m a t i c s， 2 0 0 3， 3 4： 3 9 7-4 2 3.

[ 3 6] MON I Z M B，KA C ZMA R S KA I . B a r c o d i n g o f d i a t o m s： n u c l e a re n c o d e dI T Sr e v i s i t e d[ J]. P r o t i s t，2 0 1 0，1 6 1（ 1） ： 7-3 4.

[ 3 7] MON I ZMB， KA C ZMA R S KAI . B a r c o d i n gd i a t o m s： i s t h e r e a g o o dm a r k e r？ [ J]. M o lE c o lR e s o u r， 2 0 0 9， 9（ S 1） ： 6 5-7 4.

[ 3 8] YAN GJB， GAOLM， L I UJQ， e t a l . C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f al a r g e d a t a s e ti n d i c a t e st h a ti n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e r（ I T S）s h o u l db e i n c o r p o r a t e di n t ot h ec o r eb a r c o d ef o rs e e d p l a n t s[ J]. P r o c e e d i n g so f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo fS c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i c a， 2 0 1 1， 1 0 8（ 4 9） ： 1 9 6 4 1-1 9 6 4 6.

[ 3 9] D UZ，Q I M I K E A，YAN G C， e ta l . T e s t i n gf o u rb a r c o d i n g m a r k e r sf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fP o t a m o g e t o n a c e a e[ J]. J o u r n a l o fS y s t e m a t i c sa n dE v o l u t i o n， 2 0 1 1， 4 9（ 3） ： 2 4 6-2 5 1.

[ 4 0] MO R I T ZG， P AU L S E N M，D E L K E R C， e ta l . I d e n t i f i c a t i o n o f t h r i p s u s i n g I T S - R F L Pa n a l y s i s[ J]. T h r i p s a n dT o s p o v i r u s -e s： P r o c e e d i n g so f t h e7 t hI n t e r n a t i o n a lS y m p o s i u mo nT h y s -a n o p t e r a， 2 0 0 2： 3 6 5-3 6 7.

[ 4 1] MU L L E RJ， F R I E D LT， HE P P E R L ED， e ta l . D i s t i n c t i o nb e -t w e e n m u l t i p l ei s o l a t e so fc h l o r e l av u l g a r i s（ c h l o r o p h y t a， t r e b o u x i o p h y c e a e）a n d t e s t i n g f o r c o n s p e c i f i c i t y u s i n g a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s ma n dI T Sr D NAs e -q u e n c e s[ J].J o u r n a l o fP h y c o l o g y， 2 0 0 5（ 4 1） ： 1 2 3 6-1 2 4 7.

[ 4 2] D AUG B J E R GN， AN D E R S E NRA. P h y l o g e n e t i ca n a l y s e so f t h er b c Ls e q u e n c e sf r o m h a p t o p h y t e sa n dh e t e r o k o n ta l g a e s u g g e s t t h e i rc h l o r o p l a s t sa r eu n r e l a t e d[ J]. M o lB i o lE v o l， 1 9 9 7， 1 4（ 1 2） ： 1 2 4 2-1 2 5 1.

[ 4 3] N EWMA S T E RSG， F A Z E KA SAJ， S T E E V E SR A， e ta l . T e s t i n gc a n d i d a t ep l a n tb a r c o d er e g i o n si nt h em y r i s t i c a c e a e[ J]. M o lE c o lR e s o u r， 2 0 0 8， 8（ 3） ： 4 8 0-4 9 0.

[ 4 4] S A S SC， L I T T L EDP， S T E V E N S ON D W， e ta l . D NAb a r -c o d i n g i nt h ec y c a d a l e s： t e s t i n gt h ep o t e n t i a l o fp r o p o s e db a r -c o d i n gm a r k e r sf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fc y c a d s[ J]. P L o S O n e， 2 0 0 7， 2（ 1 1） ： e 1 1 5 4.

[ 4 5] F A Z E KA SAJ， B UR G E S SKS， K E S ANAKUR T IPR， e t a l . M u l t i p l em u l t i l o c u sD NAb a r c o d e sf r o mt h ep l a s t i dg e n o m e d i s c r i m i n a t ep l a n t s p e c i e se q u a l l yw e l l[ J]. P L o SO n e， 2 0 0 8， 3（ 7） ： e 2 8 0 2.

[ 4 6] F R I E D L T. I n f e r r i n gt a x o n o m i cp o s i t i o n sa n dt e s t i n gg e n u s l e v e l a s s i g n m e n t s i nc o c c o i dg r e e n l i c h e na l g a e： ap h y l o g e n e t i c a n a l y s i so f1 8 Sr i b o s o m a lRNAs e q u e n c e sf r o m d i c t y o c h l o -r o p s i sr e t i c u l a t aa n df r o m m e m b e r so ft h eg e n u sm y r m e c i a（ c h l o r o p h y t a， t r e b o u x i o p h y c e a ec l . n o v . ） [ J]. J o u r n a lo fP h y -c o l o g y， 1 9 9 5， 3 1（ 4） ： 6 3 2-6 3 9.