嚴(yán)苓方，楊曉夢(mèng)，杜 娟，孫正海，普曉英，楊加珍，曾亞文

(1.云南省面向南亞?wèn)|南亞經(jīng)濟(jì)林全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)合研發(fā)中心/云南省高效經(jīng)濟(jì)林培育示范型國(guó)際科技合作基地/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650224； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650205； 3.農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650205)

大麥(HordeumvulgareL.) 是世界上最早被馴化的谷類栽培作物之一[1]，不僅是糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物和飼料作物，還是藥食同源作物[2]，對(duì)預(yù)防和治療糖尿病、高血壓、心血管疾病、慢性尿毒癥等慢性疾病有特殊功效和巨大的藥用價(jià)值[3]。因此，大麥的功能成分是當(dāng)前大麥的研究熱點(diǎn)之一。

大麥籽粒中含有豐富的必需氨基酸。其中，苯丙氨酸是人體八大必需氨基酸之一，但人和動(dòng)物自身無(wú)法合成[4]。現(xiàn)已明確大麥籽粒氨基酸含量為數(shù)量性狀，受基因型和環(huán)境共同影響[5]。農(nóng)藝措施、氣象因素及地域條件等均會(huì)影響大麥籽粒氨基酸的含量[6-7]。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大麥籽粒氨基酸的含量受胚乳三倍體基因和母體植株二倍體基因的影響[8-9]。閆新甫等[10]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二棱大麥籽粒中苯丙氨酸含量的遺傳存在直接加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并存在明顯的直接顯性效應(yīng)與環(huán)境互作。

通過(guò)構(gòu)建作圖群體挖掘數(shù)量性狀位點(diǎn)是目前大麥Q(jìng)TL研究的主要方法。前人已經(jīng)對(duì)大麥功能成分(γ-氨基丁酸[11]、蛋白質(zhì)[11]、黃酮[12]等)以及農(nóng)藝性狀(抗病性[13-14]、粒長(zhǎng)[15]、粒重[16-17]、籽粒抽穗期[16-17]、穗高[18]、穗長(zhǎng)[18]、葉面積[18]、葉寬[18]、株高[18]等)進(jìn)行了QTL定位分析，但關(guān)于大麥氨基酸QTL定位研究鮮有報(bào)道。目前僅明確了控制大麥籽粒γ-氨基丁酸含量的QTL主要分布在3H、4H、5H和7H染色體上[11]，而關(guān)于大麥苯丙氨酸含量QTL的定位，目前還未見(jiàn) 報(bào)道。

本課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)籽粒苯丙氨酸含量比較高的品種(紫光芒裸二棱)，并利用該品種構(gòu)建了重組自交系。本研究以該重組自交系為材料，測(cè)定群體及其親本籽粒的苯丙氨酸含量，并結(jié)合SSR標(biāo)記和完備區(qū)間作圖法構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，挖掘大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL，以期為大麥籽粒高苯丙氨酸含量品種篩選以及大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL精細(xì)定位和克隆轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組自交系的構(gòu)建與試驗(yàn)材料種植參考楊曉夢(mèng)等[11]的方法。親本及RIL群體193個(gè)株系種植于云南玉溪市，隨機(jī)區(qū)組排列，行長(zhǎng)1 m，行距0.3 m，每行播種100粒種子，3次重復(fù)。復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O=13∶5∶7)為基肥，施肥量為純氮120 kg·hm-2，2012年11月6日出苗，2013年1月2日追肥純氮30 kg·hm-2，其他管理同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)高產(chǎn)麥田。待植株成熟后，親本及群體株系隨機(jī)選取3株，取平均值為最終測(cè)定值。將收獲的大麥籽粒編號(hào)分裝，曬干，去掉雜質(zhì)后，用磨粉機(jī)磨細(xì)，收集粉末，低溫儲(chǔ)存，編號(hào)待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苯丙氨酸含量的測(cè)定

采用日立-L8900全自動(dòng)氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定群體及親本籽粒中苯丙氨酸的含量。

1.2.2 大麥總DNA的提取

參考孫正海等[19]的方法提取葉片基因組總DNA。以O(shè)D260/OD280比值在1.8～2.0為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用紫外分光光度計(jì)(DU-7400)對(duì)DNA的純度進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用OD260值計(jì)算DNA濃度(DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù))。

1.2.3 SSR引物來(lái)源及篩選

本試驗(yàn)所用500對(duì)SSR引物均勻覆蓋大麥基因組，引物序列來(lái)自網(wǎng)站(http://www.wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes)，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。合成的引物在兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選出的多態(tài)性引物在群體內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括上下游引物各0.5 μL、DNA 2 μL、PCR Buffer 1.5 μL、dNTPs 0.4 μL、ddH2O 4.9 μL、Taq polymerase 0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸5 min，4 ℃保存。利用8%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分離，銀染法顯色檢測(cè)。

1.2.4 SSR標(biāo)記帶型記錄

將銀染顯色的凝膠于膠片觀察燈下讀帶，用QTL IciMapping V3.3軟件記錄：帶型和母本紫光芒裸二棱一致的記作“0”，和父本Schooner一致的記作“2”，雜合帶記作“1”，缺失記作“-1”。

1.2.5 QTL定位分析

利用已構(gòu)建的大麥RILs群體的分子遺傳連鎖圖譜，用QTL IciMapping V3.3軟件中完備區(qū)間作圖法(ICIM)[20]對(duì)QTL進(jìn)行定位，LOD值≥2.5作為QTL存在的閾值，確定苯丙氨酸含量QTL在染色體上的相對(duì)位置，估算其遺傳效應(yīng)。QTL命名遵循Mccouch等[21]的原則。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體籽粒苯丙氨酸含量的表型變異

由圖1可知，RIL群體峰度值為0.77，偏度值為0.07，表明群體籽粒中苯丙氨酸含量分布為尖頂峰(右偏正態(tài)分布)，說(shuō)明群體中苯丙氨酸含量較小的株系在群體中所占比重較大，且群體中苯丙氨酸中間含量株系相對(duì)較多。群體苯丙氨酸含量平均值介于兩親本之間，父本Schooner苯丙氨酸含量為0.60 mg·g-1，表現(xiàn)為低值親本；母本紫光芒苯丙氨酸含量為1.23 mg·g-1，為高值親本。群體籽粒苯丙氨酸含量在0.59～1.24 mg·g-1之間，變異系數(shù)為 2.04%。群體均值為 0.88 mg·g-1，低于親本均值(0.92 mg·g-1)，且出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象，具數(shù)量性狀特征，適合進(jìn)行QTL定位分析。

2.2 RIL群體的遺傳連鎖圖譜

500對(duì)SSR引物中有180對(duì)可以獲得清晰且多態(tài)性好的條帶，上述標(biāo)記在群體中的分離情況基本符合1∶1的孟德?tīng)柗蛛x比例，為純合位點(diǎn)。利用180對(duì)親本間具有多態(tài)性好的引物進(jìn)行群體擴(kuò)增，構(gòu)建7個(gè)連鎖群。結(jié)果(表1和圖2)表明，遺傳連鎖圖譜總長(zhǎng)度為2 671.03 cM，平均遺傳距離為14.84 cM，其中，7H染色體覆蓋距離最長(zhǎng)，為542.89 cM，且標(biāo)記數(shù)量最多(39)，標(biāo)記間平均遺傳距離為13.92 cM；6H染色體覆蓋距離最短，為233.72 cM，且標(biāo)記數(shù)量最少(15)，標(biāo)記間平均遺傳距離為15.59 cM。

表1 分子標(biāo)記在大麥染色體上的分布Table 1 Distribution of markers on different chromosomes of barley

2.3 大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL定位結(jié)果

由表2可以看出，4個(gè)與大麥籽粒苯丙氨酸含量相關(guān)的QTL分別位于2H、4H、5H和7H染色體上，初步命名為qPHE-2H、qPHE-4H、qPHE-5H和qPHE-7H。4個(gè)QTL中，qPHE-2H和qPHE-7H為主效QTL，表型貢獻(xiàn)率均大于10%，其中，貢獻(xiàn)率最大的為qPHE-7H，位于大麥7H染色體 GMS056～GBM1297區(qū)間，表型貢獻(xiàn)率為15.45%；另一個(gè)主效QTL(qPHE-2H)位于2H染色體Scssr03381～scssr07759區(qū)間，表型貢獻(xiàn)率為12.32%。qPHE-4H、qPHE-5H為微效QTL，表型貢獻(xiàn)率為5.69%和6.96%。qPHE-2H、qPHE-5H和qPHE-7H的加性效應(yīng)均為負(fù)值，表明其增效基因來(lái)自父本Schooner，而qPHE-4的加性效應(yīng)為正值，表明增效基因來(lái)自母本紫光芒裸二棱。綜上可知，大麥籽粒苯丙氨酸含量是由主效和微效基因共同控制的數(shù)量 性狀。

表2 大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL的定位信息Table 2 Location information of QTL for phenylalanine content in barley grains

3 討 論

大麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，由大麥制成的全麥?zhǔn)称繁徽J(rèn)為是“健康食品”[22]，對(duì)預(yù)防心血管疾病和癌癥等慢性病有極其重要的作用[23]。利用RIL群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，可分析QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)，是植物QTL定位常用的作圖適宜群體。Teulat等[24]以大麥Tadmor×Er/Apm RIL群體為材料，檢測(cè)到12個(gè)控制有效分蘗、株高、穗粒數(shù)等7個(gè)農(nóng)藝性狀的QTL。游 靜[25]利用栽培大麥和中東野生大麥構(gòu)建的RIL群體為材料，檢測(cè)到14個(gè)控制粒長(zhǎng)、穗粒數(shù)、株高等農(nóng)藝性狀的QTL。楊 濤等[26]以云啤2號(hào)與大粒麥構(gòu)建的RIL群體為材料，在兩年間發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與抗性淀粉含量相關(guān)的QTL。Tamang等[27]利用Tradition×Pinnacle構(gòu)建的RIL群體為材料，在2H、3H、4H、6H和7H染色體上檢測(cè)到12個(gè)控制大麥點(diǎn)狀網(wǎng)斑病的QTL。

目前關(guān)于大麥籽粒蛋白質(zhì)含量QTL[28-31]和γ-氨基丁酸含量QTL的相關(guān)報(bào)道[11,32-33]較多，而關(guān)于大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL則未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究發(fā)現(xiàn)的4個(gè)苯丙氨酸含量QTL均為新位點(diǎn)，分別為qPHE-2H、qPHE-4H、qPHE-5H和qPHE-7H。通過(guò)與大麥參考基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)主效 QTL(qPHE-2H和qPHE-7H)區(qū)間與其對(duì)應(yīng)的物理位置有較好的一致性。進(jìn)一步對(duì)苯丙氨酸含量QTL定位區(qū)間分析發(fā)現(xiàn)，本研究在2H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(Scssr03381～scssr07759)，與郭蕾蕾[34]在2H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥抽穗期QTL(Scssr03381～MzE8b)和成熟期QTL(M3E7C～scssr07759)以及楊曉夢(mèng)等[35]在2H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥籽粒千粒重QTL(Scssr03381～scssr07759)存在相同的標(biāo)記；本研究在4H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(HVBAMMGB84～BMAG0808)與楊曉夢(mèng)等[11]在4H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥籽粒蛋白質(zhì)含量QTL(BMAG0740～BMAG0808)存在相同的標(biāo)記；本研究在5H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(Scssr03907～GBMS0032)與余春磊[36]在5H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥籽粒楊梅素含量QTL(MS002～Scssr03907)以及楊 濤[26]在5H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥籽?？剐缘矸跶TL(Scssr03907～Gm2)存在相同的標(biāo)記；本研究在7H染色體上定位到的控制大麥籽粒苯丙氨酸含量QTL(GMS056～GBM1297)與楊曉夢(mèng)等[35]在7H染色體上發(fā)現(xiàn)的控制大麥籽粒千粒重QTL(GBM1297～GMS056)存在相同的標(biāo)記。推測(cè)這些性狀可能與大麥籽粒苯丙氨酸含量之間存在關(guān)聯(lián)或存在“一因多效”現(xiàn)象?？刂拼篼溩蚜１奖彼岷康腝TL除受基因型影響之外，還受環(huán)境影響[5]。本研究?jī)H進(jìn)行了單年單點(diǎn)試驗(yàn)，下一步將進(jìn)行多年多點(diǎn)試驗(yàn)，以期獲得更準(zhǔn)確的與苯丙氨酸含量相關(guān)的QTL。