楊紅艷，盧 奎,2*，杜 蘅，劉廣斌

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044 3.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

近年來，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，微生物污染引起的食品安全問題和耐藥菌導(dǎo)致的環(huán)境安全問題逐漸成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)。食品在加工、貯藏、運(yùn)輸及消費(fèi)過程中，微生物污染是引起食品腐敗變質(zhì)的主要原因之一[1]。在世界范圍內(nèi)，每年由于微生物污染引發(fā)的食品安全事件頻頻發(fā)生，造成難以估計(jì)的損失。因此，食品防腐劑的使用在食品安全中扮演著重要角色，目前常見的食品防腐劑有山梨酸、苯甲酸及其鹽類等化學(xué)防腐劑[2]，雖然化學(xué)防腐劑的防腐效果穩(wěn)定且價(jià)格低廉，但近年來由于其大規(guī)模使用甚至濫用，消費(fèi)者對其安全性日益擔(dān)憂。有研究發(fā)現(xiàn)長期過量食用化學(xué)防腐劑會對人體造成積累性慢性傷害，甚至帶來致畸、致癌等危害[3-4]。因此，尋找新型安全高效的食品防腐劑已成為食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。

抗菌肽(antimicrobial peptides)，又稱抗微生物肽或宿主防御肽，是自然界生物體內(nèi)廣泛存在的一類分子多肽，是生物先天免疫的重要防御物質(zhì)，普遍具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5-6]。由于其安全、高效、抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、殺菌速度快、無免疫原性、作用機(jī)理獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)示著抗菌肽在食品安全領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用潛力[7]?？咕膩碓磸V泛，包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和兩棲類動物等[8-9]。昆蟲作為世界上種類最為繁多的生物物種之一，其生活環(huán)境復(fù)雜，遍布于除深海和極地外的每一個(gè)角落，具備較完善的自我防御系統(tǒng)，自身能夠分泌抗菌物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)[10]。迄今為止，在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽達(dá)200余種，占已知抗菌肽總數(shù)的10%左右。天蠶素抗菌肽是最早被發(fā)現(xiàn)的一類抗菌肽，主要是由昆蟲等分泌產(chǎn)生的具有抑菌性能的小分子肽類物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等生物活性[11-12]。自1972年瑞典科學(xué)家Boman等[13]首先從惜古比天蠶血淋巴中分離得到天蠶素抗菌肽以來，科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)多種天蠶素抗菌肽，其結(jié)構(gòu)特征和基因序列也先后得到確定[14-15]。

生物信息學(xué)是以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索和分析的科學(xué)，目前已廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、臨床醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[16]。近年來諸多學(xué)者嘗試將生物信息學(xué)應(yīng)用于抗菌肽的篩選和預(yù)測，并取得一定的成果。劉悅等[17]利用生物信息學(xué)工具對東北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的理化參數(shù)、親/疏水性、剪切位點(diǎn)、信號肽、跨膜區(qū)域、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測及分析，進(jìn)而通過小鼠傷口愈合試驗(yàn)及體外抑菌試驗(yàn)進(jìn)行活性驗(yàn)證。Taniguchi等[18]利用生物信息學(xué)方法從低蛋白大米副產(chǎn)品中鑒定出陽離子抗菌肽，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證其抗菌活性。Wang等[19]借助生物信息學(xué)工具對天蠶素抗菌肽Cecropin-A進(jìn)行改造，獲得抗菌活性更高的抗菌肽PEW300，并對其抗菌機(jī)制進(jìn)行研究。作者基于抗菌肽數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)方法，對9種天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)、氨基酸組成、疏水性、跨膜區(qū)域、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)、磷酸化和糖基化位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測分析，以期為深入研究天蠶素抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系、抗菌活性和作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為新型抗菌肽的設(shè)計(jì)改造提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取抗菌肽數(shù)據(jù)庫DRAMP(http://dramp.cpu-bioinfor.org/)中的9種天蠶素抗菌肽(Cecropin)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其來源及氨基酸序列如表1所示。

表1 天蠶素抗菌肽的來源及氨基酸序列Table 1 Sources and amino acid sequences of cecropin antimicrobial peptides

1.2 生物信息學(xué)分析方法

所用的生物信息學(xué)分析工具如表2所示。

表2 抗菌肽生物信息學(xué)分析工具Table 2 Bioinformatics analysis tools for the analysis of antimicrobial peptides

2 結(jié)果與分析

2.1 天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)分析

利用SIB維護(hù)的專業(yè)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)下的蛋白質(zhì)分析工具ProtParam tool對天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果見表3。

從表3可看出，9種天蠶素抗菌肽由31～37個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量較小，大約為3 500 Da，免疫原性較低。9種天蠶素抗菌肽均為陽離子型多肽，理論等電點(diǎn)(pI)在9.52～11.17之間，pH為7時(shí)帶2～7個(gè)正電荷，說明多肽在中性條件下溶解性較好，不易出現(xiàn)凝集和沉淀析出的現(xiàn)象，有利于抗菌肽的分離純化和應(yīng)用。Cecropin-B、Cecropin XJ、Cecropin-P4的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，推測為不穩(wěn)定多肽，其余多肽的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，推測為穩(wěn)定性多肽。9種抗菌肽的脂肪族指數(shù)均較高，在85.16～114.29之間，推測其熱穩(wěn)定性較好?？偲骄H水性值(GRAVY)可用來預(yù)測多肽的親水性強(qiáng)弱，范圍在-2～+2之間，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越好。除Cecropin-C外，其余抗菌肽的GRAVY為負(fù)值，表明該抗菌肽呈親水性，這一特性有利于其在以水為溶劑的食品體系中發(fā)揮抗菌活性[20]。

表3 天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)分析Table 3 Physicochemical properties of cecropin antimicrobial peptides

抗菌肽的抗菌活性往往與其理化特性有關(guān)，比如氨基酸組成、肽鏈長度、電荷數(shù)目與分布、空間結(jié)構(gòu)、疏水性和兩親性等[21-23]。一般認(rèn)為，陽離子型抗菌肽具有較好的抗菌活性，抗菌肽首先通過靜電作用吸附聚集在細(xì)菌表面，之后通過桶板模型、覆毯模型或者環(huán)孔模型等方式發(fā)揮抗菌作用[24]。本文中研究的9種天蠶素抗菌肽中含有多個(gè)精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸，使整個(gè)分子帶正電荷，這是天蠶素抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的重要基礎(chǔ)之一。

穩(wěn)定性是抗菌肽應(yīng)用的重要前提條件之一，經(jīng)預(yù)測，9種天蠶素抗菌肽的熱穩(wěn)定性較好。伍小松等[25]研究表明天蠶素抗菌肽在100 ℃加熱5～15 min仍具有較好的抗菌活性。Kim等[26]從燕尾蝶中分離得到的類天蠶素抗菌肽Papiliocin在100 ℃下加熱10～15 min仍可保持一定的活性，且對較高離子強(qiáng)度和酸堿具有一定的抗性。以上試驗(yàn)結(jié)果和本文中預(yù)測的熱穩(wěn)定性結(jié)果基本相符，預(yù)示著天蠶素抗菌肽在食品防腐保鮮方面具有較大的應(yīng)用空間。

2.2 天蠶素抗菌肽的氨基酸組成分析

利用Pepstats工具分析了天蠶素抗菌肽的氨基酸殘基組成，分析結(jié)果見圖1。

極微氨基酸Tiny：(A+C+G+S+T);小側(cè)鏈氨基酸Small：(A+B+C+D+G+N+P+S+T+V);脂肪族氨基酸Aliphatic：(A+I+L+V);芳香族氨基酸Aromatic：(F+H+W+Y);非極性氨基酸Non-polar：(A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y);極性氨基酸Polar：(D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z);帶電荷氨基酸Charged：(B+D+E+H+K+R+Z);堿性氨基酸Basic：(H+K+R);酸性氨基酸Acidic：(B+D+E+Z)圖1 天蠶素抗菌肽的氨基酸組成分析Fig.1 Composition analysis of amino acids of cecropin antimicrobial peptides

從圖1可看出，9種天蠶素抗菌肽中非極性氨基酸殘基物質(zhì)的量占比最高，在45%～68%之間；極性氨基酸殘基的物質(zhì)的量占比在31%～55%之間，其中堿性氨基酸殘基(24%)約是酸性氨基酸殘基(9.7%)的3倍。以細(xì)菌細(xì)胞膜為靶標(biāo)的抗菌肽，其疏水性須保持在一定范圍內(nèi)，通常疏水殘基占50%，疏水性過高則會導(dǎo)致抗菌肽聚集進(jìn)而形成沉淀，使得抗菌活性降低，同時(shí)溶血活性增強(qiáng)；疏水性過低則會造成抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞膜的插入能力減弱，導(dǎo)致抗菌活性降低[27]。9種天蠶素抗菌肽的疏水性殘基占45%～68%，推測天蠶素抗菌肽有較高的抗菌活性和較低的溶血活性。

有研究表明，抗菌肽的凈電荷數(shù)與抗菌活性之間存在一定相關(guān)性，帶正電荷的多肽與帶負(fù)電荷的磷脂之間的靜電作用是抗菌肽破壞細(xì)菌的第一步，并且這種靜電作用可增強(qiáng)抗菌肽的選擇性[28]。9種抗菌肽的堿性氨基酸殘基物質(zhì)的量占比均大于酸性氨基酸，使抗菌肽帶正電荷，有利于天蠶素抗菌肽與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜通過靜電作用結(jié)合在一起。

2.3 天蠶素抗菌肽的疏水性/親水性分析

利用ProtScale工具對天蠶素抗菌肽的親水性/疏水性進(jìn)一步分析，滑窗大小為9，用線性加權(quán)模型。結(jié)果如圖2所示。

圖2 天蠶素抗菌肽的疏水性/親水性分析Fig.2 Hydrophobicity and hydrophilicity analysis of cecropin antimicrobial peptides

從圖2可看出，9種抗菌肽的N-端均在負(fù)值區(qū)域，為親水區(qū)，C-端均在正值區(qū)域，為疏水區(qū)。Gregory等[29]報(bào)道抗菌肽Cecropin-A的N-端含多個(gè)堿性氨基酸，具有親水性，中間存在一個(gè)鉸鏈區(qū)，C-端為疏水區(qū)，與本文中預(yù)測結(jié)果基本一致，說明ProtScale工具對抗菌肽的疏水性預(yù)測具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4 天蠶素抗菌肽的兩親性和疏水力矩分析

抗菌肽的兩親性結(jié)構(gòu)在多肽與細(xì)菌相互作用過程中發(fā)揮重要作用，幾乎所有的抗菌肽與細(xì)胞膜作用時(shí)都會形成兩親性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)其破膜能力[30]。兩親性使得氨基酸在螺旋的側(cè)面上形成疏水力矩，因此多肽的疏水力矩可用來反映其兩親性[31]。利用HeliQuest軟件預(yù)測天蠶素抗菌肽的疏水力矩(μH)，結(jié)果如表4所示。

從表4可看出，Cecropin-P4的疏水力矩最小，為0.157，Cecropin-C的疏水力矩最大，為0.334，其余7種肽的疏水力矩在0.25左右，因此推測Cecropin-C的破膜能力最強(qiáng)。

表4 天蠶素抗菌肽的疏水力矩Table 4 Hydrophobic moment (μH) of cecropin antimicrobial peptides

螺旋輪是研究多肽α-螺旋結(jié)構(gòu)的有效工具，可直觀地反映多肽極性面和非極性面的氨基酸分布，有利于更好地分析多肽的兩親性[32]。利用NetWheels工具繪制了天蠶素抗菌肽的螺旋輪圖，如圖3所示。從圖3可看出，天蠶素抗菌肽的疏水性氨基酸和親水性氨基酸分別相對集中地分布在疏水區(qū)和親水區(qū)，使整個(gè)分子呈現(xiàn)兩親性α-螺旋的結(jié)構(gòu)。Nielsen等[33]研究表明天蠶素抗菌肽具有兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，通過膜損機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗菌目的，和本文中預(yù)測結(jié)果基本相符。

2.5 天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

二級結(jié)構(gòu)在抗菌肽發(fā)揮抗菌作用過程中起重要作用。Lv等[34]對豬源抗菌肽PMAP-36的結(jié)構(gòu)、抗菌活性及作用機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明PMAP-3的α-螺旋區(qū)為與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用的區(qū)域。利用HNN預(yù)測工具對天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，表5為抗菌肽二級結(jié)構(gòu)中各成分的含量，圖4為抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)分布圖。

表5 天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)的組成Table 5 Predicted secondary structures of cecropin antimicrobial peptides %

注：h代表α-螺旋；c代表無規(guī)卷曲；e代表延伸鏈。圖4 天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 Secondary structure distribution diagrams of cecropin antimicrobial peptides

從表5可看出，9種天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，含量在42.86%～67.74%之間，無規(guī)卷曲含量在22.22%～40.00%之間。Cecropin-C、Cecropin-D無延伸鏈，其他抗菌肽延伸鏈含量較低。推測天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主。從圖4可看出，Cecropin-A、Cecropin-B、Cecropin-P1、Cecropin-P2、Cecropin-P3的α-螺旋結(jié)構(gòu)主要位于N-端；Cecropin-C、Cecropin-D、CecropinXJ、Cecropin-P4的N-端和C-端均含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，且中間位置存在α-螺旋的中斷者，構(gòu)成螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)。Boman等[15]采用圓二色和二維核磁共振對天蠶素抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，結(jié)果表明天蠶素抗菌肽分子結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)α-螺旋，中間由丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸(Ala-Gly-Pro)組成的鉸鏈區(qū)連接，形成螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)。Giacometti等[35]同樣報(bào)道了天蠶素抗菌肽具有螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)，并通過試驗(yàn)表明該結(jié)構(gòu)對抗菌肽的穩(wěn)定性或抗菌活性具有重要作用。本文中利用HNN工具預(yù)測的天蠶素抗菌肽二級結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)[15，35]報(bào)道的相符。

2.6 天蠶素抗菌肽的信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測

信號肽是分泌性蛋白上的一段富含疏水性氨基酸的肽段, 用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。為了在各系統(tǒng)中表達(dá)天蠶素抗菌肽，本文中使用SignalP-5.0工具預(yù)測抗菌肽是否存在信號肽，預(yù)測結(jié)果顯示9種天蠶素抗菌肽不存在信號肽，推測其屬于非分泌蛋白。

跨膜區(qū)即蛋白質(zhì)序列中能跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，通常為α-螺旋結(jié)構(gòu)，含有20～25個(gè)氨基酸殘基，在細(xì)胞中起信號傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)通道等功能。通過對抗菌肽的跨膜區(qū)預(yù)測，能夠?qū)ζ洚愒幢磉_(dá)提供指導(dǎo)。使用在線軟件TMHMM、TMpred 預(yù)測天蠶素抗菌肽的跨膜區(qū)，預(yù)測結(jié)果表明，天蠶素抗菌肽沒有跨膜區(qū)，推測其可能屬于膜外蛋白，通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用而發(fā)揮殺菌作用。Peng等[36]研究表明，天蠶素抗菌肽通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，使細(xì)胞膜的滲透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，與本文中預(yù)測的抗菌機(jī)制相符。

2.7 天蠶素抗菌肽的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位即某種蛋白或某個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的存在部位，有助于蛋白質(zhì)功能的初步判斷。利用TargetP-2.0 Service在線軟件對天蠶素抗菌肽進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅Cecropin-A、Cecropin-P4定位于線粒體，其他抗菌肽可能定位于細(xì)胞外。因此，推斷Cecropin-A、Cecropin-P4主要在線粒體中發(fā)揮生物學(xué)作用，其他7種抗菌肽在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.8 天蠶素抗菌肽的糖基化和磷酸化位點(diǎn)

蛋白質(zhì)糖基化對其功能具有重要影響，不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、活性、運(yùn)輸和定位，而且在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子識別、免疫等過程中發(fā)揮重要作用[37]。經(jīng)預(yù)測，9種天蠶素抗菌肽糖基化位點(diǎn)的最高評分均低于0.5，推測天蠶素抗菌肽不存在糖基化位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍、研究最為深入的一種蛋白翻譯后修飾，在生物的整個(gè)生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[38]。利用NetPhos 3.1 Server對天蠶素抗菌肽的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表6。

從表6可看出，除Cecropin-A、Cecropin-C不存在磷酸化位點(diǎn)外，其他7種抗菌肽均存在磷酸化位點(diǎn)，且有的位點(diǎn)可被多種激酶磷酸化，如Cecropin-P4 第19位的絲氨酸可被unsp、PKA、cdc2激酶磷酸化，表明該抗菌肽在該位點(diǎn)被激酶磷酸化后，實(shí)現(xiàn)其生物功能。

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法對9種天蠶素抗菌肽進(jìn)行預(yù)測分析，預(yù)測結(jié)果表明天蠶素抗菌肽為陽離子兩親性多肽，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較高。推測天蠶素抗菌肽在與細(xì)菌作用過程中，抗菌肽首先通過靜電作用吸附聚集在細(xì)菌表面，然后抗菌肽的疏水端通過疏水作用插入磷脂雙分子層中，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)菌死亡。經(jīng)預(yù)測，天蠶素抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性，預(yù)示著在食品防腐保鮮方面具有較大的應(yīng)用空間。天蠶素抗菌肽沒有信號肽、跨膜區(qū)和糖基化位點(diǎn)；除Cecropin-A和Cecropin-C無磷酸化位點(diǎn)外，其余抗菌肽存在1～6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這對天蠶素抗菌肽的生物學(xué)功能具有重要作用。雖然利用生物信息學(xué)方法可大大降低抗菌肽的篩選或預(yù)測成本，且能得到較為滿意的結(jié)果，但仍需進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)來驗(yàn)證。本研究為深入研究天蠶素類抗菌肽的功能、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為新型抗菌肽的設(shè)計(jì)改造提供了思路。