徐文剛，劉立明，王九龍，于文松，孫明，征矢野清，唐永政*

(1.煙臺(tái)大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264003；3.山東海洋現(xiàn)代漁業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264003；4.長(zhǎng)崎大學(xué) 環(huán)東シナ海環(huán)境資源研究センター，日本 長(zhǎng)崎 851-2213)

大多數(shù)雌雄同體的魚類一生中要經(jīng)過(guò)性腺分化、卵原細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞發(fā)育、性成熟和性逆轉(zhuǎn)階段[8]，而性腺分化作為其中一個(gè)關(guān)鍵階段，研究者已開展了一些相關(guān)研究和報(bào)道，如利用外源17α-甲基睪酮誘導(dǎo)赤點(diǎn)石斑魚[9]和褐石斑魚E.bruneus[10]幼魚性腺分化為雄性。近期的研究表明，赤點(diǎn)石斑魚的性細(xì)胞起源于胚胎時(shí)期的原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)，PGCs分裂和分化并遷移到生殖脊后共同形成原始性腺，原始性腺發(fā)育至一定階段后開始加速有絲分裂，形成卵巢[5,11]。但在石斑魚性腺分化階段，有關(guān)其內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少。

硬骨魚類生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)分泌系統(tǒng)受到下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG軸)的調(diào)節(jié)。魚類受到光照和水溫等環(huán)境因子的刺激后，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)誘導(dǎo)垂體合成分泌促性腺激素(gonadotropins, GtHs)。GtHs中的促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)隨血液到達(dá)性腺并促進(jìn)性腺合成性類固醇激素(雌、雄激素)，從而促進(jìn)魚類性腺分化及性腺發(fā)育與成熟[12-13]。研究表明，F(xiàn)SH和LH是非共價(jià)結(jié)合的糖蛋白，由一個(gè)共同的α亞基和具有特異性的β亞基組成異源二聚體，這表明其具有生物學(xué)特異性[14]。對(duì)鮭Oncorhynchus[15-18]、星康吉鰻Congermyriaster[19]、日本鰻鱺Anguillajaponica[20]和歐洲鱸Dicentrarchuslabrax[21]的研究表明，F(xiàn)SHβ對(duì)性腺早期發(fā)育(如精子和卵子的生長(zhǎng))具有重要影響，LHβ主要調(diào)控性腺發(fā)育的成熟階段如排卵和排精等行為。而對(duì)蜂巢石斑魚E.merra的研究表明，F(xiàn)SHβ作為一種潛在的雄激素能夠誘導(dǎo)雌性逆轉(zhuǎn)為雄性[22]。以上研究表明，F(xiàn)SHβ和LHβ對(duì)魚類性腺生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟具有重要作用。然而在石斑魚性腺分化階段，有關(guān)其FSHβ和LHβ的角色和功能僅在點(diǎn)帶石斑魚E.malabaricus中運(yùn)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)和分子生物學(xué)(qRT-PCR)技術(shù)的研究中有少量報(bào)道[23]。本試驗(yàn)中，以日本較具代表性的經(jīng)濟(jì)魚類赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚為研究對(duì)象，運(yùn)用蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)和qRT-PCR技術(shù)，對(duì)兩種魚類性腺分化前后腦垂體中的FSHβ和LHβ細(xì)胞進(jìn)行免疫識(shí)別定位研究，并測(cè)定其腦垂體中fshβ和lhβ基因含量，探討FSHβ和LHβ在其性腺分化過(guò)程中的角色，以期為未來(lái)石斑魚在中國(guó)的人工繁殖和苗種生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年6月在日本山口縣水產(chǎn)研究所和東京都小笠原水產(chǎn)研究所分別對(duì)赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚親魚進(jìn)行培育、催產(chǎn)、人工授精和魚苗培育。育苗期間，用水先經(jīng)沉淀沙濾，再用58 μm篩絹過(guò)濾。育苗池水溫為23～28 ℃，鹽度為29～31，pH為7.9～8.3，溶解氧為5 mg/L以上，保持24 h增氧。育苗池上方用布簾調(diào)節(jié)光照，避免陽(yáng)光直射。

飼養(yǎng)期間，每日早晚各投喂一次。仔魚孵化后3日左右開始開口攝食，投喂體長(zhǎng)為100 μm的SS型輪蟲(日清丸紅飼料, 日本)，直至12日齡，保持水體中餌料密度為25～35 ind./mL；12～30日齡的仔魚投喂體長(zhǎng)為200 μm的L型輪蟲，保持水體中餌料密度為5～15 ind./mL；30～50日齡的仔魚投喂配合飼料Ohitome B1(日清丸紅飼料, 日本)；50～120日齡的稚魚投喂配合飼料Ohitome C2。

1.2 方法

1.2.1 性腺和腦樣品組織的采集 分別取孵化后55、80、120日齡的赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚幼魚用于試驗(yàn)，每次采樣數(shù)量各12尾。將幼魚用2-苯氧乙醇麻醉后測(cè)量其體長(zhǎng)和體質(zhì)量，然后解剖采樣。性腺的采集中，由于幼魚的性腺太小，肉眼無(wú)法識(shí)別，故將55日齡幼魚體腔的后半部全部固定在波恩試劑中；80和120日齡的幼魚，去除體腔后半部的肌肉后將性腺連同內(nèi)臟一起固定在波恩試劑中，用于性腺組織學(xué)觀察。腦的采集中，取6尾55日齡幼魚的頭部整個(gè)固定在波恩試劑中，各取6尾80、120日齡幼魚的頭蓋骨去除外骨骼后，將腦和腦垂體連同部分骨骼一同固定在波恩試劑中，用于腦垂體組織學(xué)及免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。固定在波恩試劑中的樣品24～48 h后均需轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中保存，用于試驗(yàn)。再分別另取6尾55、80、120日齡幼魚的腦垂體保存在RNAlater試劑(Ambion Inc., Invitrogen Life Technologies, Japan)中于4 ℃下低溫保存，一周后廢棄RNAlater，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存，用于分子生物學(xué)試驗(yàn)。

1.2.2 切片的制備和組織學(xué)試驗(yàn) 將保存在體積分?jǐn)?shù)70%酒精中的體腔、頭部和頭蓋骨用EDTA脫鈣液脫鈣，對(duì)脫鈣樣品進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。體腔切片采用蘇木精-伊紅(H.E.)染色、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡(Olympus FX380型)下觀察并拍照。頭部和頭蓋骨切片用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[24-26]中的方法對(duì)性腺發(fā)育進(jìn)行分期并描述如下：

1)性腺未分化階段(undifferentiated gonadal stage, Ug)。生殖脊(gential ridge, Gr)在胚胎階段由中胚層的體細(xì)胞發(fā)育而成，位于背腸系膜兩側(cè)的腹腔壁膜上。原始生殖細(xì)胞(PGCs)在胚胎發(fā)育過(guò)程中遷移至生殖脊中形成性腺原基。性腺原基成對(duì)出現(xiàn)，由腸系膜連接且位于腸道附近，含有性原細(xì)胞和血管。

中藥產(chǎn)業(yè)具有衛(wèi)生資源、經(jīng)濟(jì)資源、科技資源、文化資源和生態(tài)資源5大資源優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有傳統(tǒng)和現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)的特點(diǎn)。從傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)看，中藥產(chǎn)業(yè)是中醫(yī)藥體系中不可分割的一部分，其產(chǎn)業(yè)特征與化學(xué)制藥具有明顯的不同，中藥產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)，依賴自然資源、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和氣候條件，且地域性強(qiáng)[7]。從現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)看，中藥產(chǎn)業(yè)是以中藥農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)、中藥工業(yè)為核心、中藥商業(yè)為紐帶、中藥知識(shí)業(yè)為動(dòng)力的完整產(chǎn)業(yè)體系，目前各環(huán)節(jié)日益規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化，逐步脫離自然經(jīng)濟(jì)的特征。

2)性腺分化階段(differentiated gonadal stage, Dg)。性腺原基兩端的結(jié)締組織向前延伸并形成突起，但兩端突起部位尚未完全連接在一起，表明性腺分化正在進(jìn)行，卵巢腔正在形成。

3)卵巢階段(ovarian stage, Ov)。性腺原基兩端的突起完全連接在一起，卵巢腔已經(jīng)形成，卵原細(xì)胞開始出現(xiàn)，具有較大的細(xì)胞核且被較薄的細(xì)胞質(zhì)所包圍。卵巢腔的形成標(biāo)志著性腺已分化為卵巢，石斑魚性腺分化為雌性。

1.2.3 抗原暴露試驗(yàn) 頭部和頭蓋骨固定在波恩試劑后其腦垂體中的蛋白抗原會(huì)被封閉，因此，必須進(jìn)行抗原暴露試驗(yàn)。將頭部和頭蓋骨切片用梯度酒精脫水后浸泡在10 mmol/L檸檬酸溶液中，用微波爐加熱至90 ℃并恒溫保持15 min。隨后將切片置于室溫下冷卻1 h并用蒸餾水洗凈。

1.2.4 腦垂體中FSHβ和LHβ細(xì)胞免疫組織化學(xué)的識(shí)別和定位 細(xì)胞免疫組織化學(xué)試驗(yàn)采用抗生物素蛋白-生物素過(guò)氧化物酶法。將切片浸泡在含0.3% H2O2的甲醇中1 h后，用PBS緩沖液沖洗干凈后在體積分?jǐn)?shù)為10%的山羊血清中封閉15 min，分別滴加兔抗底鳉FundulusheteroclitusFSHβ(稀釋1 000倍)和LHβ(稀釋5 000倍)第一抗體(日本Shimizu博士贈(zèng)送)在4 ℃下孵育一晚。然后用PBS緩沖液沖洗15 min，用SAB-PO(R)試劑盒(nichirei Biosciences Inc., Japan)中的山羊抗兔IgG第二抗體溶液孵育1 h，在PBS中漂洗15 min后用鏈霉親和素-HRP(horseradish peroxidase)溶液孵育30 min。再用PBS緩沖液沖洗10 min，用試劑盒中的DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色液(DAB horseradish peroxidase)觀察免疫反應(yīng)的信號(hào)。切片用蘇木精復(fù)染后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 腦垂體總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 取凍存的石斑魚腦垂體，參照TRIzol試劑盒(Life Technologies Corp., USA)中的說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，經(jīng)10 g/L瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA完整度，用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。根據(jù)Transcriptor first strand cDNA synthesis(Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany)說(shuō)明書操作，取1 μg總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板合成第一鏈cDNA，用于PCR的擴(kuò)增。

1.2.6 腦垂體中fshβ和lhβ基因的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 根據(jù)基因庫(kù)中各基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，赤點(diǎn)石斑魚fshβ和lhβ引物用Primer Express軟件設(shè)計(jì)，由Integrated DNA Technologies公司(USA)合成；黑邊石斑魚fshβ、lhβ和18S引物用Primer 3 Plus軟件設(shè)計(jì)，由Fasmac公司(Kanagawa, Japan)合成(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中引物序列

赤點(diǎn)石斑魚fshβ和lhβ基因測(cè)定參照FastStart Essential DNA Probe Master(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)試劑盒說(shuō)明書操作。PCR反應(yīng)體系(共10 μL)：cDNA 模板2.5 μL，Probe Master(2×concentrate)5 μL，探針引物(Primer F、Primer R 10 pmol/μL，Probe 5 pmol/μL)0.5 μL，滅菌超純水2 μL。在Light Cycler?480進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下循環(huán)變性 15 s，60 ℃退火復(fù)性1 min，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；95 ℃下熔解5 s，65 ℃下熔解1 min；最后在50 ℃下冷卻30 s。PCR反應(yīng)后獲得熔解曲線，基因表達(dá)量用絕對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

黑邊石斑魚fshβ和lhβ基因測(cè)定參照FastStart Essential DNA Green Master(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)試劑盒說(shuō)明書操作。PCR反應(yīng)體系(共10 μL)：cDNA 模板1 μL，Green Master(2×concentrate)5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，滅菌超純水2 μL。在 Light Cycler?480進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性10 s，60 ℃下退火復(fù)性 10 s，72 ℃下延伸 10 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；95 ℃下熔解5 s，65 ℃下熔解1 min；最后在50 ℃下冷卻30 s。PCR反應(yīng)后獲得熔解曲線，基因表達(dá)量用相對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以18S ribosomal RNA作為內(nèi)參基因。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±S.E.)表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Kolmogorov-Smirnov 法進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，利用Tukey’s HSD 法進(jìn)行組間差異性比較分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚的生長(zhǎng)指標(biāo)

從表2可見(jiàn)：試驗(yàn)開始時(shí)，55日齡的赤點(diǎn)石斑魚體長(zhǎng)為(25.32±0.48)mm，體質(zhì)量為(0.32±0.01)g，黑邊石斑魚體長(zhǎng)為(21.67±0.32)mm，體質(zhì)量為(0.25±0.00)g；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，120日齡的赤點(diǎn)石斑魚體長(zhǎng)為(88.67±2.18)mm，體質(zhì)量為(11.61±0.59)g，黑邊石斑魚體長(zhǎng)為(75.56±1.95)mm，體質(zhì)量為(9.46±0.44)g。

表2 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚在55、80、120日齡時(shí)體長(zhǎng)和體質(zhì)量的變化

2.2 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚性腺的組織學(xué)觀察

赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚性腺發(fā)育情況基本一致。55日齡時(shí)，性腺位于腸道附近，由一對(duì)小葉向前延伸并形成兩片突起，性腺內(nèi)有性細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和血管，性細(xì)胞位于中心并被肌肉細(xì)胞所包圍(圖1(a)A、B和圖1(b)A、B)；80日齡時(shí)，性腺兩端的結(jié)締組織向前延伸并形成小片突起，但尚未完全閉合在一起，表明卵巢腔正在形成(圖1(a)C和圖1(b)C);120日齡時(shí)，性腺左右兩側(cè)的結(jié)締組織進(jìn)一步向前延伸并完全閉合在一起，形成一個(gè)空腔為卵巢腔，卵巢腔的形成標(biāo)志著性腺分化為雌性，卵原細(xì)胞出現(xiàn)在卵巢腔周圍(圖1(a)D和圖1(b)D)。

(a)赤點(diǎn)石斑魚Epinephelus akaara

2.3 腦垂體結(jié)構(gòu)及腦垂體中FSHβ和LHβ細(xì)胞免疫組織化學(xué)的識(shí)別和定位

赤點(diǎn)石斑魚的腦垂體結(jié)構(gòu)(圖2(a)A1～A3)和黑邊石斑魚的腦垂體結(jié)構(gòu)(圖2(b)A1～A3)基本一致;腦垂體位于間腦腹側(cè)突起呈漏斗狀結(jié)構(gòu)，由神經(jīng)垂體(neurohypophysis, NH)和腺垂體(adenohypophysis, AH)兩部分構(gòu)成,腺垂體進(jìn)一步分為3小部分,從左至右分別為前外側(cè)部(rostral pars distalis, RPD)、中外側(cè)部(proximal pars distalis, PPD)和中間部(pars intermedia, PI)。

55日齡時(shí)，赤點(diǎn)石斑魚的FSHβ和LHβ細(xì)胞分布在PPD和PI區(qū)域(圖2(a)B1、C1)，黑邊石斑魚的FSHβ和LHβ分布在RPD和PPD區(qū)域(圖2(b)B1、C1)；80日齡時(shí)，赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚的FSHβ和LHβ均分布在PPD區(qū)域，LHβ分布在PPD區(qū)域(圖2(a)B2、C2和圖2(b)B2、C2);120 日齡時(shí)，赤點(diǎn)石斑魚的FSHβ分布在PPD和PI區(qū)域(圖2(a)B3、C3),黑邊石斑魚的FSHβ和LHβ均分布在PPD區(qū)域(圖2(b)B3、C3)。

(a)赤點(diǎn)石斑魚Epinephelus akaara

2.4 腦垂體中fshβ和lhβ基因表達(dá)量的變化

從圖3可見(jiàn)：赤點(diǎn)石斑魚腦垂體中fshβ基因含量在120日齡時(shí)顯著高于55、80日齡(P<0.05)，但lhβ基因含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；黑邊石斑魚腦垂體中fshβ和lhβ基因含量在120日齡時(shí)均顯著高于55和80日齡(P<0.05)。

(a)赤點(diǎn)石斑魚Epinephelus akaara

3 討論

3.1 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚性腺分化的過(guò)程

本試驗(yàn)表明，赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚性腺發(fā)育在55日齡時(shí)為未分化階段，80日齡時(shí)為分化階段，120日齡時(shí)為卵巢階段。已有研究表明，褐石斑魚在60日齡時(shí)性腺兩端結(jié)締組織突起并延伸，卵巢腔雛形開始形成，80日齡時(shí)結(jié)締組織突起更加發(fā)達(dá)并擴(kuò)展，110日齡時(shí)卵巢腔已經(jīng)完全形成[26]。但在點(diǎn)帶石斑魚中，11、39日齡為性腺未分化期，47、74日齡為分化期，144日齡為卵巢階段[27]。此外，韓國(guó)學(xué)者Kim等[5]的研究表明，赤點(diǎn)石斑魚在65日齡時(shí)結(jié)締組織開始延伸形成突起，在70、80、90、100日齡時(shí)，結(jié)締組織進(jìn)一步向前生長(zhǎng)并延伸，105日齡時(shí)卵巢腔已完全形成。而本研究中的赤點(diǎn)石斑魚在120日齡時(shí)卵巢腔才完全形成，與Kim等[5]報(bào)道的105日齡有所差異，表明性腺分化可能受到棲息地和飼養(yǎng)條件如水溫等環(huán)境因素的影響。有研究表明，水溫對(duì)歐洲鱸[28]和金魚Carassiusauratus[29]的性腺分化有重要影響。然而，本試驗(yàn)中55～80日齡期間兩種石斑魚性腺發(fā)育的情況，以及水溫對(duì)其性腺分化影響的研究尚未開展，今后需進(jìn)一步研究。

3.2 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚腦垂體中FSHβ和LHβ細(xì)胞的抗體特異性

目前，運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)識(shí)別魚類FSHβ和LHβ細(xì)胞的試驗(yàn)中，關(guān)鍵因素在于第一抗體能否較好地與抗原相結(jié)合，因?yàn)榭贵w與抗原間存在物種特異性反應(yīng)。以往的研究表明，由日本學(xué)者Shimizu博士開發(fā)的兔抗底鳉FSHβ和LHβ抗體不僅被運(yùn)用在檢測(cè)底鳉腦垂體中的FSHβ和LHβ細(xì)胞[30]，也被運(yùn)用于真鯛Pagrusmajor[31]、小口黑鱸Micropterusdolomieu[31]和慈鯛Cichlasomadimerus[32]中，表明兔抗底鳉FSHβ和LHβ抗體能夠較好地與多種魚類的抗原相結(jié)合，尤其此抗體也適用于石斑魚類如蜂巢石斑魚E.merra[22]和點(diǎn)帶石斑魚[23]。因此，本試驗(yàn)中運(yùn)用此抗體檢測(cè)赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚腦垂體中的FSHβ和LHβ細(xì)胞，結(jié)果表明，兔抗底鳉FSHβ和LHβ抗體可有效地對(duì)兩種石斑魚腦垂體中的FSHβ和LHβ細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并定位。

3.3 赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚腦垂體中FSHβ和LHβ細(xì)胞的分布及其角色

研究表明，硬骨魚類中的FSHβ和LHβ細(xì)胞主要分布在腦垂體PPD區(qū)域[33]。本試驗(yàn)表明，赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚腦垂體結(jié)構(gòu)分為NH、RPD、PPD和PI部分，與大多數(shù)硬骨魚類的腦垂體結(jié)構(gòu)一致[33]，且在性腺發(fā)育各階段，腦垂體中FSHβ和LHβ主要集中在PPD區(qū)域，少量出現(xiàn)在RPD或PI區(qū)域。在多數(shù)硬骨魚如銀漢魚Odontesthesbonariensis[31]、底鳉[32]、慈鯛[32]、蜂巢石斑魚[22]和點(diǎn)帶石斑魚[23]中，F(xiàn)SHβ和LHβ信號(hào)大量集中在PPD區(qū)域，少量在PI區(qū)域。因此，本試驗(yàn)中觀察到的FSHβ和LHβ在腦垂體中的分布與上述硬骨魚的分布大致相同。

本試驗(yàn)表明，赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚腦垂體中FSHβ和LHβ蛋白信號(hào)在55、80、120日齡時(shí)均被檢測(cè)到，且赤點(diǎn)石斑魚腦垂體中fshβ基因含量及黑邊石斑魚腦垂體中fshβ與lhβ含量在120日齡時(shí)均顯著高于55、80日齡，這表明FSHβ和LHβ與兩種石斑魚的性腺分化密切相關(guān)。在虹鱒Oncorhynchusmykiss[35]、南方鲇Silurusmeridionalis[36]和赤點(diǎn)石斑魚[37]性腺分化過(guò)程中，fshβ和lhβ基因均被檢測(cè)到；在銀漢魚性腺分化過(guò)程中，F(xiàn)SHβ和LHβ蛋白信號(hào)也被檢測(cè)到[31]。上述研究結(jié)果分別從PCR和IHC角度表明，F(xiàn)SHβ和LHβ與硬骨魚的性腺分化有關(guān)。然而對(duì)點(diǎn)帶石斑魚[23]、尼羅羅非魚Oreochromisniloticus[38]和黃鱔Monopterusalbus[39]的研究表明，F(xiàn)SHβ和LHβ與性腺分化無(wú)關(guān)。此外，在底鳉[40]和歐洲鱸[21]中，只有FSHβ對(duì)性腺分化和早期卵母細(xì)胞的發(fā)育具有重要作用，而LHβ在性腺分化過(guò)程中的角色尚不明確。上述不同研究結(jié)果表明，硬骨魚類腦垂體中FSHβ和LHβ在性腺分化過(guò)程中的角色具有物種特異性。本研究中，F(xiàn)SHβ和LHβ信號(hào)在兩種石斑魚各階段均被檢測(cè)到，且性腺分化剛結(jié)束階段fshβ和lhβ基因含量出現(xiàn)顯著性差異，表明FSHβ和LHβ在兩種石斑魚性腺分化過(guò)程中起重要作用，其角色可能是促進(jìn)個(gè)體早期發(fā)育和加速性細(xì)胞的增殖。

4 結(jié)論

1)赤點(diǎn)石斑魚和黑邊石斑魚性腺發(fā)育在55日齡時(shí)為未分化階段，80日齡時(shí)為分化階段，120日齡時(shí)為卵巢階段。

2)兩種石斑魚在55、80、120日齡時(shí)的腦垂體結(jié)構(gòu)相似，分為神經(jīng)垂體(NH)和腺垂體(AH)，腺垂體進(jìn)一步細(xì)分為前外側(cè)部(RPD)、中外側(cè)部(PPD)和中間部(PI)。

3)兔抗底鳉FSHβ和LHβ抗體可有效對(duì)兩種石斑魚腦垂體中的FSHβ和LHβ細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并定位。在兩石斑魚性腺分化的過(guò)程中，腦垂體中的FSHβ和LHβ起重要作用，其角色可能是促進(jìn)個(gè)體的早期發(fā)育和加速性細(xì)胞的增殖。因此，在未來(lái)石斑魚的人工繁殖和苗種生產(chǎn)過(guò)程中，可以考慮使用注射外源FSHβ和LHβ激素促進(jìn)兩種石斑魚的個(gè)體發(fā)育并縮短性腺分化的時(shí)間。