王艷陽，邊明明，康媛媛，章紹兵，孟 珺

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

乳桿菌作為益生菌的一大類，可黏附定植于腸道細(xì)菌，均衡腸道內(nèi)微生物，影響免疫調(diào)節(jié)功能，減少病原菌在胃腸道的定殖[1?2]。乳桿菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附作用與菌體表面的疏水作用、靜電作用和菌體本身的聚集能力相關(guān)。這些都與乳桿菌的表面成分相關(guān)，其中表層蛋白起著至關(guān)重要的作用[3?6]。多數(shù)乳桿菌的外表都覆蓋著一層表層蛋白，可經(jīng)自組裝形成對(duì)稱次晶格陣列結(jié)構(gòu)，在乳桿菌的總蛋白含量中占比較大[7?9]。表層蛋白的提取通常采用高濃度解離劑法，表層蛋白亞基以及表層蛋白與細(xì)胞壁之間通過非共價(jià)鍵連接，因此可通過高濃度的解離劑提取表層蛋白[10]。LiCl（氯化鋰）、鹽酸胍和尿素是常用的表層蛋白解離劑[11?13]。尹瓊芳等[14]分別利用4 mol/L鹽酸胍和5 mol/L LiCl 提取L. acidophilusCGMCC 1.1878 和L. acidophilusLA1 的表層蛋白，電泳發(fā)現(xiàn)其分子量約為46 kDa。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mol/L LiCl 提取的粗蛋白含量更多，效果更好。Zhang 等[15]分別利用LiCl 和尿素提取L. acidophilusCICC6074 表層蛋白，分子量約為46 kDa。目前關(guān)于表層蛋白的提取方法差異性較大，通常采用高濃度的解離劑提取方法。但高濃度解離劑提取的表層蛋白通常含有雜蛋白，因此需進(jìn)一步優(yōu)化蛋白的提取方法。

本文用5 mol/L LiCl 法、4 mol/L 鹽酸胍法、8 mol/L 尿素法、兩種不同濃度的LiCl 法（5 mol/L和1 mol/L）提取乳桿菌表層蛋白，通過比較每種方法所提取蛋白的總蛋白濃度、對(duì)乳桿菌的表面特性以及存活率的影響，找到提取乳桿菌表層蛋白的最適方法。為之后研究乳桿菌表層蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)與功能應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）JCM 1132 由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供；電泳低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker，相對(duì)分子質(zhì)量范圍 14.4～97.4 kDa）、透析袋（截留分子量8～14 kDa） 上海源葉生物科技有限公司；其它試劑 均為分析純。

ZD85 氣浴恒溫振蕩器 國華電器有限公司；GL-20G 高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；722S 型分光光度計(jì) 上海渡楊精密儀器；GNP-9050 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏儀器廠；SWCJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái) 上海篤特科學(xué)儀器廠；MVS1 漩渦混合機(jī) 北京金北德工貿(mào)有限公司；ML204 電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化與傳代 在安瓿瓶管內(nèi)加入無菌的MRS（de Man-Rogosa-Sharpe）液體培養(yǎng)基，輕輕振蕩。取適量菌懸液轉(zhuǎn)接到MRS 固體培養(yǎng)基，37oC恒溫培養(yǎng)48 h。接種環(huán)挑取單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基，37oC 恒溫培養(yǎng)18 h。取培養(yǎng)液再次轉(zhuǎn)接MRS 液體培養(yǎng)基中，按接種量2%（v/v），37oC 恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h，以此提高菌株活性，置于4 ℃冰箱內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.2 表層蛋白的提取 1000 mL 的乳桿菌菌懸液離心（5000 r/min，15 min），收集菌體。無菌PBS（pH 7.2）洗滌兩次，再次離心收集菌體。分別加入菌懸液1/20 體積的提取劑（5 mol/L LiCl，4 mol/L 鹽酸胍，8 mol/L 尿素）重懸菌體，37oC 處理30 min。4oC下12000 r/min 離心20 min，所得上清液即為表層蛋白粗提液。在4oC 下用去離子水對(duì)上清液進(jìn)行透析48 h，12000 r/min 離心20 min 收集沉淀，即為不同提取方法提取的表層蛋白[16]。

將按上述方法5 mol/L LiCl 提取的沉淀再加入菌懸液1/20 體積的1 mol/L LiCl 溶液重懸，37oC 處理30 min。4oC 下12000 r/min 離心20 min，所得上清液即為兩種不同濃度的LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）提取兩次所得到的表層蛋白粗提液。去離子水透析，離心收集沉淀。

1.2.3 表層蛋白濃度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液分別在260 nm 和280 nm 處的OD 值，蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式為：

1.2.4 表層蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 配制5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）。將表層蛋白樣品溶于10%的SDS 溶液中，2×上樣緩沖液與樣品等體積混合，沸水浴加熱5 min，上樣量15 μL。濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。

1.2.5 乳桿菌存活率的測(cè)定 37oC 恒溫?fù)u床培養(yǎng)乳桿菌18 h，離心收集菌體（5000 r/min，4oC，5 min）。600 nm 波長(zhǎng)下調(diào)整菌懸液吸光值至（1.00±0.01），離心收集菌體。無菌PBS 等比稀釋菌體后，將菌體涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，活菌計(jì)數(shù)，三組平行實(shí)驗(yàn)取其平均值，記為N0。分別取5 mol/L LiCl、4 mol/L 鹽酸胍、兩種不同濃度的LiCl 法（5 mol/L 和1 mol/L）、8 mol/L 尿素處理后的菌體，實(shí)驗(yàn)操作如上所述。對(duì)失去表層蛋白的乳桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，記為N1。依照公式計(jì)算乳桿菌的存活率：

1.2.6 乳桿菌表面疏水性的測(cè)定 參考Kos 等[17]的MATH 方法，分別計(jì)算不同方法處理后菌體的表面疏水率。0.01 mol/L 無菌PBS 洗滌菌體兩次后，菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm波長(zhǎng)下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為（0.50±0.01），準(zhǔn)確讀數(shù)，記為A0。0.1 mol/L KNO3溶液作為空白對(duì)照組，將菌懸液與二甲苯按照3:1 的體積比混合，室溫反應(yīng)10 min，漩渦振蕩2 min 后，再次室溫反應(yīng)20 min。測(cè)定分層后的水相在波長(zhǎng)600 nm 處的OD 值，記為A1。乳桿菌表面疏水率的計(jì)算如下：

1.2.7 乳桿菌表面電荷的測(cè)定 參考Kos 等[17]的實(shí)驗(yàn)方法，路易斯酸堿采用三氯甲烷和乙酸乙酯，測(cè)定表層蛋白與菌體表面電荷的關(guān)系。離心得到的菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm 波長(zhǎng)下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為0.50±0.01，準(zhǔn)確讀數(shù)，記為A0。0.1 mol/L KNO3溶液作為空白對(duì)照組，將菌懸液與三氯甲烷或乙酸乙酯按照3:1 的體積比混合，室溫反應(yīng)10 min，漩渦振蕩2 min 后，再次室溫反應(yīng)20 min。測(cè)定分層后水相的OD600值，記為A1。不同方法提取表層蛋白后乳桿菌溶劑吸附率的計(jì)算如下：

1.2.8 乳桿菌自動(dòng)聚集能力的測(cè)定 參考劉珊娜等[18]的實(shí)驗(yàn)方法，菌懸液5000 r/min 離心15 min 得到菌體，PBS 洗滌兩次后重懸于PBS 緩沖液中。600 nm波長(zhǎng)下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為（0.50±0.01），準(zhǔn)確讀數(shù)，記為A0。將菌懸液混勻，室溫靜置4 h，測(cè)定分層后水相的OD600值，記為A4。乳桿菌自動(dòng)聚集率的計(jì)算公式如下：

1.2.9 乳桿菌與致病菌的共聚集能力的測(cè)定 37oC恒溫?fù)u床培養(yǎng)乳桿菌18 h，菌懸液（5000 r/min，4oC，5 min）離心得到的菌體重懸于0.1 mol/L KNO3溶液（pH6.2）。600 nm 波長(zhǎng)下調(diào)節(jié)菌懸液的OD 值為0.50±0.01。將2 mL 乳桿菌菌懸液與致病菌菌懸液等量混合，旋渦振蕩10 s。室溫下放置4 h 后測(cè)定OD600值，記為AM。同時(shí)分別取4 mL 乳桿菌和致病菌懸液作為對(duì)照組，室溫下放置4 h 后OD600值，分別記為AL和AP[19]。依照如下公式計(jì)算不同提取方法后失去表層蛋白的乳桿菌與致病菌的共聚集率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，通過SPSS Statistics 20.0?（美國 IBM 公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)，代表數(shù)據(jù)的差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 表層蛋白的SDS-PAGE 分析

表層蛋白與細(xì)胞壁之間通過非共價(jià)鍵相連接，高濃度的解離劑如LiCl、鹽酸胍和尿素等可以提取表層蛋白。Johnson 等[20]提出，先用5mol/L LiCl 處理后再用1 mol/L LiCl 處理提取表層蛋白可得到純度較高的表層蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用四種不同方法提取表層蛋白，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分析，比較各方法提取的表層蛋白的純度，結(jié)果如圖1。

圖1 不同方法提取菌體表層蛋白的SDS-PAGE 圖Fig.1 SDS-PAGE of different methods to extract the surface layer proteins

已知嗜酸乳桿菌表層蛋白的分子量約為46 kDa[21?23]，圖中可以看出2 和3 號(hào)泳道蛋白條帶最為密集，粗蛋白分子量分布較廣，但目標(biāo)蛋白（46 kDa）的提取量低。推測(cè)可能是鹽酸胍和尿素導(dǎo)致表層蛋白的降解。泳道1 和4 提取的目標(biāo)蛋白的量明顯增加，在46 kDa 左右有明顯的蛋白條帶，與之前的研究結(jié)果相符[15]。泳道4 有明顯的單一的蛋白條帶，提取效果最好，故5 mol/L 和1 mol/L LiCl法是最適提取表層蛋白的方法。

2.2 蛋白含量測(cè)定

不同方法提取的表層蛋白濃度結(jié)果如圖2。兩種不同濃度LiCl 法所得表層蛋白濃度是最高的，為4.61 mg/mL，5 mol/L LiCl 法次之，8 mol/L 尿素法濃度最低。說明用兩種不同濃度LiCl 法提取表層蛋白，可以更徹底地將表層蛋白粗提液中的糖類、脂類等其他大分子過濾掉，從而提取得更高純度的蛋白樣品。

圖2 不同方法提取表層蛋白的濃度Fig.2 Surface layer proteins concentrations extracted by different methods

2.3 不同提取方法對(duì)乳桿菌存活率影響

在實(shí)驗(yàn)過程中，表層蛋白的提取劑對(duì)乳桿菌菌體的損傷是不可避免的，但不同提取劑對(duì)菌體的損傷是否會(huì)引起其存活率的大幅度下降尚未可知。

本實(shí)驗(yàn)采用平板計(jì)數(shù)法研究了不同提取方法對(duì)乳桿菌存活率的影響，結(jié)果如表1 所示。用兩種不同濃度LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）處理后，乳桿菌存活率最高，其他方法處理的菌體存活率損失在14%～17%左右，均在一個(gè)1 個(gè)log 以內(nèi)，說明表層蛋白的去除對(duì)乳桿菌的存活沒有太大影響。研究發(fā)現(xiàn)LiCl 處理L. helveticusATCC 12046 后引起了菌體1 個(gè)log 內(nèi)的損傷[24]。孟珺等[25]也發(fā)現(xiàn)LiCl 剝離乳桿菌表層蛋白后引起的菌體損傷在6%～11%左右，均在一個(gè)1 個(gè)log 以內(nèi)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

表1 不同提取方法對(duì)嗜酸乳桿菌存活率的影響Table 1 Effect of different extraction methods on the survival rate of L. acidophilus

2.4 不同提取方法對(duì)乳桿菌表面疏水性的影響

乳桿菌可通過特異性黏附和非特異性黏附定植于上皮細(xì)胞，其中疏水作用力是乳桿菌非特異性黏附的重要作用力。Perez 等[26]發(fā)現(xiàn)黏附性較好的雙歧桿菌菌株都具備高疏水性。為了研究表層蛋白提取方法對(duì)乳桿菌表面疏水性的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇四種不同的蛋白提取方法測(cè)定乳桿菌表面疏水性的變化。

結(jié)果如表2 所示，未處理的L. acidophilusJCM 1132 的表面疏水率為47.00%，四種方法處理后的L.acidophilusJCM 1132 表面疏水率均有顯著下降（P<0.05）。其中，用5 mol/L LiCl 處理后的菌株和5 mol/L 和1 mol/L LiCl 處理后的菌株表面疏水率最低，約為13.87%。5 mol/L LiCl 處理的菌株疏水率下降幅度最大，約為33.13%，8 mol/L 尿素處理的下降幅度最小，約為23%。這與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，LiCl 法提取表層蛋白效果更好且提取表層蛋白的濃度更高導(dǎo)致乳桿菌的表面疏水性更低。推測(cè)表層蛋白對(duì)乳桿菌的表面疏水性及非特異性黏附有著重要的貢獻(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌的疏水性通常與其粘附性之間呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。Collado 等[19]發(fā)現(xiàn)L. acidophilus等多株乳桿菌具有較高的表面疏水率，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

表2 不同提取方法對(duì)嗜酸乳桿菌表面疏水性的影響Table 2 Effect of different extraction methods on surface hydrophobicity of L. acidophilus

2.5 不同提取方法對(duì)乳桿菌表面電荷的影響

除了表面疏水性之外，菌株的表面電荷也會(huì)影響菌體的非特異性黏附。表面電荷強(qiáng)的菌株對(duì)腸道粘膜具有較強(qiáng)的黏附能力[27]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同方法提取表層蛋白后菌株的表面電荷的變化，結(jié)果如表3 和表4 所示：未處理的L. acidophilusJCM 1132 對(duì)三氯甲烷的吸附率高達(dá)90.93%，表明未處理的菌株具有很強(qiáng)的給電子能力。對(duì)乙酸乙酯的吸附率很弱，只有26.33%，說明其接受電子的能力很低。通過四種不同方法去除表層蛋白后，L. acidophilusJCM 1132 對(duì)三氯甲烷的吸附率都有明顯下降（P<0.05），表明菌體給電子能力降低。

表3 不同提取方法處理后嗜酸乳桿菌對(duì)三氯甲烷的吸附率Table 3 Adsorption rate of trichloromethane by L. acidophilus after different extraction methods

表4 不同提取方法處理后嗜酸乳桿菌對(duì)乙酸乙酯的吸附率Table 4 Adsorption rate of ethyl acetate by L. acidophilus after different extraction methods

然而不同方法處理后菌體對(duì)乙酸乙酯的吸附率不全是下降趨勢(shì)。用4 mol/L 鹽酸胍和8 mol/L 尿素方法處理的乳桿菌在失去表層蛋白后，對(duì)乙酸乙酯的吸附率反而升高。菌體的表面電荷不僅與表層蛋白所帶電荷有關(guān)，還受到細(xì)胞壁羥基、羧基、磷酸基團(tuán)等極性基團(tuán)的影響，推測(cè)其原因可能是其他物質(zhì)作用更能影響L. acidophilusJCM 1132 表面電荷，具體機(jī)理還需要更深入探討[25]。

孟珺等[25]提取了7 株不同乳桿菌表層蛋白后發(fā)現(xiàn)其對(duì)三氯甲烷的吸附率明顯降低，與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。推測(cè)不同方法提取表層蛋白后都會(huì)影響菌體的表面電荷。由于菌體的非特異性黏附與表面疏水性和表面電荷相關(guān)，因此推測(cè)不同方法提取表層蛋白后菌體的非特異性黏附特性均會(huì)明顯降低。

2.6 不同提取方法對(duì)乳桿菌自動(dòng)聚集能力的影響

乳桿菌的自聚集能力和共聚集能力與其對(duì)胃腸道的黏附作用和抵抗致病菌有關(guān)。菌株的自聚集作用和黏附作用呈正相關(guān)，自聚集能力強(qiáng)的菌株的黏附作用強(qiáng)，反之，則低[28]。本實(shí)驗(yàn)通過四種方法去除L.acidophilusJCM 1132 表層蛋白后，測(cè)定其自動(dòng)聚集能力的變化也證明了表層蛋白對(duì)乳桿菌的非特異性黏附有著積極的貢獻(xiàn)。

結(jié)果如表5 所示，用四種不同方法處理后，乳桿菌自聚集率都有顯著下降（P<0.05），下降幅度約為4%～19%。其中4 mol/L 鹽酸胍處理后菌株的自聚集能力下降最多，下降幅度為19%。5 mol/L LiCl 處理后菌株的自聚集能力下降最少，下降幅度為4%。表明不同的處理方法均能降低菌體的自聚集能力。

表5 不同提取方法對(duì)嗜酸乳桿菌自動(dòng)聚集能力的影響Table 5 Effect of different extraction methods on the autoaggregation ability of L. acidophilus

Chen[29]等去除L. crispatusZJ001 表層蛋白后，菌體自動(dòng)聚集力和對(duì)Hela 細(xì)胞的黏附力都有明顯的下降趨勢(shì)。Beganovic 等[30]報(bào)道5 mol/L LiCl 處理L. helveticusM92 后，其自動(dòng)聚集率下降了10%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.7 不同提取方法對(duì)乳桿菌共聚集能力的影響

本實(shí)驗(yàn)采用致病菌Salmonella typhimuriumFP1 作為病原菌的代表，測(cè)定不同處理方法后對(duì)乳桿菌共聚集能力的影響。結(jié)果如表6 所示：未處理前，菌體與S. typhimurium的共聚集率約為2.7%，表明該菌株與致病菌的共聚集能力較弱。用四種不同方法處理后，乳桿菌與致病菌共聚集率明顯降低。其中8 mol/L 尿素處理處理后的乳桿菌共聚集能力下降幅度最小，約為1.47%。兩種不同濃度LiCl（5 mol/L和1 mol/L）處理的乳桿菌共聚集能力下降幅度最大，約為2.36%。表明表層蛋白參與了乳桿菌的共聚集過程。

表6 不同處理方法對(duì)嗜酸乳桿菌共聚集能力的影響Table 6 The effect of different extraction methods on the coaggregation ability of L. acidophilus

Beganovic 等[30]研究了LiCl 處理對(duì)L. helveticusM92 與S. typhimuriumFP1 共聚集率的影響，發(fā)現(xiàn)LiCl 去除表層蛋白后兩株菌的共聚集率下降了約7.52%，與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用5 mol/L LiCl、4 mol/L 鹽酸胍、8 mol/L尿素和兩種不同濃度的LiCl（5 mol/L 和1 mol/L）提取菌體表層蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE 分析，兩種不同濃度LiCl 提取的表層蛋白含量顯著高于其余三種方法，且有單一條帶，相對(duì)分子質(zhì)量在46 kDa 左右。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定乳桿菌致死率，結(jié)果表明四種提取方法對(duì)乳桿菌菌體的損傷都較小，不會(huì)影響到菌體的存活率。但菌體的表面疏水性、表面電荷、自聚集能力與共聚集能力都呈明顯下降趨勢(shì)，表明表層蛋白參與了菌體自聚集與共聚集的過程，且對(duì)菌體的非特異性黏附有積極的貢獻(xiàn)。