王榮華,劉益莎,符艷純,張潤(rùn)春,周 勇,羅玉雙,劉 飛,陳中元
( 1.湖南文理學(xué)院,水生動(dòng)物重要疫病分子免疫技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心,湖南 常德 415000;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,湖北 武漢 430223 )
黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)屬鯉科、鲴亞科、鲴屬,俗稱(chēng)黃尾、黃片、黃瓜魚(yú)等,是一種底棲的中小型淡水魚(yú)類(lèi),在我國(guó)的長(zhǎng)江、珠江和閩江等地區(qū)各溪流中均有分布[1]。黃尾鲴具有含肉率高、易捕撈、疾病少等特點(diǎn),是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中增養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)品種[2]。目前尚未見(jiàn)黃尾鲴疾病的相關(guān)報(bào)道,近年來(lái),在湖南株洲地區(qū)某黃尾鲴苗種場(chǎng)養(yǎng)殖的黃尾鲴親魚(yú)大面積暴發(fā)潰瘍綜合征,嚴(yán)重影響親魚(yú)的繁殖與后期養(yǎng)殖。為探明株洲地區(qū)黃尾鲴潰瘍綜合征的病因,筆者采用傳統(tǒng)病原菌分離鑒定方法和藥敏紙片法,分離致病菌和篩選敏感的中草藥和抗生素,并通過(guò)組織切片技術(shù)觀察病理變化,以期為湖南株洲地區(qū)黃尾鲴潰瘍綜合征的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。
試驗(yàn)魚(yú):患病黃尾鲴采集自湖南省株洲市醴陵縣某黃尾鲴苗種場(chǎng),體質(zhì)量(240±20) g;健康黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)體質(zhì)量(90±5) g,健康黃尾鲴體質(zhì)量(150±5) g,均購(gòu)自常德市龍港路菜市場(chǎng)。試驗(yàn)前于水族箱中暫養(yǎng)7 d,水溫(28±1) ℃,充氣,按體質(zhì)量的2%投喂普通配合飼料。
主要試劑:肉湯培養(yǎng)基(LB)、肉湯瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)和藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增通用引物合成和DNA測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;PCR試劑盒和DNA Marker為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;25種中草藥(連翹、魚(yú)腥草、穿心蓮、苦參、白鮮皮、五味子、陳皮、黃芩、秦皮、艾葉、烏梅、牡丹皮、黃柏、紫蘇葉、貫眾、蒲公英、板藍(lán)根、五倍子、馬齒莧、柴胡、蘇木、紫花地丁、黃連、金銀花、野菊花)購(gòu)自常德市九芝堂大藥房;改良型蘇木精—伊紅染色試劑盒為T(mén)hermo公司產(chǎn)品。
1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)
取有典型癥狀的黃尾鲴親魚(yú),用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精體表消毒后,無(wú)菌條件下,取肝臟、腹水及潰瘍病灶等組織涂布接種腦心浸液瓊脂平板,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,挑取優(yōu)勢(shì)菌落于肉湯瓊脂平板劃線(xiàn)純化3次后,使用20%的甘油,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 人工感染試驗(yàn)
將純化菌株接種于LB培養(yǎng)基,28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1×107cfu/mL菌液備用。由于黃尾鲴生性急躁,加上實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件不佳,實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖難成活,因此選擇較溫和的小型魚(yú)類(lèi)黃顙魚(yú)作為人工感染試驗(yàn)魚(yú)[3]。將健康黃顙魚(yú)隨機(jī)分為4組,每組30尾,采用肌肉注射法,每尾黃顙魚(yú)注射0.2 mL密度為1×107cfu/mL的菌液。試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行,同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。控制水溫為(28±1) ℃,連續(xù)觀察14 d,并記錄患病癥狀和死亡情況,同時(shí)取瀕死黃顙魚(yú)內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌再分離培養(yǎng)與鑒定,以確定致病菌。
1.2.3 病原菌鑒定
生理生化鑒定:生理生化鑒定采用Biolog全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定,將分離的優(yōu)勢(shì)菌株劃線(xiàn)接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% BUG的培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h,用無(wú)菌棉簽蘸取一定量的細(xì)菌至IF-A接種液中,搖勻后調(diào)整濁度計(jì)讀數(shù)為98%,以每孔150 μL加入到96孔GEN Ⅲ鑒定板中,于28 ℃培養(yǎng)24 h,用Biolog全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)讀取生理生化結(jié)果并進(jìn)行鑒定。
16S rDNA鑒定:采用16S rDNA 的通用引物,正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTC AG-3′,反向引物1492R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。反應(yīng)體系:2×Taq PCR Mix 預(yù)混液25 μL,引物27F和1492R各1 μL,HZ0416菌液3 μL,ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,通過(guò)ClustalW 2.1和MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),自展法檢測(cè)設(shè)置為1000次。
1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)
抗生素藥物敏感試驗(yàn):采用常規(guī)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)常用8 種抗生素藥物進(jìn)行敏感性測(cè)定。取100 μL密度為1×107cfu/mL的優(yōu)勢(shì)菌株均勻涂布于肉湯瓊脂平板,并將藥敏紙片均勻布置于平板上,每個(gè)紙片之間的距離不小于2 cm,28 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定抑菌圈直徑大小,并根據(jù)杭州微生物試劑有限公司公布的藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物敏感性。
中草藥藥物敏感試驗(yàn):采用常規(guī)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)常用25種中草藥進(jìn)行敏感性測(cè)定。取2 g中草藥浸泡于30 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中,常溫浸泡,每周搖勻晃動(dòng)1次,浸泡100 d后,按每片藥敏紙片(厚度0.5 mm、直徑6 mm)10 μL藥液加至滅菌后烘干的空白藥敏紙片中,37 ℃ 烘干備用;對(duì)照藥敏紙片按每片滅菌空白藥敏紙片滴加10 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇后,37 ℃ 烘干。中草藥敏感性試驗(yàn)操作方法同抗生素藥敏試驗(yàn),設(shè)置試驗(yàn)組和對(duì)照組,試驗(yàn)組在平板上均勻布置制備好的中草藥藥敏紙片,對(duì)照組布置對(duì)照藥敏紙片。敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感,以“+++”表示;抑菌圈直徑15~<20 mm為高度敏感,以“++”表示;抑菌圈直徑10~<15 mm為中度敏感,以“+”表示;抑菌圈直徑<10 mm為低度敏感或無(wú)抑制效果,以“-”表示[5-6]。
1.2.5 病理學(xué)觀察
取患典型潰瘍綜合征的病魚(yú)肝臟、脾臟、腎臟和病灶處肌肉等組織于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定后,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)30%~100%乙醇梯度脫水后,二甲苯透明,石蠟包埋,以4~5 μm厚度切片,蘇木精—伊紅染色后,使用徠卡(Leica)高級(jí)顯微系統(tǒng)(DM3000)觀察組織病理變化并拍照。
黃尾鲴親魚(yú)潰瘍綜合征主要暴發(fā)于繁殖季節(jié)4月—6月初,水溫25~28 ℃,發(fā)病率和死亡率高,消毒藥物、殺蟲(chóng)類(lèi)藥物治療效果不佳?;疾↑S尾鲴主要表現(xiàn)為:反應(yīng)遲鈍,獨(dú)游;體表不同部位出現(xiàn)大面積潰瘍,部分病魚(yú)潰瘍處深入內(nèi)臟;鰭條充血、出血,并伴有爛尾現(xiàn)象。解剖可見(jiàn):病魚(yú)腹腔有淡黃色積液;肝臟充血、出血,嚴(yán)重者呈糜爛狀;脾臟、腎臟紅腫,腸道內(nèi)無(wú)食物(圖1)。
圖1 黃尾鲴潰瘍綜合征臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of ulcerative disease syndrome in X. davidia.魚(yú)體表面不同部位出現(xiàn)潰瘍癥狀(▲.背鰭基部;△.腹部;→.尾柄處),爛鰭; b.病灶潰瘍深至內(nèi)臟(▲),肝臟充血(△); c.肝臟糜爛(▲),腹腔有淡黃色積液(△).a.typical ulcers are found in different parts of fish surface (▲.the ulcers in base of dorsal fin; △.in abdomen; →.in caudal peduncle) and fin rot; b.the ulcer is deep to the internal organ (▲), hyperemia and hemorrhage in liver (△); c.liver erosion (▲) and light yellow effusion in peritoneum (△).
從黃尾鲴親魚(yú)病灶處和肝臟中分離1株優(yōu)勢(shì)菌HZ0416,鏡檢為革蘭氏陰性菌,呈短桿狀。LB培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h菌落大小約2 mm,圓形,表面光滑,形態(tài)飽滿(mǎn),均質(zhì)透明,呈乳白色或淡黃色。
肌肉注射感染24 h后,黃顙魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)潰瘍癥狀;感染后3 d,黃顙魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;14 d死亡率達(dá)86.7%(圖2)。主要表現(xiàn)癥狀為:黃顙魚(yú)不
圖2 黃顙魚(yú)感染HZ0416累積死亡率曲線(xiàn)Fig.2 The cumulative mortality of yellow catfish P. fulvidraco infected with HZ0416
同部位出現(xiàn)不同程度的潰爛(圖3a~b),腹腔有帶血腹水,肝臟充血、出血(圖3c),膽囊腫大,部分魚(yú)有腸充氣現(xiàn)象。同時(shí)從病魚(yú)的肝臟和病灶處也分離到菌株HZ0416,對(duì)照組黃顙魚(yú)體表和內(nèi)臟均無(wú)任何明顯癥狀。
圖3 黃顙魚(yú)感染HZ0416菌株的臨床癥狀Fig.3 Clinical symptoms of yellow catfish P. fulvidraco infected with strain HZ0416a、b.魚(yú)體表面不同部位出現(xiàn)典型潰瘍癥狀(▲.腹部;☆.臀鰭基部); c.肝臟糜爛充血(▲),腹腔有帶血的腹水(☆).a,b.typical ulcers in different parts of fish surface (▲.the ulcers in abdomen; ☆.base of anal fin); c.hyperemia and erosion in liver (▲) and bloody ascites in peritoneum (☆).
2.4.1 Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定
Biolog微生物自動(dòng)分析鑒定系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示,分離的菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌(Aeromonasschubertii),置信度高達(dá)81.7%,鑒定結(jié)果各評(píng)價(jià)參數(shù)為PROB=0.817,SIM=0.796,DIST=2.939。
2.4.2 16S rDNA鑒定
菌株HZ0416的16S rDNA測(cè)序獲得1338 bp序列,GenBank登錄號(hào)為MN239102。美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心核酸序列BLAST同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示,菌株HZ0416和舒氏氣單胞菌同源性最高,達(dá)99.4%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示,HZ0416菌株和舒氏氣單胞菌聚為一支,而后與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、維氏氣單胞菌(A.veronii)聚為一簇,表明菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌(圖4)。
圖4 菌株HZ0416基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenic tree of strain HZ0416 based on 16S rRNA gene sequences
2.5.1 抗生素藥物敏感性
抗生素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,舒氏氣單胞菌HZ0416對(duì)慶大霉素和氟苯尼考高度敏感;對(duì)環(huán)丙沙星中度敏感;對(duì)卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐藥性。
表1 菌株HZ0416對(duì)抗生素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Antibiotic susceptibility test of the strain HZ0416
2.5.2 中草藥藥物敏感性
中草藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,五倍子醇提取液對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416的抑菌圈直徑達(dá)30 mm,顯示其對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416極度抑制效果;陳皮、牡丹皮中草藥醇提取液對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416具有高度抑制效果;魚(yú)腥草、穿心蓮、蒲公英、柴胡、苦參中草藥醇提取液對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416有較好抑制效果;而舒氏氣單胞菌HZ0416對(duì)白鮮皮、五味子、黃芩、烏梅、蘇木、金銀花、連翹、秦皮等17種中草藥醇提取液呈低度敏感或不敏感(表2)。
表2 菌株HZ0416對(duì)中草藥藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Herbal medicinal susceptibility test of the strain HZ0416
組織病理學(xué)結(jié)果(圖5)顯示,肌纖維斷裂、溶解,細(xì)胞堆積形成肉芽腫,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)病灶處細(xì)胞中可見(jiàn)細(xì)菌的團(tuán)塊和細(xì)菌感染后細(xì)胞凋亡留下的細(xì)胞輪廓(圖5b);脾臟實(shí)質(zhì)性細(xì)胞空泡壞死,組織內(nèi)有大量含鐵血黃素沉著,伴隨有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5d);肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞多發(fā)生核固縮、破裂和溶解,細(xì)胞界限不清晰,并伴有充血、出血現(xiàn)象,組織內(nèi)有大量含鐵血黃素沉著(圖5f);腎小球囊壁細(xì)胞變性、壞死,上皮細(xì)胞增生,腎間質(zhì)縮小,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5h)。
圖5 黃尾鲴潰瘍綜合征病理組織學(xué)觀察Fig.5 The pathohistological observation of ulcerative disease syndrome in X. davidia.正常肌肉組織; b.肌肉潰瘍病灶處形成肉芽腫(▲),肌纖維變性、壞死(★),組織中可見(jiàn)細(xì)菌團(tuán)塊(△),炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(→); c.正常脾臟組織; d.脾細(xì)胞有含鐵血黃素沉積(★),實(shí)質(zhì)性細(xì)胞空泡壞死(▲),大量淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)(→); e.正常肝臟組織; f.肝臟細(xì)胞腫脹,充血(▲),有含鐵血黃素沉積(★); g.正常腎臟組織; h.腎小球囊壁細(xì)胞變性、壞死,上皮細(xì)胞增生(★),炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(→).a.normal tissue section diagram of muscle; b.the granuloma in lesion of muscle ulcer (▲), muscle fiber degeneration, and necrosis (★), bacterial clumps are found in lesion (△) and inflammatory cells infiltration (→); c. normal tissue section diagram of spleen; d.hemosiderin deposits in spleen cells (★), vacuolar degeneration in the spleen cells (▲) and lymphocytes and monocytes cells infiltration (→); e. normal tissue section diagram of liver; f.swell, hyperemia (▲) and hemosiderin deposition in liver cells (★); g. normal tissue section diagram of kidney; h.necrosis in cells of Bowman′s capsule wall, epithelial cells hyperplasia (★) and inflammatory cells infiltration (→).
黃尾鲴具有易捕撈、抗病性強(qiáng)、生長(zhǎng)快等特點(diǎn),已成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)調(diào)整中首選的優(yōu)良品種之一。目前尚未見(jiàn)黃尾鲴相關(guān)疾病的報(bào)道,筆者自患潰瘍綜合征的黃尾鲴親魚(yú)肝臟中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌HZ0416。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株HZ0416感染黃顙魚(yú)表現(xiàn)的癥狀與黃尾鲴親魚(yú)自然發(fā)病癥狀相似,從瀕死黃顙魚(yú)肝臟中分離到相同病原菌,感染后死亡率高達(dá)86.7%,因而推測(cè)菌株HZ0416能引起黃顙魚(yú)潰瘍綜合征,從而推斷菌株HZ0416是湖南株洲苗種場(chǎng)黃尾鲴潰瘍綜合征的潛在病原菌。
目前報(bào)道的潰瘍綜合征病原菌主要為氣單胞菌屬中的殺鮭氣單胞菌(A.salmonicide)[7]、維氏氣單胞菌[8,9]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[10]和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)[11]等。筆者自患病黃尾鲴中分離到菌株HZ0416,并證明其能誘發(fā)黃顙魚(yú)潰瘍綜合征。進(jìn)一步通過(guò)Biolog全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和16S rDNA序列分析,確定菌株HZ0416為舒氏氣單胞菌。舒氏氣單胞菌最早于1988年自人體膿腫、傷口等處分離,目前已是人—畜—魚(yú)的重要條件致病菌[12],其能引起人腹瀉和患?jí)乃佬越钅ぱ?,并?dǎo)致人體多器官功能衰竭而死亡[13-14]。舒氏氣單胞菌廣泛分布于淡、海水等環(huán)境中[15-16],能引起烏鱧(Channaargus)[17-18]、淡紅墨頭魚(yú)(Garrarufa)[19]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[20]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]等發(fā)病致死,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較大。
黃尾鲴潰瘍綜合征是株洲市近年來(lái)陸續(xù)發(fā)生的比較嚴(yán)重的傳染性疾病,主要表現(xiàn)為:病魚(yú)體表多處潰瘍,肝臟、脾臟、腎臟等組織紅腫,出血、充血。流行病學(xué)調(diào)查顯示,該病主要發(fā)生在親魚(yú)繁殖季節(jié),初春溫度在22 ℃時(shí)開(kāi)始發(fā)病,并出現(xiàn)零星死亡;當(dāng)水溫達(dá)到28 ℃,發(fā)病達(dá)到高峰期。推測(cè)在4—6月親魚(yú)繁殖過(guò)程中,由于黃尾鲴性急喜跳[3],因而在捕撈和集中高密度養(yǎng)殖期間親魚(yú)容易損傷體表,加上過(guò)冬后魚(yú)體免疫力低下,更容易使環(huán)境中普遍存在的舒氏氣單胞菌在體表創(chuàng)傷處附著和定殖,引發(fā)感染。隨著感染的加劇,舒氏氣單胞菌隨血液循環(huán)進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)臟器官,進(jìn)而患潰瘍綜合征[22]。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,舒氏氣單胞菌感染損傷魚(yú)體肌肉后,肌纖維斷裂、溶解,隨著感染的加深,侵染機(jī)體肝臟、脾臟和腎臟,引起肝臟、脾臟和腎臟組織出血、充血,實(shí)質(zhì)性細(xì)胞凋亡、壞死,導(dǎo)致多組織器官功能受損,引發(fā)死亡。
藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,舒氏氣單胞菌HZ0416對(duì)慶
大霉素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星敏感;對(duì)卡那霉素、多黏菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐藥性,與自烏鱧[18]和雜交鱧(C.maculata×C.argus)[23]中分離的舒氏氣單胞菌基本一致。另外,五倍子醇提取液對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416的抑菌圈直徑達(dá)30 mm,優(yōu)于試驗(yàn)中所選抗生素的抑菌效果,同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果顯示,陳皮、牡丹皮、柴胡、魚(yú)腥草、穿心蓮等對(duì)舒氏氣單胞菌HZ0416也具有較好的抑制效果。因此,五倍子可作為預(yù)防和治療潰瘍綜合征的候選藥物,替代抗生素的使用降低養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生。
自患典型潰瘍綜合征的黃尾鲴中分離鑒定1株致病性舒氏氣單胞菌,回歸感染試驗(yàn)顯示,其對(duì)黃顙魚(yú)具有強(qiáng)致病性。黃尾鲴親魚(yú)潰瘍綜合征的發(fā)病原因可能是在拉網(wǎng)和繁殖過(guò)程中,魚(yú)體產(chǎn)生機(jī)械損傷,從而感染環(huán)境中的舒氏氣單胞菌,引起肝臟、脾臟和腎臟等實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞凋亡、壞死,表現(xiàn)出功能障礙,最終死亡。氟苯尼考、五倍子等作為候選藥物防治該養(yǎng)殖場(chǎng)黃尾鲴潰瘍綜合征,同時(shí)在親魚(yú)培育中,應(yīng)注意提高魚(yú)體免疫力,加強(qiáng)對(duì)該病的預(yù)防。