金鑫燕

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

生長(zhǎng)激素受體(growth hormone receptor，GHR)基因位于牛20號(hào)染色體，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，其堿基序列的突變可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)及功能的改變，進(jìn)而影響到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長(zhǎng)激素作用的生理效應(yīng)，最終影響產(chǎn)奶、產(chǎn)肉等經(jīng)濟(jì)性狀。因此，將牛GHR基因作為候選基因，研究其與生產(chǎn)性能的關(guān)系，對(duì)牛的育種有很大實(shí)踐意義[1,2]。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding SNP，cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。cSNP又可分為兩種：一種是同義cSNP，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP，即堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。本試驗(yàn)對(duì)牦牛GHR基因exon 10片段進(jìn)行了SNP檢測(cè)，旨在結(jié)合各乳成分?jǐn)?shù)據(jù)研究該序列各SNP是同義突變還是非同義突變，是否影響各乳成分，為下一步將該遺傳標(biāo)記應(yīng)用于牦牛泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自青海省澤庫(kù)縣有機(jī)牧場(chǎng)，采集20頭(胎次為2～3胎，年齡為6～7歲，產(chǎn)犢時(shí)間為當(dāng)年4月底到5月初)泌乳牦母牛頸靜脈血樣5mL，干冰保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用柱式血液基因組DNA抽提試劑盒。提取后DNA采用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。

1.3 引物序列及PCR反應(yīng)程序

PCR引物設(shè)計(jì)參照NCBI 中登錄號(hào)為AM161140.1序列，參考exon 10所在序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1。

表1 牦牛exon 10 PCR擴(kuò)增引物序列

PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μL，引物F、R 各2μL，dNTP 2μL，10×Taq buffer 5μL，Taq酶 0.5μL加ddH2O至50μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)。循環(huán)3次，72℃修復(fù)延伸6min。

1.4 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序

PCR產(chǎn)物切膠后經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后冷凍，冷凍樣品干冰保存送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序及檢測(cè)SNP。

1.5 SNP多態(tài)性分析軟件

用lasergene軟件中SeqMan程序進(jìn)行序列比對(duì)，用Chromas軟件進(jìn)行峰圖比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛GHR基因exon 10 序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增exon 10分成兩個(gè)片段擴(kuò)增，左側(cè)為引物P1擴(kuò)增序列(990bp),右側(cè)為引物P2擴(kuò)增序列(742bp)。

2.2 牦牛GHR基因exon 10序列SNP多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)牦牛20頭樣本中發(fā)現(xiàn)GHR基因相對(duì)于普通牛GHR exon 10(Genebank登錄號(hào)AM161140.1)AM161140.1-10第267位G，形成GG和AG兩種基因型，AM161140.1-10第336位T，形成TT和GT兩種基因型，AM161140.1-10第650位A，形成AA和AC兩種基因型。AM161140.1-10第702位T(C/C型),第730位A(A/G型),第755位(T/T型),第810位T(C/T型)，第989位 T(C/C型)。本試驗(yàn)牦牛群體，共含SNP多態(tài)位點(diǎn)5個(gè)，第730位A(A/G型)，第810位T(C/T型)。

2.3 各SNP位點(diǎn)多態(tài)產(chǎn)生的基因型

SNP多態(tài)位點(diǎn)共形成4種基因型，見表2。

表2 牦牛GHR基因exon 10 SNP多態(tài)位點(diǎn)產(chǎn)生的基因型

所有樣本形成4種基因型，GG/GT/AA/CC/AA/TT/CT/CC (基因型Ⅰ)1頭、GG/TT/AC/CC/AG/TT/TT/CC(基因型Ⅱ) 5頭、GG/TT/AA/CC/AA/TT/TT/CC 12頭(基因型Ⅲ)，AG/TT/AA/CC/AA/TT/TT/CC (基因型Ⅳ)2 頭，各基因型占比為1∶5∶12∶2，其中GG/TT/AA/AA/TT為優(yōu)勢(shì)基因型。

2.4 各基因型間乳成分平均值比較

表3 不同基因型間牦牛乳成分均值比較

2.5 不同基因型間方差分析

比較平均值后進(jìn)行單因素方差分析，多重比較，假定方差齊型采用LSD法，未假定齊性方差采用Dunnett’s T3法，顯著性水平設(shè)為0.05。

對(duì)不同組基因型各乳成分差異顯著性分析結(jié)果表明，各基因型間乳成分差異不顯著(P>0.5),即該基因SNP多態(tài)未產(chǎn)生對(duì)泌乳性狀的影響。

3 討論

3.1美國(guó)荷斯坦牛GWAS相關(guān)研究表明，20號(hào)染色體上包括C6基因和GHR基因的30.03～36.67 Mb 區(qū)域?qū)Ξa(chǎn)奶量影響顯著[3]。非洲本土奶牛Kenana基因組重測(cè)序研究與產(chǎn)乳性狀研究表明，CSN3、IGFBP-2、RORA、ABCG2、B4GALT1和GHR都是Kenana牛產(chǎn)奶性狀的可選候選基因[4]。據(jù)先前被報(bào)道對(duì)高度選擇的荷蘭黑白花奶牛的產(chǎn)奶量和品質(zhì)性狀有影響的53個(gè)候選基因96個(gè)SNP中，GHR基因SNP對(duì)蛋白質(zhì)和酪蛋白比例有影響[5]。Parmentier等[6]報(bào)道了GHR基因多態(tài)性與意大利荷斯坦奶牛的乳蛋白百分含量相關(guān)。Rahbar等[7]用PCR-RFLP法對(duì)伊朗荷斯坦奶牛GHR基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與泌乳性狀的相關(guān)性研究表明，Alu(+)基因型在第一泌乳期蛋白質(zhì)和脂肪含量明顯高于Alu(-/-)基因型。

3.2對(duì)該基因的研究熱點(diǎn)主要集中在第8外顯子，研究表明GHR基因第8外顯子T/A替代，導(dǎo)致受體跨膜區(qū)出現(xiàn)F279Y氨基酸替換，對(duì)牛的乳產(chǎn)量和乳成分產(chǎn)生顯著影響[8-12]。對(duì)中國(guó)荷斯坦牛GHR基因F279Y位點(diǎn)突變與產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)與305d產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率關(guān)聯(lián)顯著[13]。另有結(jié)果表明，AA型305d產(chǎn)奶量顯著高于AT型，AT型305d乳脂量、305d乳蛋白含量和305d乳糖量在數(shù)值上有優(yōu)于AA型的趨勢(shì)，等位基因A為高產(chǎn)奶量的優(yōu)勢(shì)基因，等位基因T對(duì)乳成分有正效應(yīng)，同時(shí)表明，GHR基因F279Y突變可作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于中國(guó)荷斯坦牛泌乳性狀的標(biāo)記輔助選擇育種[14]。王思偉等[15]研究了GHR基因F279Y位點(diǎn)對(duì)河北地區(qū)中國(guó)荷斯坦奶牛泌乳性能的影響，結(jié)果表明，該堿基突變對(duì)乳脂率的影響達(dá)到了顯著水平，而對(duì)乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量影響不顯著，TT基因型的乳脂率顯著高于AA基因型，AA和TA、TT和TA基因型之間無(wú)顯著差異。表明GHR基因該突變對(duì)河北地區(qū)中國(guó)荷斯坦奶牛泌乳性狀有較大的遺傳效應(yīng)，可用于泌乳性狀的分子標(biāo)記輔助選擇。Waters等[16]對(duì)32個(gè)假定的新GHR SNP和7個(gè)已發(fā)表的SNP(包括F279Y、1個(gè)外顯子1A啟動(dòng)子和5個(gè)外顯子)進(jìn)行了848個(gè)Holstein-Friesian人工授精種公畜的基因分型。利用加權(quán)動(dòng)物線性混合模型，對(duì)每一個(gè)分離SNP與表現(xiàn)遺傳價(jià)值之間的關(guān)系進(jìn)行了量化。6個(gè)已發(fā)表的SNP和7個(gè)新的SNP至少與其中一個(gè)性狀有關(guān)——產(chǎn)奶量、脂肪產(chǎn)量、蛋白質(zhì)產(chǎn)量、脂肪百分比、蛋白質(zhì)百分比、體細(xì)胞分?jǐn)?shù)、產(chǎn)犢間隔、存活和生長(zhǎng)以及大小性狀。GHR4.2和F279Y在848個(gè)Holstein-Friesians中不存在連鎖不平衡，表明它們與產(chǎn)奶量的關(guān)系是獨(dú)立的。

3.3有關(guān)牦牛GHR基因的研究報(bào)道較少，尤其是該基因?qū)γ谌樾阅苡绊懙难芯枯^為罕見，僅限于該基因在牦牛不同組織中的表達(dá)及對(duì)生長(zhǎng)性狀影響的研究?；蛩胶偷鞍姿窖芯勘砻鱃HR在牦牛不同組織中的表達(dá)存在差異性，肝臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次分別是心臟、腎臟、睪丸、肺臟和脾臟[17]。麥洼牦牛GHR基因SNP與體尺性狀與關(guān)聯(lián)性分析表明，第5、第10外顯子和第6內(nèi)含子中各發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)，而第5和第10外顯子中的SNP為同義突變，并未導(dǎo)致氨基酸的變化。第5外顯子SNP位點(diǎn)形成3種基因型TT/TC/CC，CC為優(yōu)勢(shì)基因型，且TT基因型個(gè)體的管圍極顯著高于TC和CC型，TC和CC型差異不顯著[18]。有關(guān)牛GHR基因外顯子10方面的研究，中國(guó)荷斯坦牛GHR基因外顯子10 PCR-RFLP多態(tài)產(chǎn)生的AA型個(gè)體乳脂率顯著高于BB型，AA型個(gè)體的體細(xì)胞數(shù)顯著低于AB型個(gè)體，AA型為優(yōu)勢(shì)基因型，等位基因A可顯著提高個(gè)體的乳脂率，降低個(gè)體體細(xì)胞數(shù)[19]。

3.4本研究中牦牛GHR 基因外顯子10片段SNP產(chǎn)生的不同基因型間泌乳性狀差異不顯著，說明這些SNP可能為同義cSNP，突變堿基與未突變堿基的含義相同，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所以并未導(dǎo)致性狀發(fā)生改變。該研究與海汀等[19]對(duì)麥洼牦牛GHR基因exon 10 中發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP的結(jié)論不同，但該片段SNP為同義突變的結(jié)論相似。因此，有關(guān)該片段方面的SNP應(yīng)結(jié)合較大樣本數(shù)量及不同群體進(jìn)行深入研究。