王敏嬌 司家文 沈洪洲 游清玲 沈國(guó)芳

Foxc2 作為Fox 家族C 亞家族中的一員，在真核生物中十分保守。Forkhead 蛋白在調(diào)控胚胎發(fā)育、代謝、免疫、應(yīng)激反應(yīng)以及分化調(diào)控等方面均發(fā)揮了重要的作用［1］。Foxc2 初期在小鼠胚胎頭部的神經(jīng)嵴、中胚層來源的間充質(zhì)細(xì)胞以及軀干部的非脊索中胚層中廣泛表達(dá)，而后在頜面部局限表達(dá)［2］。在關(guān)鍵成骨基因過表達(dá)或敲除的小鼠中可觀察到面部發(fā)育異常，同時(shí)Foxc2 的表達(dá)也有相應(yīng)的變化［3－4］。本研究擬選取小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3?E1，通過慢病毒及siRNA 轉(zhuǎn)染改變其Foxc2 表達(dá)，明確Foxc2 的功能，并通過基因芯片技術(shù)篩查差異表達(dá)基因，探索參與相關(guān)通路的Foxc2 下游靶基因。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

MC3T3?E1 細(xì)胞（亞克隆14，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），α－MEM 培養(yǎng)基（Gibico，美國(guó)），血清（Gibico，美國(guó)），胰酶（Gibico，美國(guó)），成骨誘導(dǎo)液（Cyagen，美國(guó)），甲狀旁腺激素（Sigma，美國(guó)），辛伐他汀（Sigma，美國(guó)），慢病毒載體（上海和元生物），siRNA（上海拓然生物有限公司，中國(guó)），實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），PCR 引物（上海生工生物科技有限公司），F(xiàn)oxc2 抗體（Abcam，美國(guó)），GAPDH／Runx2 抗體（CST，美國(guó)），堿性磷酸酶顯色試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）。

熒光定量PCR 儀（ABI，美國(guó)），Odyssey 雙色紅外激光成像儀（LI－COR，美國(guó)），表達(dá)譜芯片（Agilent，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MC3T3?E1 細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

以成骨誘導(dǎo)液、甲狀旁腺激素（濃度10－8mmol／L）、辛伐他汀（濃度10－8mmol／L）誘導(dǎo)培養(yǎng)MC3T3?E1細(xì)胞。收集細(xì)胞樣品，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)Foxc2 表達(dá)水平的變化。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建Foxc2 穩(wěn)定過表達(dá)MC3T3?E1 細(xì)胞系

采用慢病毒plenti－Foxc2 及plenti－EGFP 轉(zhuǎn)染MC3T3?E1 細(xì)胞構(gòu)建MC3T3?E1Foxc2＋（實(shí)驗(yàn)組）及MC3T3?E1EGFP（對(duì)照組）。以2×105個(gè)／cm2的密度將MC3T3?E1 細(xì)胞接種于6 孔板中，次日更換為含5 μg／mL Polybrene 的無血清培養(yǎng)基。加入慢病毒感染靶細(xì)胞，感染24 h 后換成含10%FBS 的無抗生素α－MEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h 后通過嘌呤霉素篩選獲得Foxc2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.2.3 siRNA 干擾Foxc2 表達(dá)

采用siRNA 干擾技術(shù)構(gòu)建MC3T3?E1si－Foxc2（實(shí)驗(yàn)組）及MC3T3?E1si－NC（對(duì)照組）。選用Lipo2000 為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，待6 孔板內(nèi)的細(xì)胞達(dá)到80%左右，開始轉(zhuǎn)染。準(zhǔn)備兩只EP 管，A 管加入250μL Opti－MEM 和10μL 20 μmol／L 的siRNA 儲(chǔ)存液，B 管加入250μL Opti－MEM（無血清）和5μL lipo2000，然后混勻AB兩管，室溫孵育20 min，形成siRNA／lipo2000 混合液，將以上混合液加入含有細(xì)胞的1 500μL 培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育48 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他檢測(cè)步驟。

1.2.4 CCK－8 試劑盒檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，接種至96 孔板，每孔控制細(xì)胞數(shù)1 000 個(gè)左右，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)7 d。每孔加入10μL 的CCK－8 溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板使其混勻，37 ℃下孵育2 h，分別測(cè)量450 nm處每孔的光密度（OD）值。根據(jù)OD 值繪制增殖曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

周期：消化并收集兩組細(xì)胞沉淀，預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃過夜；次日再次收集細(xì)胞沉淀，PBS漂洗，以除去乙醇；調(diào)整細(xì)胞密度至1×109個(gè)／L，每個(gè)EP 管內(nèi)加入300μL PI／RNase 混勻，避光孵育15 min 后，上流式細(xì)胞儀FACStar 進(jìn)行檢測(cè)。

凋亡：細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到85%融合時(shí)，將上清培養(yǎng)液收集到離心管內(nèi)，PBS 漂洗，收集細(xì)胞沉淀于上一步的離心管內(nèi)；將細(xì)胞重懸于1×buffer 中，分別加入5μL Annexin Ⅴ－PE 和5μL 7－AAD 染劑，避光室溫孵育15 min。移入流式管，1 h 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 基因mRNA 以及蛋白表達(dá)檢測(cè)

實(shí)時(shí)定量PCR：收集細(xì)胞，無菌預(yù)冷PBS 清洗2次，Trizol 提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)。反應(yīng)體系：上下游引物各0.5μL，cDNA 模板1μL，ROX 0.5μL，SYBR 10μL，加入DEPC 水7.6μL 補(bǔ)足，共計(jì)20μL。每組樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)已檢測(cè)的Ct值即循環(huán)閾，采用ΔΔCt 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量變化（表1）。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物序列Table 1 Primer oligonucleotide sequences used for real－time PCR

Western blot：RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BAC 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取20 μg 進(jìn)行SDS－PAGE，再轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。然后加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，放入Odyssey 雙色紅外激光成像儀，掃描顯色。

1.2.7 ALP 染色

采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞，方法同1.2.1。于第7 天收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，堿性磷酸酶孵育液孵育3～6 h，PBS 漂洗，待風(fēng)干后觀察染色情況。

1.2.8 茜素紅染色

采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，每孔加入新鮮過濾的茜素紅孵育液500μL染色。掃描儀及光學(xué)顯微鏡觀察茜素紅染色情況。

1.2.9 高通量表達(dá)譜芯片及下游靶基因?qū)崟r(shí)定量PCR 初步驗(yàn)證

對(duì)MC3T3?E1Foxc2＋及MC3T3?E1EGFP細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞基因芯片檢測(cè)，主要步驟包括樣品采集及總RNA提取、總RNA 的純化和質(zhì)量控制、cDNA 的合成、熒光標(biāo)記cRNA 的合成純化和濃度測(cè)定、cRNA 樣品片段化和芯片雜交、芯片洗滌、芯片掃描、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果選定潛在下游靶基因，并通過實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，操作同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxc2 在MC3T3?E1 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)上調(diào)

在成骨誘導(dǎo)液、PTH、辛伐他汀的誘導(dǎo)后收集細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)oxc2 基因的表達(dá)水平在誘導(dǎo)初期即出現(xiàn)上調(diào)，而后緩慢回落至基線水平（圖1）。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR（A、C、E）和Western 印跡法（B、D、F）檢測(cè)成骨刺激下的Foxc2 表達(dá)變化Fig.1 Real－time PCR analysis（A，C，E） and Western blot analysis（B，D，F(xiàn)） of Foxc2 expression after osteogenic stimulation

2.2 Foxc2 在MC3T3?E1 細(xì)胞株實(shí)現(xiàn)持續(xù)高表達(dá)

通過慢病毒轉(zhuǎn)染，嘌呤霉素篩選培養(yǎng)MC3T3?E1Foxc2＋細(xì)胞株及MC3T3?E1EGFP細(xì)胞株，共聚焦顯微鏡檢測(cè)到FITC 綠色熒光。繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，MC3T3?E1Foxc2＋組Foxc2 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)超過80 倍（P＜0.05）；Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，MC3T3－E1Foxc2＋組出現(xiàn)過表達(dá)目的條帶。上述結(jié)果提示，慢病毒成功轉(zhuǎn)染MC3T3?E1 細(xì)胞并有效表達(dá)（圖2）。

2.3 Foxc2 過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖

如圖3 所示，兩組細(xì)胞增殖活性初期無明顯差異；第4 天時(shí)，MC3T3?E1Foxc2＋細(xì)胞增殖活性降低，其在450 nm 處的OD 值小于MC3T3?E1EGFP細(xì)胞，而后差異逐漸增大，D4～D7 的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀分析顯示兩組細(xì)胞凋亡無明顯差異。通過各周期細(xì)胞比例分析，MC3T3?E1Foxc2＋組的G1 期細(xì)胞比例增加，S 期和G2／M 期的細(xì)胞比例降低，其中G1 期細(xì)胞比例變化差異顯著（P＜0.05）。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染后兩組MC3T3?E1 細(xì)胞增殖情況Fig.3 Proliferation of MC3T3?E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.4 Foxc2 過表達(dá)促進(jìn)MC3T3?E1 細(xì)胞成骨向分化

成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)組的Runx2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。誘導(dǎo)至第7 天時(shí)進(jìn)行ALP 染 色，兩組細(xì)胞均有著色，符合MC3 T3?E1 細(xì)胞的特性，對(duì)比發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Foxc2 的實(shí)驗(yàn)組染色較深且著色細(xì)胞較多。第21 天時(shí)，茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，兩組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)（圖4）。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后兩組MC3T3?E1 細(xì)胞成骨分化觀察Fig.4 Osteogenesis of MC3T3?E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.5 siRNA 干擾Foxc2 表達(dá)，反向驗(yàn)證基因功能

提取siRNA 干擾MC3T3?E1 的細(xì)胞樣品，實(shí)驗(yàn)組的Foxc2 的mRNA 及蛋白表達(dá)均減低，提示Foxc2－siRNA 成功轉(zhuǎn)染。Foxc2 的表達(dá)水平降低后，可以觀察到細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組有所提高，Runx2 的蛋白表達(dá)水平均有所下降，且ALP 染色變淺（圖5）。

圖5 Foxc2－siRNA 對(duì)MC3T3?E1 細(xì)胞的作用Fig.5 Effect of Foxc2－siRNA on MC3T3?E1 cells

2.6 基因芯片初步篩選下游靶基因并初步驗(yàn)證

MC3T3?E1Foxc2＋細(xì)胞與MC3T3?E1EGFP組差異表達(dá)的基因有1 234 條，其中上調(diào)基因950 條，下調(diào)基因284 條。將差異表達(dá)的基因帶入KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析，顯示有25%的差異基因參與了細(xì)胞因子間的受體相互作用。選取MMP9、MMP13、EREG基因作為研究目標(biāo)，并通過實(shí)時(shí)定量PCR 成功驗(yàn)證芯片結(jié)果（圖6、7）。

圖6 GO 分析和KEGG 通路分析Fig.6 GO analysis and KEGG pathway analysis

圖7 實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證芯片結(jié)果Fig.7 Real－time PCR verification of gene chip results

3 討論

Foxc2 蛋白在人和小鼠兩種種屬間呈高度保守狀態(tài)，參與了機(jī)體的眾多生理過程。如果使用非特異基因敲除方法獲得Foxc2 基因敲除小鼠，大多數(shù)的Foxc2－／－小鼠胚胎會(huì)在出生前死亡，少數(shù)可以出生，但存在明顯發(fā)育缺陷，如主動(dòng)脈弓離斷、顱頜面骨缺損等，在口腔頜面部主要表現(xiàn)為正中腭裂、軟腭缺失、上頜骨和蝶骨大翼發(fā)育不全及位置轉(zhuǎn)移等［2，5］。淋巴水腫－重睫綜合征（Lymphedema－distichiasis syndrome，LDS）是一種常染色體顯性遺傳病，人Foxc2 基因突變是導(dǎo)致LDS 的重要原因，LDS 常同時(shí)伴發(fā)椎骨畸形、硬膜外囊腫、上瞼下垂、腭裂等癥狀，提示Foxc2 基因與人顱頜面發(fā)育密切相關(guān)［6－7］。Foxc2 同樣影響人體脂代謝與骨改建，Yamada 等［8］于2006 年針對(duì)日本老年人群的研究指出，絕經(jīng)后女性的橈骨遠(yuǎn)端以及整個(gè)機(jī)體的骨密度水平與Foxc2 的基因多態(tài)性明顯相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣驗(yàn)證了Foxc2 的功能：在小鼠肥胖－骨形成異常模型中可以發(fā)現(xiàn)Foxc2 表達(dá)水平在病變小鼠的白色脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)下調(diào)，同時(shí)病變小鼠的骨形成出現(xiàn)障礙［9］。上述研究均提示Foxc2 參與了顱頜面軟硬組織發(fā)育過程及機(jī)體骨形成過程。

近些年關(guān)于Foxc2 功能的多項(xiàng)體外研究顯示，在多種成骨誘導(dǎo)因子培養(yǎng)下，多種具有分化潛能的前體細(xì)胞內(nèi)的Foxc2 表達(dá)水平顯著升高［10－14］。本課題組前期研究表明，成骨誘導(dǎo)后的羊水干細(xì)胞中可檢測(cè)到Foxc2 的高表達(dá)，初步證實(shí)了Foxc2 基因的過表達(dá)可抑制C3H10T1／2 細(xì)胞增殖；上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2 的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞成骨向分化并抑制脂向分化［15］。但是，關(guān)于Foxc2 在成骨分化過程中的作用仍需繼續(xù)研究。

Kim 等［16］指出，F(xiàn)oxc2 維持β－catenin 的活性，刺激TCF／LEF 轉(zhuǎn)錄活性，激活經(jīng)典的Wnt－βcatenin 通路，同時(shí)cAMP－PKA 途徑也參與其中。Gozo 等［17］提出，持續(xù)高表達(dá)的Foxc2 將促進(jìn)前成肌細(xì)胞C2C12 成骨向分化的趨勢(shì)，其主要機(jī)制在于Foxc2 直接作用于Wnt4 啟動(dòng)子區(qū)域，可激活Wnt4和BMP4 信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞成肌分化并轉(zhuǎn)為骨向分化。Hsu 等［18］通過CRISPR 技術(shù)激活BMSC的內(nèi)源性Wnt10b 及Foxc2 的共表達(dá)，可促進(jìn)其骨向分化。Park 等［19］提出，F(xiàn)oxc2 的表達(dá)水平在骨代謝因子（甲狀旁腺激素／BMP2）的刺激下出現(xiàn)上調(diào)，并且存在劑量表達(dá)相關(guān)效應(yīng)。過表達(dá)Foxc2 可以刺激整合素β1 的表達(dá)，整合素β1 直接結(jié)合到Forkhead結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)子上，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。

本研究中，首先采用多種成骨誘導(dǎo)因子作用于MC3T3?E1 細(xì)胞［20］，觀測(cè)到Foxc2 的表達(dá)水平在細(xì)胞成骨分化過程中出現(xiàn)上調(diào)，而后逐步回落。成骨刺激作用較強(qiáng)的因子，如PTH，更易使Foxc2 在刺激的早期即出現(xiàn)上調(diào)。后續(xù)體外研究，通過設(shè)計(jì)慢病毒及siRNA 改變Foxc2 在MC3T3?E1 細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而檢測(cè)Foxc2 對(duì)細(xì)胞增殖活性、凋亡、周期以及分化能力的影響。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，F(xiàn)oxc2 抑制MC3T3?E1 細(xì)胞的增殖活性，增加了G1 期細(xì)胞比例。G1 期細(xì)胞主要是增加質(zhì)量且為后續(xù)的DNA 復(fù)制做好準(zhǔn)備，F(xiàn)oxc 過表達(dá)使得細(xì)胞阻滯在G1 期，無法進(jìn)行后續(xù)S 期及G2 期的DNA 復(fù)制加倍，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低。在分化能力的觀察中，首先成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2 的表達(dá)水平在MC3T3?E1Foxc2＋組出現(xiàn)明顯上調(diào)，第7 天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，MC3T3?E1Foxc2＋組ALP 染色較深，光學(xué)顯微鏡下著色細(xì)胞較多。第21 天，茜素紅染色實(shí)驗(yàn)中，兩組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)，此時(shí)兩組無明顯差異。siRNA 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了Foxc2 對(duì)MC3T3?E1 細(xì)胞體外骨向分化的影響。第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們觀測(cè)到Foxc2 的上調(diào)都出現(xiàn)在骨向誘導(dǎo)的早期，而后表達(dá)下調(diào)，逐漸回落甚至低于基線水平，提示Foxc2 在細(xì)胞成骨分化過程中仍受到其他負(fù)性因子的調(diào)控，故在培養(yǎng)第21 天，即成骨后期的茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)實(shí)驗(yàn)中，兩組細(xì)胞無明顯差異。收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3天的MC3T3?E1Foxc2＋細(xì)胞及MC3T3?E1EGFP細(xì)胞樣品，通過基因芯片進(jìn)一步分析篩選下游靶基因，結(jié)果兩組差異表達(dá)的基因共計(jì)1 234 條，其中上調(diào)950 條基因，下調(diào)基因284 條。將差異表達(dá)的基因?qū)霐?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析，25%的差異基因參與了細(xì)胞因子間的受體相互作用，17%的差異基因參與了趨化因子信號(hào)通路，同樣有17%的差異基因參與了細(xì)胞黏附分子通路（CAMs）。查閱文獻(xiàn)，結(jié)合芯片結(jié)果，初步選取數(shù)個(gè)差異基因，如MMP家族、EREG 等。MMP 家族已經(jīng)被證實(shí)在骨骼的發(fā)育中起著重要作用［21］，主要參與軟骨細(xì)胞的增殖分化、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的募集、骨形成與改建等進(jìn)程，MMP 功能的轉(zhuǎn)變同樣會(huì)影響骨質(zhì)的形成。研究表明，EREG 可以與ERER 受體結(jié)合形成二聚體，通過激活A(yù)KT－ mTOR 通路及MAPK 通路促進(jìn)MC3T3?E1 細(xì)胞骨向分化［22］。關(guān)于MMP9、MMP13及EREG 基因的實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果也初步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果，為后續(xù)的研究提供了方向。

綜上所述，本研究探討了Foxc2 基因?qū)C3T3－E1 細(xì)胞體外骨向分化的影響，初步證明Foxc2 基因負(fù)向調(diào)控MC3T3?E1 細(xì)胞增殖活性，同時(shí)正向促進(jìn)Runx2 表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞體外骨向分化。本課題利用基因芯片進(jìn)行篩選，查閱文獻(xiàn)并結(jié)合數(shù)據(jù)分析，通過實(shí)時(shí)定量PCR 初步驗(yàn)證了數(shù)個(gè)差異基因，如Mmp9、Ereg 等，后續(xù)研究將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)展開，明確其下游機(jī)制。