劉智慧，張 蓓

1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210023；2.徐州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇徐州 221000

卵巢癌是一種相對罕見但病死率較高的婦科惡性腫瘤，70%的卵巢癌患者就診時已處于臨床晚期。雖然大多數(shù)患者經(jīng)過初始治療可獲得臨床緩解，但仍有70%的患者在3年內(nèi)復發(fā)，5年生存率不足50%[1-3]。二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)蛋白與腫瘤細胞的增殖、侵襲等多種生物學行為和患者預后情況密切相關，因而，ARF6蛋白被認為是一種具有潛在應用價值的腫瘤診斷及預后評價因子[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌組織中ARF6蛋白高表達，且與患者預后相關[6]，但ARF6蛋白在卵巢癌中的表達及對患者預后的評價作用尚不完全清楚。華蟾毒它靈(CINO)是從中藥蟾酥中提取的丁二烯內(nèi)酯,由蟾酥制成的中成藥，如華蟾素注射液、華蟾素膠囊等對卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌均有較好療效[7-8]。國外文獻報道，超過0.5 μmol/L的CINO可抑制人卵巢癌細胞SKOV3、CRL1978和CRL11731的增殖、遷移和侵襲[9]，但其可能的作用機制，國內(nèi)外報道較少。本研究擬研究CINO抑制人卵巢癌細胞SKOV3增殖的可能機制，以期為CINO用于卵巢癌治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2017年12月于徐州市中心醫(yī)院確診的45例新發(fā)卵巢癌患者納入癌癥組，均為接受手術治療并完成標準化療的漿液性卵巢癌患者，排除合并其他惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病、免疫疾病及失訪患者，年齡26～81歲，中位年齡54歲。選取因其他生殖器官病變接受手術的45例非卵巢癌患者納入對照組，均為因子宮肌瘤、腺肌癥、宮頸病變行子宮附件切除術的患者，年齡19～83歲，中位年齡51歲。兩組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.281)。本研究經(jīng)徐州市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準后開展，所有患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 人卵巢癌細胞 SKOV3 由徐州醫(yī)科大學中心實驗室提供。ARF6蛋白多克隆抗體購自Thermo Fisher公司，批號PA5-44191；兔超敏兩步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號PV-9001；McCoy′s 5a培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司，批號12330031；胎牛血清購自Hyclone 公司，批號SH30396.03；CINO購自Med Chem Express公司，批號1108-68-5；二 甲 基 亞 砜 (DMSO)購自Aladdin 公司，批號D103277；二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平檢測試劑盒購自Beyotime 公司，批號 P0010；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自Beyotime公司，批號P0012A；ECL底物液購自南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，批號WBKLS0050。CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、MD Spectramac M3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司，Power Supplies Basic電泳儀購自美國 Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)170-4150購自美國 Bio-Rad 公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化染色檢測 所有手術切除標本固定完善，并進行石蠟包埋，制作成4 μm的連續(xù)組織切片。嚴格按免疫組化染色檢測試劑盒說明書配制成1∶100的ARF6蛋白抗體，檢測組織切片中ARF6蛋白。每張切片均在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野進行閱片。以>10%癌細胞細胞質(zhì)呈棕黃色染色為ARF6蛋白陽性的判斷標準，否則判定為陰性。以超過50%以上視野的判定結(jié)果為最終染色判斷結(jié)果。

1.3.2細胞培養(yǎng) 將人卵巢癌細胞SKOV3置于含雙抗及10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將CINO溶于DMSO中，設置0、0.5、1.0、2.0 μmol/L 4組藥物處理人卵巢癌細胞SKOV3 48 h，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.3蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測 用適量胰蛋白酶消化液消化細胞后，將其移至離心管中，加入配制好的冷裂解緩沖液振蕩離心取上清液，蛋白定量用BCA法。SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)1 h，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2.0 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次后，加入二抗(1∶8 000)，常溫孵育1 h，TBST洗滌3次后加入ECL顯色液于暗室中曝光，熒光采集圖像并分析。

1.3.4隨訪 隨訪所有患者至2020年12月30日，分析患者生存情況。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌組織與正常卵巢組織中ARF6蛋白表達差異 免疫組化檢測結(jié)果顯示，ARF6蛋白表達于細胞質(zhì)中，卵巢癌組織中ARF6蛋白的陽性表達率為53.33%(24/45)，而正常卵巢組織中ARF6蛋白的陽性表達率僅為15.56%(7/45)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。進一步分析卵巢癌的病理分級發(fā)現(xiàn)，低分化卵巢癌組織ARF6蛋白陽性率為61.10%，中高分化卵巢癌組織ARF6蛋白陽性率為48.10%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.393)。

注：A為卵巢癌組織中ARF6蛋白陽性表達；B為卵巢癌組織中ARF6蛋白陰性表達；C為正常卵巢組織中ARF6蛋白陰性表達。圖1 不同卵巢組織中ARF6蛋白的表達(×200)

2.2ARF6蛋白的表達與卵巢癌患者預后的關系 45例漿液性卵巢癌患者中，存活21例，死于腫瘤24例，3年生存率為53.33%。Kaplan-Meier生存分析顯示，ARF6蛋白陽性表達患者的生存率低于ARF6蛋白陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同ARF6蛋白表達情況患者的生存率分析

2.3不同水平CINO對人卵巢癌細胞SKOV3中ARF6蛋白表達的影響 采用0、0.5、1.0、2.0 μmol/L的CINO分別作用于人卵巢癌細胞SKOV3，各組細胞中ARF6蛋白的相對表達水平分別為0.75±0.42、0.57±0.23、0.42±0.03、0.07±0.01，ARF6蛋白表達水平隨藥物水平增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同水平CINO對人卵巢癌細胞SKOV3中ARF6蛋白表達的影響

3 討 論

蟾酥是由蟾蜍科中華大蟾蜍的干燥表皮和腺體分泌物提取，一直被認為是具有解毒、消腫、止痛等功能的中藥成分。蟾酥具有明顯抑制腫瘤的作用，CINO作為蟾酥中的活性成分，其抗腫瘤活性也是近年來的研究熱點[10]。EMAM等[11]分析了CINO對人淋巴瘤U937細胞和HeLa細胞的作用，發(fā)現(xiàn)CINO誘導了胱天蛋白酶依賴性凋亡，其研究初步揭示了CINO對細胞凋亡信號傳導的內(nèi)在和外在途徑。在固有途徑中，CINO導致基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)下降，同時釋放細胞色素c和激活caspase-3，導致DNA片段化和細胞死亡。在外源性途徑中，CINO引起了跨膜蛋白FAS的上調(diào)，從而啟動了細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，導致了死亡誘導信號復合物(DISC)的形成。DISC激活procaspase-8，導致caspase-3激活，隨后DNA斷裂，細胞死亡。

從藥用動植物中提取的化合物已成為前沿醫(yī)學研究熱點，這些化合物顯示出抗氧化、抗炎、抗增殖和誘導細胞凋亡的特性，可以使癌癥患者獲益[12-13]。CINO影響不同的癌細胞信號傳導，可能是卵巢癌的潛在治療藥物。

本研究結(jié)果表明，ARF6蛋白在漿液性卵巢癌中高表達，在不同病理分級卵巢癌組織中無明顯差異，但和患者的預后息息相關，ARF6蛋白高表達患者的預后情況較差。中藥成分CINO可以下調(diào)人卵巢癌細胞SKOV3中ARF6蛋白的表達。因此，筆者提出一種猜想：CINO抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖可能與其下調(diào)ARF6蛋白的表達有關。CINO是目前市面上廣泛用于癌癥的中藥成分，了解其作用機制對于抗癌及抑癌藥物的研發(fā)非常重要，但更為詳細的調(diào)節(jié)機制有待進一步探討。

由于組織標本庫的局限性，本研究僅選取漿液性卵巢癌進行研究，更多病理類型卵巢癌及更大樣本的卵巢癌研究數(shù)據(jù)尚需進一步探索。