李燦嬰 ，侯佳寶 ，張 浪 ，蔣超男 ，葛永紅

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

0 引言

南果梨是遼寧省極具地方特色的秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim）品種，果實(shí)色澤鮮艷，風(fēng)味宜人，素有“梨中之王”的美稱［1-2］。新鮮采收的南果梨果實(shí)堅(jiān)硬，口感較差，缺乏獨(dú)特的香味，后熟后充分顯露出果實(shí)的口感、風(fēng)味和色澤。南果梨成熟時(shí)間一般集中于9月上、中旬，常溫下貯藏壽命較短，由于水分流失、果肉褐變、果實(shí)軟化等原因，南果梨果實(shí)的品質(zhì)受到嚴(yán)重影響［3］。低溫（0±0.5） ℃貯藏通常用于延長南果梨的貨架期，但長期冷藏會(huì)降低果實(shí)品質(zhì)并導(dǎo)致冷害癥狀，如失去特有的風(fēng)味、果皮和果肉褐變［4］。因此，研究和開發(fā)南果梨綠色防腐保鮮技術(shù)迫在眉睫。

目前，南果梨果實(shí)的貯藏保鮮研究多運(yùn)用氣調(diào)、低溫、1-甲基環(huán)丙烯、二氫茉莉酸丙酯、涂膜保鮮、氣調(diào)貯藏等方法［5-11］。甜菜堿是一類季胺型生物堿，是植物細(xì)胞內(nèi)最重要的非毒性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對(duì)細(xì)菌、真菌、藻類、植物、動(dòng)物和人類等生物的滲透調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，具有穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)和生物膜系統(tǒng)的完整性、維持細(xì)胞滲透平衡、保持蛋白質(zhì)和代謝酶的活性、緩解氧化脅迫損傷等多種生理功能［12］。研究表明，外源甜菜堿處理能夠提高番木瓜、枇杷、桃、黃瓜、西葫蘆、山楂等果實(shí)的抗冷能力，且抑制冷害的發(fā)生與激活體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活性和保護(hù)膜完整性有關(guān)［13-17］。甜菜堿誘導(dǎo)處理能提高Pichia caribbica對(duì)蘋果灰霉病的控制效果，提高果實(shí)抗氧化酶的活性［18］。此外，甜菜堿處理還能夠提高桃果實(shí)可溶性固形物、總酚和抗壞血酸含量［19］；有效減輕香椿嫩芽的失重率和腐爛，抑制呼吸強(qiáng)度，同時(shí)減緩葉綠素、抗壞血酸和總黃酮含量的損失［20］。已有研究表明，甜菜堿能夠提高果實(shí)抗冷能力減輕冷害現(xiàn)象［21］，保持果實(shí)良好的采后品質(zhì)。植物在受到脅迫時(shí)，通過在細(xì)胞質(zhì)中大量積累甜菜堿來調(diào)節(jié)滲透壓，從而維持細(xì)胞的水分平衡［22］。然而，有關(guān)采后甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)貯藏品質(zhì)及果實(shí)軟化的影響尚未見報(bào)道。

本研究以南果梨果實(shí)為試材，研究采后不同濃度的甜菜堿處理對(duì)果實(shí)貯藏品質(zhì)的影響，同時(shí)探討其對(duì)果實(shí)果膠物質(zhì)代謝相關(guān)酶活性的影響，以期為甜菜堿在南果梨果實(shí)采后貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南果梨果實(shí)采自錦州市北鎮(zhèn)市羅羅堡鎮(zhèn)，八成熟時(shí)采收，然后用紙箱包裝（60個(gè)/箱），運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在（20±1）℃，相對(duì)濕度30%～40%下貯藏待用。

甜菜堿（純度98%，山東西亞化學(xué)股份有限公司）；果膠（純度74%，北京索萊寶科技有限公司）；3，5-二硝基水楊酸（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；三（羥甲基）氨基甲烷（分析純，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

H1650R型小型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）；UV-1801型紫外分光光度計(jì)（北京北分瑞麗分析儀器集團(tuán)）；Check Point Ⅱ便攜式CO2/O2測(cè)定儀（丹麥PBI-Dansensor公司）；LX-A型硬度計(jì)（北京沃威科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜菜堿處理

挑選大小一致、顏色均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害的南果梨果實(shí)，用1%次氯酸鈉溶液消毒1 min，清水沖洗后將果實(shí)分為4份，3份分別用5、10和 20 mmol/L甜菜堿溶液（含 0.1%Tween 20）浸泡果實(shí)10 min，1份用等量蒸餾水（內(nèi)含0.1%Tween 20）處理并作為對(duì)照。室溫晾干后分別裝入PE塑料袋并置于干凈的紙箱中，于20±1 ℃貯藏（30%～40% RH）。

1.3.2 呼吸速率和失重率測(cè)定

呼吸速率和失重率的測(cè)定參照葛永紅等［22］方法并修改。分別于處理后第0、2、4、6、8、10、12 d取甜菜堿和清水處理果實(shí)30個(gè)，分別稱重后放入3個(gè)密封袋中常溫靜置1 h，然后用Check Point Ⅱ便攜式CO2/O2測(cè)定儀測(cè)定剩余O2的體積。呼吸速率用mL O2/（h·kg）表示。將甜菜堿和清水處理南果梨果實(shí)第0 d的重量視為原始重量，并于處理后第 2、4、6、8、10、12 d 分別稱量兩組處理的果實(shí)重量，記為每次稱重量。

失重率（%）=（原始重量-每次稱重量）

×100/原始重量。

根據(jù)果實(shí)的呼吸速率和失重率的變化差異篩選最佳濃度用于后續(xù)研究。

1.3.3 取樣

根據(jù)上述結(jié)果篩選的甜菜堿濃度和清水各處理南果梨果實(shí)210個(gè)，參照GE等［23］方法并修改。分別于處理后第 0、2、4、6、8、10、12 d，取南果梨果實(shí)赤道部位皮下2～5 mm的果肉組織約3.0 g，切成小塊后，用液氮快速冷凍，用錫箔紙包好后貯藏在-80 ℃冰箱中待用。每次取樣用果實(shí)15個(gè)。

1.3.4 果肉硬度、可溶性固形物含量和可滴定酸測(cè)定

果肉硬度和可溶性固形物含量測(cè)定參照曹建康等［24］方法并修改。每次取15個(gè)甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)，削去陰陽面中環(huán)部位約1～2 mm的果皮，用LX-A型硬度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，單位用kg/cm2表示。削取赤道部位陰陽面果實(shí)（約1～2 mm厚）的果肉，用阿貝折光儀測(cè)定可溶性固形物含量，用%表示。

可滴定酸測(cè)定參照陳松江等［25］方法并修改。取處理和對(duì)照果肉樣品10.0 g，用液氮處理后研磨成粉末并用蒸餾水轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，沖洗研缽2～3次，合并勻漿，用蒸餾水定容至刻度并搖勻，靜置20 min后過濾。濾液用0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行酸堿滴定，記錄NaOH的用量。

總酸度（%）=cVK×1 000/m

式中 c——已標(biāo)定NaOH溶液濃度，mol/L；

V——滴定消耗NaOH溶液體積，mL；

m——南果梨果實(shí)樣品質(zhì)量，g；

K——換算為0.067 g/mmol蘋果酸的系數(shù)。

1.3.5 多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲基酯酶（PME）活性

參照楊志敏等［26］方法。反應(yīng)混合液為1.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH值為5.5）、0.5 mL密度為10g/L的底物（PG底物為多聚半乳糖醛酸，PME底物為果膠），在37 ℃預(yù)熱5 min后，將0.5 mL酶提取液添加到一個(gè)試管中，并將滅活酶溶液加到另一個(gè)試管中作為對(duì)照。混合搖勻后，在37 ℃的水浴中保溫1 min后再加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），在沸水浴中煮沸5 min，迅速冷卻至室溫，并通過DNS法在540 nm處測(cè)定。以1 mL酶液1 min催化底物產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）和果膠甲基反式消除酶（PMTE）活性測(cè)定

參照楊志敏等方法。取兩個(gè)試管，依次加入pH值為9.0，濃度為50 mmol/L的4.0 mL Gly-NaOH 緩沖液、3.0 mmol/L 的 1.0 mL CaCl2、1.0 g/L的300 μL多聚半乳糖醛酸或果膠。在30 ℃預(yù)保溫5 min，然后加入100 μL酶溶液至試管中，立即測(cè)定232 nm處反應(yīng)混合物的吸光度；加入100 μL酶溶液到另一個(gè)試管中，并在30 ℃保溫10 min，冷卻后在232 nm處測(cè)定吸光度。PGTE和PMTE活性以每分鐘每克組織在酶促反應(yīng)下催化底物釋放1 μmol不飽和醛酸反應(yīng)量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)測(cè)定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行LSD分析（p<0.05），采用Microsoft Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)失重率的影響

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，不同濃度甜菜堿處理和對(duì)照南果梨果實(shí)失重率逐漸增大，5、10、20 mmol/L的甜菜堿處理果實(shí)的失重率始終低于對(duì)照組，其中以5 mmol/L甜菜堿處理果實(shí)的失重率最低，在貯藏第4～12 d顯著低于對(duì)照果實(shí)。

圖1 不同濃度甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)失重率的影響Fig.1 Effects of post-harvest glycine betaine treatment at different concentrations on the weight loss of Nanguo pears

2.2 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)呼吸速率的影響

由圖2可知，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照和甜菜堿處理果實(shí)呼吸速率整體呈先上升后下降趨勢(shì)，在貯藏第10 d出現(xiàn)呼吸高峰。10和20 mmol/L甜菜堿處理果實(shí)呼吸速率始終高于對(duì)照組，5 mmol/L甜菜堿處理果實(shí)的呼吸速率在貯藏第8～12 d顯著低于對(duì)照組，并且呼吸峰值為對(duì)照的90%。結(jié)合呼吸速率和失重率的變化趨勢(shì)可知，5 mmol/L甜菜堿處理顯著抑制了呼吸速率和失重率的增加，并在一定程度上延緩了果實(shí)的衰老。因此，選擇5 mmol/L甜菜堿處理進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

圖2 不同濃度甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)呼吸速率的影響Fig.2 Effects of glycine betaine treatment at different concentrations on the respiration rate of Nanguo pears

2.3 甜菜堿處理對(duì)南果梨果肉硬度的影響

果肉硬度是果實(shí)主要的品質(zhì)指標(biāo)，影響果實(shí)的口感。如圖3，隨著貯藏時(shí)間的延長，甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)果肉硬度均呈逐漸下降的趨勢(shì)，但甜菜堿處理在貯藏第6～12 d顯著延緩了果肉硬度的下降。在貯藏第10 d和12 d，甜菜堿處理果肉硬度分別是對(duì)照的1.24倍和1.40倍。

圖3 甜菜堿處理對(duì)南果梨果肉硬度的影響Fig.3 Effects of glycine betaine treatment on the flesh hardness of Nanguo pears

2.4 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)可滴定酸的影響

可滴定酸主要是果實(shí)中的有機(jī)酸，影響果實(shí)品質(zhì)和貯藏性。由圖4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，甜菜堿處理和對(duì)照南果梨果實(shí)中的可滴定酸總體呈先升后降趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏過程中，甜菜堿處理果實(shí)中的可滴定酸始終高于對(duì)照組，但二者之間沒有顯著性差異。

圖4 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)可滴定酸的影響Fig.4 Effects of glycine betaine treatment on the titratable acid of Nanguo pears

2.5 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)可溶性固形物含量的影響

由圖5可知，甜菜堿處理和對(duì)照組南果梨果實(shí)可溶性固形物含量總體呈上升趨勢(shì)，且變化趨勢(shì)基本一致。貯藏第0～10 d，對(duì)照和甜菜堿處理組果實(shí)的可溶性固形物含量上升，在第10 d達(dá)到最大，然后開始下降。在整個(gè)貯藏期間，甜菜堿處理果實(shí)的可溶性固形物含量始終低于對(duì)照組，但二者沒有顯著的差異。

圖5 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)可溶性固形物含量的影響Fig.5 Effects of glycine betaine treatment on the soluble solids content of Nanguo pears

2.6 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)PME和PG活性的影響

由圖6（a）可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)PME活性呈相同的變化趨勢(shì)，貯藏第0～8 d升高，第8～12 d下降，在整個(gè)貯藏期間處理果實(shí)PME活性始終低于對(duì)照組，并且在貯藏第6、8和12 d顯著低于對(duì)照。

圖6 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)PME和PG活性的影響Fig.6 Effects of glycine betaine treatment on the activities of pectin methylesterase and polygalacturonase of Nanguo pears

由圖6（b）可知，整個(gè)貯藏過程中，甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)PG活性總體呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。貯藏第0～6 d，對(duì)照和甜菜堿處理果實(shí)PG活性呈上升趨勢(shì)；第6～12 d，PG活性逐漸降低。在整個(gè)貯藏期間，甜菜堿處理果實(shí)的PG活性始終低于對(duì)照，并且在貯藏第4～12 d二者差異顯著。貯藏第8、10和12 d，對(duì)照果實(shí)PG活性分別是甜菜堿處理果實(shí)的1.28、1.36和1.70倍。

2.7 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)PMTE和PGTE活性的影響

PMTE和PGTE是兩種重要的果膠裂解酶，與采后果實(shí)的軟化密切相關(guān)。由圖7（a）可知，整個(gè)貯藏過程中，甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)PMTE活性呈先升高后緩慢下降的變化趨勢(shì)，并且甜菜堿處理果實(shí)PMTE活性始終低于對(duì)照組，在貯藏第4～6 d差異顯著。對(duì)照和處理果實(shí)PMTE活性在貯藏第6 d達(dá)到最大，對(duì)照果實(shí)PMTE活性是處理果實(shí)的1.19倍。

圖7 甜菜堿處理對(duì)南果梨果實(shí)PMTE和PGTE活性的影響Fig.7 Effects of glycine betaine treatment on the activities of pectin methyl-trans-eliminase and polygalacturonic acid trans-eliminase of Nanguo pears

如圖7（b），隨著貯藏時(shí)間的延長，甜菜堿處理果實(shí)PGTE活性始終低于對(duì)照果實(shí)，二者均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。貯藏第0～4 d，甜菜堿處理和對(duì)照果實(shí)PGTE活性急劇升高，在第6 d達(dá)到最大，從第6 d開始，二者均開始下降。在貯藏第 4、8、10和 12 d，甜菜堿處理果實(shí) PGTE 活性顯著低于對(duì)照果實(shí)，分別是對(duì)照果實(shí)的81.1%、87.4%、82.5%和74.8%。

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甜菜堿處理能夠有效降低南果梨果實(shí)的失重率、抑制呼吸速率，并且顯著降低呼吸高峰值。研究發(fā)現(xiàn)，苯并噻重氮處理能夠顯著抑制南果梨果實(shí)呼吸速率的升高和失重率的增加，并保持較好的品質(zhì)。由此表明，采后安全化學(xué)藥物處理通過抑制呼吸速率和失重來保持果實(shí)的品質(zhì)。果實(shí)的硬度、可溶性固形物含量和可滴定酸是衡量果實(shí)貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)。果實(shí)硬度的下降主要由失水和果膠物質(zhì)降解等引起。于冠年［27］研究發(fā)現(xiàn)，采后1-MCP處理明顯延緩南果梨果實(shí)果肉的硬度下降，抑制可溶性固形物含量的上升和可滴定酸的下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甜菜堿處理有效抑制了南果梨果肉硬度和可滴定酸的下降；但可溶性固形物含量變化與前人研究結(jié)果有所差異，主要是因?yàn)樘鸩藟A延緩了南果梨果實(shí)后熟過程中淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖。

PG和PME是參與細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶，PG將多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體；PME能作用于果膠，脫去甲氧基生成低甲氧基果膠；PGTE和PMTE屬于果膠裂解酶，PGTE裂解果膠酸分子中的 α-1，4糖苷鍵，而PMTE降解細(xì)胞壁中的果膠或甲酯化的多聚半乳糖醛酸［28］。程園等［29］研究發(fā)現(xiàn)，硝普鈉處理能夠抑制南果梨果實(shí)PG、PME、PGTE和PMTE活性的升高，有效延緩南果梨果實(shí)的軟化。本研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿處理顯著抑制了南果梨果實(shí)PG、PGTE、PME 和PMTE 活性的升高。由此表明，外源甜菜堿處理延緩果實(shí)的軟化與其抑制果膠物質(zhì)降解酶活性密切相關(guān)。

綜上所述，外源甜菜堿處理能夠顯著抑制南果梨果實(shí)呼吸高峰值，并保持硬度，延緩失重率的增加，抑制可滴定酸的下降和可溶性固形物含量的升高，并且甜菜堿處理保持果實(shí)的品質(zhì)與其抑制細(xì)胞壁降解酶活性有關(guān)。