馬菁華 歐明燭 任啟飛 劉芳 楊朔 陳云飛 周艷

摘 要：采用組培培養(yǎng)技術(shù)探討昌感秋海棠最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：選用葉片作為組培外植體更佳，初代、繼代、生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基依次為MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA、MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA、1/2MS+0.2mg/L NAA，最佳煉苗基質(zhì)為珍珠巖∶蛭石∶泥炭蘚=1∶1∶2。

關(guān)鍵詞：昌感秋海棠;組培;生根培養(yǎng);煉苗

中圖分類號(hào) S661.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）15-0039-03

Study on Tissue Culture and Strong Seedling Stress of Begonia Cavaleriei

MA Jinghua et al.

（Guizhou Botanical Garden， Guiyang， Guiyang 550004， China）

Abstract： The study was focused on the best conditions of tissue culture of Begonia Cavaleriei. The results showed that the best explants for tissue culture came to be the leaves， and the best medium for primary culture， subculture and rooting culture were MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA， MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA， 1/2MS+0.2mg/L NAA， respectively. The best seedling substrate was perlite+vermiculite+sphagnum（1∶1∶2）.

Key words： Begonia cavaleriei; Tissue culture; Rooting; Seedling stress

昌感秋海棠（Begonia cavaleriei Levl）是秋海棠科秋海棠屬的多年生草本植物，葉片翠綠，盾形，厚紙質(zhì);白色至粉紅色花朵，聚傘狀，嬌小可愛，可作觀賞。昌感秋海棠為中國(guó)特有種，分布在貴州、廣西、云南等地[1]，野生昌感秋海棠生于山溝巖壁或石縫隙、山腳蔭密林下等蔭濕處，生境較脆弱。另外，昌感秋海棠也是傳統(tǒng)的中藥材，全草可入藥，有抗炎止痛等功效，是我國(guó)少數(shù)民族常用中草藥[2]。由此可見，昌感秋海棠是重要的野生花卉資源，且有藥用功效，具有較好的開發(fā)利用價(jià)值，但其生境面臨一定威脅。秋海棠常見的繁殖方式包括種子繁殖、珠芽繁殖、塊莖繁殖、葉片扦插、組織培養(yǎng)等。種子繁殖的后代易產(chǎn)生變異;珠芽繁殖受到葉片和珠芽數(shù)量的限制;扦插需要較多葉片且受季節(jié)影響，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速高效繁殖;組培可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量后代，且很好地保持品種的優(yōu)良性能，已有多種秋海棠屬植物組培成功[3-6]。為此，筆者開展昌感秋海棠的組培再生體系研究，為保護(hù)秋海棠種質(zhì)資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 昌感秋海棠于2017年采自貴州施秉，帶土移栽于貴州省植物園。引種栽培1年后，昌感秋海棠已完全適應(yīng)本地環(huán)境，在植物園內(nèi)生長(zhǎng)良好[7]，已經(jīng)進(jìn)行大量繁殖。于天氣晴朗時(shí)選取生長(zhǎng)健壯的植株，取其葉片和葉柄作為外植體。

1.2 外植體處理 將昌感秋海棠連同葉柄剪下，帶回實(shí)驗(yàn)室用自來(lái)水沖洗10min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，將葉片和葉柄分離，葉柄剪成5cm左右小段，葉片剪5cm×5cm的小片，然后用75%酒精浸泡10s，無(wú)菌水沖洗4次，10%NaClO溶液浸泡10min，無(wú)菌水沖洗5次，然后將外植體置于無(wú)菌濾紙片上吸干水分，葉片剪成1cm2左右的小塊，葉柄剪成1cm左右的小段，接種于事先準(zhǔn)備好的滅菌培養(yǎng)基中。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo) 將消毒好的外植體接種到初代培養(yǎng)基中，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA不同濃度組合：6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L，6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L，6-BA 3mg/L+NAA 0.4mg/L，6-BA 4mg/L+NAA 0.5mg/L。每處理接種6瓶，每瓶5個(gè)外植體，一定時(shí)間后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)

1.4 叢生芽誘導(dǎo)分化 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)6-BA、NAA和赤霉素GA不同濃度組合：6-BA（1mg/L，2mg/L）+NAA（0.2mg/L，0.3mg/L）+GA（0.4mg/L，0.5mg/L），接種愈傷組織，設(shè)8個(gè)處理，每處理接種5瓶，每瓶4個(gè)外植體，每隔7d觀察愈傷組織分化為叢生芽的數(shù)量，一定時(shí)間后統(tǒng)計(jì)叢生芽分化率。

芽分化率（%）=愈傷組織再分化成芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)

1.5 壯苗與生根誘導(dǎo) 以1/2或1/3MS為基本培養(yǎng)基，添加IAA或NAA，共6個(gè)處理，將較大的叢生芽剪切為數(shù)個(gè)大小合適的芽接種到培養(yǎng)基中。每處理接種4瓶，每瓶2～3個(gè)叢生芽，一定時(shí)間后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)和生根率，對(duì)比各處理苗的生長(zhǎng)狀況。生根率為長(zhǎng)根叢生芽占總接種叢生芽的數(shù)量比率;平均根數(shù)以叢生苗為基數(shù)，統(tǒng)計(jì)每株叢生苗生發(fā)的根數(shù)，計(jì)算平均值。

1.6 無(wú)菌組培苗煉苗 將生根的無(wú)菌組培苗取出，清洗根部培養(yǎng)基，適當(dāng)修剪根長(zhǎng)，在50%多菌靈溶液中蘸取2次以對(duì)根部進(jìn)行殺菌，將組培苗接種于4種不同組合的基質(zhì)中?；|(zhì)組合為：珍珠巖+蛭石（1∶1）、珍珠巖+蛭石+泥炭蘚（1∶1∶2）、珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）、水苔+泥炭蘚（1∶2）。移栽初期每3d適量澆水，植株適應(yīng)基質(zhì)后進(jìn)行4周的濕潤(rùn)訓(xùn)練，每2d充足澆水1次，之后進(jìn)行4周的干旱訓(xùn)練，每周1次充足澆水，其余時(shí)間不補(bǔ)水。每處理16株組培苗，觀察并統(tǒng)計(jì)移栽苗的生長(zhǎng)情況。

1.7 培養(yǎng)條件 愈傷組織誘導(dǎo)至不定芽生根，所有培養(yǎng)過程在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為日間模式14h（光照強(qiáng)度1200lx、25℃），夜間模式10h、20℃。煉苗在溫室中進(jìn)行，自然光照及溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體和激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 外植體接種到初代培養(yǎng)基15d后，各處理外植體邊緣開始膨大形成愈傷組織。接種30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率。由表1可知，各組合下外植體開始分化的時(shí)間不同，且以葉片較早。較低激素濃度組合下，外植體幾乎沒有玻璃化現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)濃度達(dá)到3mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA時(shí)，葉柄出現(xiàn)一定玻璃化，濃度再增加時(shí)葉片也開始玻璃化，但總體玻璃化程度較輕，在10%以內(nèi)。褐化現(xiàn)象與玻璃化趨勢(shì)相反，在較低激素濃度組合時(shí)褐化較嚴(yán)重，達(dá)到20%，隨著濃度升高，褐化減輕，低至3.3%。外植體的分化率總體較高，MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA 組合下葉柄分化率大于葉片，為86.7%，其他激素組合分化率均在90%以上，且葉片分化率更高，在MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的組合下達(dá)到100%。由此可見，葉片和葉柄均可誘導(dǎo)形成愈傷組織，但綜合考慮試驗(yàn)時(shí)間和愈傷組織誘導(dǎo)率，選用葉片作為組培外植體更佳，且以2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA的激素組合最適于外植體分化。

2.2 不同激素組合對(duì)叢生芽誘導(dǎo)分化的影響 愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽的分化，約2周后開始分化形成叢生芽，30d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，形成叢生芽的外植體數(shù)占總接種外植體的比例為增殖率，叢生芽高度大于0.5cm的外植體占形成叢生芽的外植體的比例為大芽比率。由表2可知，所有激素組合中，昌感秋海棠愈傷組織在繼代培養(yǎng)中沒有玻璃化，但有不同程度的褐化現(xiàn)象發(fā)生;總體增殖率在60%以上，受6-BA含量影響較大，6-BA含量較高時(shí)增殖率較高;叢生芽高度多數(shù)在0.5cm以下，僅2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA組合有50%以上叢生芽高度超過0.5cm，因此繼代培養(yǎng)以該激素組合為最佳組合，能在較短時(shí)間內(nèi)得到較多、較為理想的叢生芽。

2.3 不同培養(yǎng)基和激素組合對(duì)生根壯苗誘導(dǎo)的影響 36d后，各處理組培苗葉片明顯長(zhǎng)大，且均明顯生根，已長(zhǎng)成為正常形態(tài)的植株。由表3可知，各組合對(duì)昌感秋海棠無(wú)菌苗誘導(dǎo)生根的能力均較強(qiáng)，生根率在90%以上，但生根數(shù)量有所不同，且根與植株長(zhǎng)勢(shì)因培養(yǎng)基有所差異。總體而言，1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)于1/3MS。組培苗平均根數(shù)量方面，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)植株生根數(shù)量在5.3以上，1/3MS時(shí)在5.8以下，前者更有利于生發(fā)更多新根;根形態(tài)方面，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)植株根系較粗，健康茁壯，而1/3MS時(shí)根系細(xì)弱，不利于根系吸收養(yǎng)分為地上部供給養(yǎng)分;植株長(zhǎng)勢(shì)與根系形態(tài)關(guān)系密切，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)植株總體長(zhǎng)勢(shì)較好，而1/3MS時(shí)植株矮小。其中，1/2MS+0.2mg/L NAA的組合生根壯苗效果最好，生根率達(dá)到100%，且生根數(shù)量適中，根系發(fā)達(dá)，植株健壯，葉片翠綠茂密，總體更加有生機(jī)。

2.4 不同基質(zhì)對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響 各煉苗基質(zhì)對(duì)無(wú)菌組培苗的影響不同。由表4可知，適應(yīng)2周后，絕大多數(shù)組培苗生長(zhǎng)良好，尤以珍珠巖+蛭石+泥炭蘚（1∶1∶2）和水苔+泥炭蘚（1∶2）的基質(zhì)配比為佳，成苗率達(dá)100%;植株適應(yīng)基質(zhì)后進(jìn)行為期30d的濕潤(rùn)訓(xùn)練，每2d充足澆水1次，此時(shí)珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）的基質(zhì)因?yàn)槭杷笟廨^好而保持較高的成苗率;之后進(jìn)行為期30d的干旱訓(xùn)練，每周僅充足澆水1次，此時(shí)珍珠巖+蛭石（1∶1）和珍珠巖+蛭石+水苔+樹皮（1∶1∶1∶1）的基質(zhì)因保水能力差而死苗嚴(yán)重，達(dá)100%，而珍珠巖+蛭石+泥炭土（1∶1∶2）和水苔+泥炭蘚（1∶2）因其持水保水能力強(qiáng)而維持較好的成苗率，前者成苗率達(dá)70%。由此可見，珍珠巖+蛭石+泥炭土的基質(zhì)組合能同時(shí)達(dá)到理想的疏水和保水能力，有利于昌感秋海棠的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：昌感秋海棠組培繁育時(shí)，選用葉片作為組培外植體，培養(yǎng)基中添加2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA，初代培養(yǎng)效果最佳;培養(yǎng)基中添加2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.4mg/L GA有助于叢生芽的形成與生長(zhǎng)，繼代培養(yǎng)效果最理想;以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.2mg/L NAA，生根壯苗效果最好，生根率100%，且植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，根葉繁茂;選用珍珠巖∶蛭石∶泥炭蘚=1∶1∶2的基質(zhì)進(jìn)行煉苗可以達(dá)到最佳效果，此時(shí)組培苗既能適應(yīng)濕潤(rùn)的多水環(huán)境，又能承受較為長(zhǎng)期的干旱環(huán)境。試驗(yàn)過程中應(yīng)注意控制培養(yǎng)基的濕度和培養(yǎng)條件，降低玻璃化與褐化現(xiàn)象的發(fā)生幾率。本研究成果可在短時(shí)間內(nèi)繁殖大量秋海棠無(wú)菌組培苗，為昌感秋海棠物種保護(hù)和繁育提供技術(shù)交換。

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（責(zé)編：徐世紅）

基金項(xiàng)目：貴州科學(xué)院省級(jí)科研專項(xiàng)資金項(xiàng)目“貴州喀斯特植物資源保育平臺(tái)建設(shè)”黔科院科專合字[2019]07號(hào);貴州科學(xué)院基金“秋海棠屬植物種質(zhì)資源收集及利用評(píng)價(jià)”黔科院字[2017]02號(hào)。

作者簡(jiǎn)介：馬菁華（1991—），女，河南焦作人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事植物資源收集與保護(hù)工作。

通訊作者 ?收稿日期：2021-06-03