李媛媛 羅振元 胡莉 黃盛文

【摘要】目的：調(diào)查貴陽地區(qū)孕婦人群脊髓性肌萎縮癥（SMA）攜帶率，并對高風(fēng)險的孕婦行產(chǎn)前基因診斷，防止SMA患兒的出生。方法：應(yīng)用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)對524例孕婦的SMN1基因外顯子7和8的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，篩查出SMA攜帶者，并計算攜帶者的頻率。對攜帶者的配偶進(jìn)行篩查，并為雙方均為攜帶者的夫婦提供產(chǎn)前診斷。結(jié)果：在524例孕婦中，共檢出SMA攜帶者12例，攜帶比例為1/44，檢出率2.29%.，其中SMN1基因外顯子7單一缺失的攜帶者2例（占16.7%），外顯子7合并外顯子8缺失攜帶者10例（占83.3%），未檢測出同為SMA攜帶者的夫婦。曾經(jīng)生育過SMA患兒的1對夫婦均為SMN1基因外顯子7合并外顯子8雜合缺失攜帶者。對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，確診為SMN1純合缺失胎兒。結(jié)論：初步獲得了貴陽地區(qū)孕婦人群SMA的攜帶率為1/44。SMA攜帶者篩查可為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)，對于優(yōu)生優(yōu)育、有效預(yù)防SMA胎兒的出生具有重要的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】脊髓性肌萎縮癥；攜帶者篩查；運動神經(jīng)元存活基因；產(chǎn)前診斷

【中圖分類號】R714.55 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）12-0191-02

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy， SMA）是一種兒童致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為常染色體隱性遺傳[1]。SMA的人群發(fā)病率約為1/6000～1/10000，攜帶率為1/40～1/60[2]。SMA致病基因是位于5號染色體長臂l區(qū)3帶（5q13）的運動神經(jīng)元存活基因（survival motor neuron，SMN）。端粒側(cè)的SMN1和中心粒側(cè)的SMN2，是兩個相鄰的高度同源的SMN基因，兩個基因序列之間僅有5個堿基的差異。主要功能基因為SMN1，修飾基因SMN2一定程度上可以緩解SMA的嚴(yán)重程度。SMA發(fā)生的分子基礎(chǔ)是由于功能異常SMN1基因使脊髓前角α細(xì)胞變性所導(dǎo)致的[3]。多數(shù)SMA 病例（約為95 %）為SMN 1基因外顯子7的純合缺失，少數(shù)病例（約<5%）是由SMN1基因外顯子7雜合缺失與SMN 1基因點突變復(fù)合雜合致 病[4-6]。因此，針對SMN1外顯子7的拷貝數(shù)檢測已成為目前篩查 SMA攜帶者的常用方式。

由于SMA預(yù)后不良，目前尚無特效治療方法，通過遺傳篩查以及產(chǎn)前診斷來防止SMA患兒的出生是預(yù)防本病最有效的方法。迄今，未見貴州地區(qū)人群SMA攜帶率的文獻(xiàn)報道。本研究中，我們應(yīng)用PCR法對產(chǎn)檢孕婦進(jìn)行SMN1基因篩查，了解本地孕婦人群SMA的攜帶率，并對高風(fēng)險的孕婦行產(chǎn)前基因檢測，防止SMA 患兒的出生。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2018年12月于貴州省人民醫(yī)院婦進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)檢的表型正常的孕婦524例，孕婦年齡20～50（28.1±2）歲，孕周10～22（16±3.2）周。其中具有SMA陽性家族史的孕婦1例，33歲，G2P1，曾生育SMA患兒1例。所有自愿篩查對象均需簽署臨床研究知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：健康孕婦人群、不良孕史人群以及高危孕 產(chǎn)婦。

排除標(biāo)準(zhǔn)：無。

1.2 方法

（1）樣本采集。釆集受檢者外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，置于2～8 ℃冷藏條件下保存，并在1周內(nèi)完成檢測。

（1）DNA提取。使用NP986-C核酸提取系統(tǒng)（西安天隆有限公司）及配套試劑提取外周血DNA，采用NanoDrop one超微量生物檢測儀（基因有限公司）對DNA的濃度進(jìn)行檢測。

（1）基因檢測。運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）外顯子缺失檢測試劑盒（熒光定量PCR法）檢測試劑由上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司提供，對SMN1基因外顯子7和外顯子8拷貝數(shù)進(jìn)行檢測。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)；FAM通道及VIC通道用于信號采集。

1.3 結(jié)果判斷

應(yīng)用比較閾值法（△△Ct法或2-△△Ct）計算受檢者樣本中SMN1基因外顯子7、8的拷貝數(shù)。待測樣本中，若外顯子7反應(yīng)的△△Ct >0.8或無擴增信號；外顯子8反應(yīng)的△△Ct >1.5或無擴增信號，即為SMN1基因外顯子7、8純合缺失。若外顯子7反應(yīng)的△△Ct介于±0.45之間；外顯子8反應(yīng)的△△Ct 介于±0.45之間，即為SMN1基因外顯子7、8雜合缺失。

產(chǎn)前診斷：若孕婦檢測為SMA攜帶者，則對其配偶進(jìn)行攜帶者篩查；若夫婦雙方均為SMA攜帶者，經(jīng)知情同意后于孕16～22周，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，在B超引導(dǎo)下使用一次性無菌注射器，緩慢抽取羊水10 mL，按上述方法檢測胎兒SMN1基因。

2 結(jié)果

2.1 樣本SMN1基因檢測結(jié)果

所有樣本均檢測成功，根據(jù)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)獲得SMN1基因外顯子7、8缺失突變的基因型。

2.2 524例產(chǎn)檢孕婦SMA攜帶率

在524例產(chǎn)檢孕婦中檢出12例孕婦為SMA攜帶者，攜帶率為1/44，檢出率2.29% ，其中SMN1基因外顯子7單一缺失的攜帶者2例（占16.7%），外顯子7合并外顯子8缺失攜帶者10例（占83.3%）。進(jìn)一步對攜帶者的配偶進(jìn)行SMA基因檢測，檢測出同為SMA攜帶者的夫婦0對。

2.3 SMA產(chǎn)前診斷

對曾經(jīng)生育過SMA患兒的1對夫婦進(jìn)行檢測，明確均為SMN1基因外顯子7合并外顯子8雜合缺失攜帶者。孕 18 周時行羊水穿刺，胎兒SMN1基因產(chǎn)前診斷結(jié)果為外顯子7合并外顯子8純合缺失，確診為SMA胎兒。根據(jù)孕婦夫婦意愿選擇終止妊娠。

3 討論

脊髓性肌萎縮癥依據(jù)病情嚴(yán)重程度以及發(fā)病的年齡可將SMA分為四種臨床型[7]，其中約有80%以上的患兒均為I或II型。盡管已有針對 SMA 的治療藥物出現(xiàn)，但由于其昂貴的治療費用，使其不能普遍使用。現(xiàn)階段，科學(xué)的產(chǎn)前篩查比患病后的治療，更具有衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)意義。因此，通過攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷，避免患兒的出生，仍是行之有效的SMA預(yù)防 手段。

在本研究中，我們應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對523名貴陽地區(qū)的孕婦人群進(jìn)行了SMN1基因缺失攜帶者的篩查，結(jié)果顯示貴陽地區(qū)SMA 攜帶者頻率為 1/44。其中以SMA1基因外顯子7和外顯子8共同缺失為最多，占所有攜帶者的83.3%，外顯子7單一缺失僅占16.7%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。本組孕婦中檢出為外顯子8單一缺失2例。由于外顯子8位于非編碼區(qū)，僅有外顯子8缺失時是不致病的。本研究采用的檢測方法能檢出95%以上的SMN1基因缺失型突變，約有4%的SMA攜帶者為“2+0”類型[8]，即1條5染色體上有兩個SMN1基因，另一條5號染色體上的SMN1基因存在外顯子7缺失的情形，本研究的檢測方法不能直接檢測出“2+0”類型攜帶者，需要依據(jù)確診的SMA患者父母的SMN1基因拷貝數(shù)結(jié)合家族史進(jìn)行測序驗證。

本研究初步確定了貴陽地區(qū)SMA 攜帶者的頻率，同時，對1對SMA攜帶者夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免 1 例SMA患兒的出生。本研究由于未對 SMN2 基因拷貝數(shù)以及 SMN1 基因少見突變類型深入研究，在解讀篩查結(jié)果時，需要告知受檢者本研究的檢測方法可能存在漏檢的情況。臨床應(yīng)用時還要結(jié)合臨床表型，確定是否需要對少見SMN1突變類型進(jìn)行檢測，防止漏診。

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