徐春霞

( 福建省閩東水產(chǎn)研究所，福建 寧德 352100 )

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)，屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬，為我國傳統(tǒng)四大海產(chǎn)魚類之一。作為目前我國最大的大黃魚育苗和養(yǎng)殖基地，福建省寧德市的大黃魚產(chǎn)量約占全國大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的70%[1]，根據(jù)2019年福建省漁業(yè)統(tǒng)計年鑒，2019年寧德市人工養(yǎng)殖大黃魚總量達1.64×105t，養(yǎng)殖網(wǎng)箱近33萬個，養(yǎng)殖面積近2450 hm2，穩(wěn)居全國首位，為寧德市帶來巨大的經(jīng)濟效益。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及環(huán)境的惡化，大黃魚養(yǎng)殖病害頻發(fā)，成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。尤其是近些年暴發(fā)的流行性細菌性疾病——內(nèi)臟白點病，在發(fā)病期間病魚腹部脹大，內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)，累計死亡率高，給大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。已有諸多學者[3-14]對大黃魚內(nèi)臟白點病進行病原分離鑒定和致病性研究，鑒定出的病原菌有銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[3]、惡臭假單胞菌(P.putida)[4-9]、變形假單胞菌(P.plecoglossicida)[10-15]，但目前學術界對大黃魚內(nèi)臟白點病病原菌的鑒定結(jié)果仍存在分歧。為避免采樣過程中造成的污染以及病原菌人工培養(yǎng)分離過程中的偏差等問題，筆者首次采用宏基因組測序?qū)疾〈簏S魚內(nèi)臟組織中菌落變化進行比較，并采用生態(tài)模擬的方式自患病大黃魚內(nèi)臟中分離病原菌，進行全基因組序列分析，最后對病原菌的致病性和耐藥性進行研究，旨在增進對大黃魚內(nèi)臟白點病的認識，為網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病的早期預防和治療提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

2018年4月，海區(qū)水溫17.8 ℃，自寧德市三沙灣大灣漁排選取網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚，平均體質(zhì)量為150 g，無菌條件下-18 ℃運抵實驗室進行組織病理觀察、宏基因測序以及病原菌分離。

2019年9月，海區(qū)水溫27.7 ℃，自富發(fā)水產(chǎn)公司大灣漁排隨機選取大黃魚10尾并解剖，在確保沒有內(nèi)臟白點的情況下挑選出健康、活力好的大黃魚500尾，平均體質(zhì)量為45 g，活水運輸?shù)綄嶒炇?，暫養(yǎng)14 d，其間正常喂食，作為攻毒試驗用魚。

1.2 材料與試劑

NaCl、甘油(國藥集團化學試劑有限公司)，2216E液體培養(yǎng)基、2216E瓊脂(青島海博生物技術有限公司)，營養(yǎng)瓊脂粉(上海藍季科技發(fā)展有限公司)，腦心浸液培養(yǎng)基(英國麥康凱公司)，API-20E鑒定試劑盒(法國梅里埃公司)，TaKaRa細菌DNA提取試劑盒(日本寶日生物技術有限公司)，抗生素藥品紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)，通用型組織固定液(賽維爾生物科技有限公司)。

1.3 儀器與設備

Nano drop 2000分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)，BX51生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，TG16-WS臺式高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，TU-100恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)，SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，DNP-9272恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)，THZ-C-L臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市強樂實驗設備有限公司)，Select cyclerⅡ梯度PCR儀(美國Select BioProducts)。

1.4 病理組織學觀察

活體解剖瀕死病魚，觀察其內(nèi)臟組織病變情況并拍照保存，對病變組織取樣保存，進行組織病理觀察。分別取鮮活病魚和健康魚的肝臟、腎臟和脾臟組織，用含4%多聚甲醛通用型組織固定液進行組織固定后送武漢塞維爾生物科技有限公司進行普通包埋和石蠟切片。樣品組織經(jīng)過70%～100%乙醇逐級脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機切片，切片脫蠟至水，蘇木精—伊紅染色等步驟，進行顯微鏡鏡檢和圖像采集。

1.5 宏基因測序

對大黃魚進行解剖觀察，選取4尾內(nèi)臟結(jié)節(jié)癥狀明顯的大黃魚和1尾無結(jié)節(jié)癥狀的大黃魚，無菌條件下取脾臟、腎臟、肝臟以及腸道組織。同時，抽取200 mL所在養(yǎng)殖區(qū)域的海水，通過0.22 μm濾膜對海水中細菌進行固定。將濾膜與上述組織分別存放于冷凍管中，干冰條件下委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行宏基因測序。

1.6 病原菌分離

無菌條件下將10 g患病大黃魚的脾臟和腎臟組織破碎后溶于990 mL生理鹽水，經(jīng)梯度稀釋后將樣品接種于腦心浸液培養(yǎng)基和2216E固體培養(yǎng)基中，分別將樣品置于16 ℃和30 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取單菌落進行培養(yǎng)，將純化后的細菌溶于15%甘油，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 16S rDNA序列擴增及鑒定

參考Takara試劑盒說明書，對純化后的潛在病原菌進行DNA提取。以DNA為模板，使用Taq酶，上游引物P1: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物P2: 5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′建立50 μL擴增體系。

PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認后送測序公司進行測序，獲得的測序結(jié)果在美國國立生物技術信息中心進行BLAST比對分析。

1.8 感染試驗

試驗前隨機解剖10尾大黃魚進行細菌分離，在確保無潛在感染風險的情況下，挑選健康、有活力的大黃魚作為人工感染試驗用魚。病原菌分離共獲得優(yōu)勢菌株10株，經(jīng)序列鑒定和生化鑒定為同一種菌，故從10株潛在病原菌中選取1株菌株，命名為ND2018，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，并在30 ℃條件下培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)好的菌液于3000 r/min條件下離心5 min，將去除上清液的菌液用生理鹽水洗脫，制成密度1×103～1×107cfu/mL的菌懸液備用。

試驗共設5個試驗組和1個對照組，每組桶裝海水800 L與健康大黃魚15～35尾。采用腹腔注射法進行感染試驗，試驗組設置5組菌液密度，分別為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103cfu/mL，對照組采用無菌生理鹽水(0.75% NaCl)，注射劑量均為0.2 mL/尾。水溫控制在18～20 ℃，其間充氧、不投餌、日常清污、換水，連續(xù)觀察10 d，記錄大黃魚的死亡與發(fā)病情況，對死亡大黃魚進行解剖觀察，并再次進行病原菌分離鑒定。

1.9 病原菌全基因測序及分析

取ND2018單個菌落過夜培養(yǎng)。5 mL菌液9000 r/min離心10 min，去除上清液后將樣品在干冰條件下委托百邁克生物科技公司進行全基因組測序。基因組數(shù)據(jù)組裝后通過CLC Genomics Workbench 20.0.2軟件讀取。

1.10 病原菌理化特性試驗

參考文獻[8]對菌株ND2018進行生理生化鑒定。挑取新鮮的待測單個菌落制成菌懸液加入到試劑條中，根據(jù)API-20E生化鑒定試劑盒說明書，將試劑條置于28 ℃培養(yǎng)，24 h進行顏色變化記錄，48 h后對顏色變化進行比對和確定。試驗結(jié)果通過梅里埃API鑒定軟件進行分析。

1.11 病原菌藥敏試驗

參考文獻[12]對病原菌進行紙片擴散法藥敏試驗，取100 μL過夜培養(yǎng)的菌株ND2018菌液與2216E軟瓊脂(0.8%瓊脂)充分混勻，倒入事先制備好的平板，待冷卻凝固后貼上不同的藥敏紙片，30 ℃培養(yǎng)36 h后參考臨床實驗室標準化協(xié)會抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準判定敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織病理

觀察發(fā)病的網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚，病魚體表無明顯癥狀，偶見潰瘍、腹部腫脹，解剖有黃綠色腹水，脾臟、腎臟和肝臟可見明顯白色肉芽腫組織結(jié)節(jié)，直徑1.0～2.0 mm(圖1)。與正常大黃魚相比，患病大黃魚的內(nèi)臟組織均出現(xiàn)明顯病變癥狀：病魚肝臟出現(xiàn)炎癥反應，大量炎性細胞浸潤，將病原菌團包圍形成近圓形病灶部位，病灶附近可見大量空泡(圖2a)；脾臟組織被嚴重破壞，炎癥細胞將病原菌與大量壞死細胞包圍形成大小不等的結(jié)節(jié)，經(jīng)蘇木精—伊紅染色為深紫色，髓竇內(nèi)沉積大量含鐵血黃素(圖2b)；腎臟病變嚴重，腎小球崩解，腎小管上皮細胞界限模糊、排列紊亂、失去原有結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域出現(xiàn)病原菌與壞死細胞混合形成的圓形結(jié)節(jié)(圖2c)，放大1000倍，可見大量短桿狀細菌(圖2d)。由此可見，大黃魚內(nèi)臟出現(xiàn)結(jié)節(jié)是由細菌所致。

圖1 患病大黃魚內(nèi)臟白點癥狀Fig.1 Symptoms of visible white nodules in diseased large yellow croaker P. crocea

圖2 病魚內(nèi)臟組織病理變化Fig.2 Pathological changes in visceral tissues in diseased large yellow croaker P. croceaa.病魚肝臟結(jié)節(jié)； b.病魚脾臟結(jié)節(jié)及含鐵血黃素沉積； c.病魚腎臟結(jié)節(jié)； d.1000×顯微鏡下病原菌(箭頭所示).a.nodule in liver; b.hemosiderin deposition and nodule in spleen; c.nodule in kidney; d.bacteria inside in flamed tissue under a microscope (arrow) (×1000).

2.2 宏基因測序結(jié)果

采用宏基因組測序技術，對健康大黃魚和發(fā)病大黃魚不同內(nèi)臟組織以及養(yǎng)殖海水的菌群分布進行對比分析，結(jié)果見圖3。網(wǎng)箱養(yǎng)殖健康大黃魚的菌落主要以青枯菌屬(Ralstonia)細菌為主，而發(fā)病的大黃魚主要以假單胞菌屬(Pseudonomas)細菌為主。這兩類菌群均與養(yǎng)殖海水的主要菌群[伯克霍爾德菌(Burkholderia)]存在顯著性差異。由此初步判定網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌為假單胞菌屬細菌。

圖3 患病、健康大黃魚以及外界海水的菌群分布Fig.3 Bacterial distribution among diseased and healthy large yellow croaker P. crocea and in sea waterCBL.病魚的肝臟； CBS.病魚的脾臟； CBK.病魚的腎臟； CBG.病魚的腸道； CL.健康魚的肝臟； CS.健康魚的脾臟； CK.健康魚的腎臟； CG.健康魚的腸道； MO.自然海水濾膜.CBL.liver of diseased fish; CBS.spleen of diseased fish; CBK.kidney of diseased fish; CBG.gut of diseased fish; CL.liver of healthy fish; CS.spleen of healthy fish; CK.kidney of healthy fish; CG.gut of healthy fish; MO.filter membrane of natural sea water in farming area.

2.3 菌株分離

通過直接培養(yǎng)大黃魚白色結(jié)節(jié)病變組織，分離純化共獲得10株菌株。經(jīng)16S rDNA測序后鑒定該10株菌株與惡臭假單胞菌、變形假單胞菌、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、蒙氏假單胞菌(P.monteilii)的同源性均超99%。將上述10株菌株的基因序列進行互相多重對比，結(jié)果顯示，其同源性均高達99%以上，且10株菌株理化特性結(jié)果一致(菌株理化特性見2.6)，說明10株分離菌株可能為同一種細菌。

2.4 攻毒試驗

用腹腔注射法將菌株ND2018注射到健康大黃魚體內(nèi)觀察10 d(表1)。試驗前期(攻毒1～2 d)，死亡的大黃魚經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟均未見白色結(jié)節(jié)，這些魚類的死亡可能由應激反應所致，因此，該部分非正常死亡數(shù)據(jù)未計算到結(jié)果中。攻毒后期(3～10 d)死亡大黃魚經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟組織相繼出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)癥狀，該癥狀同自然海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚發(fā)病癥狀相似，且從病魚脾臟、腎臟中再次分離的細菌經(jīng)16S rDNA分子鑒定與菌株ND2018一致。對照組與低密度感染組(1×103cfu/mL)中大黃魚死亡率與結(jié)節(jié)出現(xiàn)率相近，死亡率分別為86.0%與84.2%，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率分別為7.1%與10.5%。當菌液感染密度提高時，大黃魚結(jié)節(jié)出現(xiàn)比例也增高。菌液密度為1×104cfu/mL時，大黃魚死亡率為73.3%，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率為20.0%，死亡大黃魚中結(jié)節(jié)癥狀的比例自攻毒8 d起開始增加。當菌液密度高于1×104cfu/mL時，隨著密度的增加，死亡大黃魚出現(xiàn)結(jié)節(jié)癥狀的時間更早，結(jié)節(jié)比例增加更快，大黃魚存活天數(shù)更短。1×105cfu/mL時，大黃魚死亡率為91.0%，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率為39.4%，結(jié)節(jié)比例從攻毒6 d起開始增加；1×106cfu/mL時，大黃魚死亡率為91.2%，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率為53.0%，結(jié)節(jié)比例從攻毒5 d起開始增加；1×107cfu/mL時，大黃魚死亡率為100%，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率為63.3%，結(jié)節(jié)比例從攻毒4 d起開始增加。大黃魚死亡率與結(jié)節(jié)出現(xiàn)率均與菌液密度呈顯著正向相關，由此可以判定菌株ND2018是大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌。

表1 分離菌株ND2018人工感染試驗Tab.1 Artificial infection test of isolated strain ND2018

2.5 全基因測序鑒定

為進一步確定引起大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌，本試驗基于三代測序技術平臺，對菌株ND2018進行鑒定。測序結(jié)果得到菌株ND2018序列全長約為5.5 Mb，G+C含量為62.7%。與Huang等[16-17]發(fā)布的變形假單胞菌NB2011、NZBD9全基因序列的同源性均達到99.9%。同時利用Nr非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析得出，菌株ND2018與變形假單胞菌的同源性最高(圖4)。因此，可以說明菌株ND2018為變形假單胞菌。

圖4 菌株ND2018的Nr數(shù)據(jù)庫同源物種分布Fig.4 Nr homologous species distribution of strain ND2018

2.6 理化特性

利用API方法對變形假單胞菌ND2018進行生理生化反應分析。試驗結(jié)果顯示(表2)，變形假單胞菌ND2018利用檸檬酸鈉鹽，精氨酸水解酶呈陽性，羥基丁酮產(chǎn)生乙酰甲基甲醇反應呈陽性，氧化酶呈陽性，硝酸鹽還原呈陽性，半乳糖苷酸、鳥氨酸、吲哚等反應呈陰性。這些代謝能力均符合假單胞菌屬細菌的生化代謝特性。經(jīng)法國梅里埃API-20E鑒定軟件分析，分離菌株與熒光假單胞菌或惡臭假單胞菌的陽性率為94.1%。

表2 變形假單胞菌ND2018的生理生化特性Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of strain ND2018

2.7 藥敏試驗

變形假單胞菌ND2018藥敏試驗涉及糖肽類、脂肽類、磺胺類、氯霉素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、青霉素類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基呋喃類、安沙霉素類、香豆素類共12類26種抗生素，其中包括國務院獸醫(yī)行政管理部門批準的水產(chǎn)用獸藥。結(jié)果顯示，變形假單胞菌ND2018對氨基糖苷類的新霉素、卡那霉素，硝基呋喃類的呋喃唑酮，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星，磺胺類的復方磺胺，以及脂肽類的多黏菌素B敏感，對利福平等20種抗生素耐藥(表3)。變形假單胞菌ND2018對同類中的不同抗生素藥物敏感性存在差異，如氟喹諾酮類對菌株的抑菌圈直徑均大于藥敏片自身直徑(7.0 mm)，其中環(huán)丙沙星抑菌圈直徑最大，但根據(jù)標準抑菌圈直徑判定，變形假單胞菌ND2018只對環(huán)丙沙星敏感，對恩諾沙星、氧氟沙星等其他氟喹諾酮類耐藥。

表3 變形假單胞菌ND2018的藥物敏感性試驗結(jié)果Tab.3 Antibiotic susceptibility test of strain ND2018

3 討 論

3.1 網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚內(nèi)臟白點病病原菌鑒定

近年來，我國東海海域大黃魚養(yǎng)殖屢現(xiàn)內(nèi)臟白點病，其高死亡率導致大黃魚產(chǎn)業(yè)損失慘重[18]。因此，分離鑒定引起大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌對大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有一定保護作用。許多學者對大黃魚內(nèi)臟白點病進行了病原菌分離鑒定，但分離鑒定結(jié)果存在一定分歧。早期研究認為其病原菌為銅綠假單胞菌[2]，后期研究一部分認為是惡臭假單胞菌[4-9]，另一部分研究認為其病原菌為變形假單胞菌，因其最早是從香魚(Plecoglossusaltivelis)中分離鑒定的一個新種，故又稱殺香魚假單胞菌(P.plecoglossicida)[10-15]。本試驗首次利用宏基因組測序技術，避免采樣過程中造成的污染以及病原菌人工培養(yǎng)分離過程中的偏差等問題，增加了大黃魚內(nèi)臟白點病病原菌鑒定結(jié)果的可靠性。同時，通過全基因測序?qū)闚D2018進行鑒定，確定其為變形假單胞菌，結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法(如16S rRNA和生理生化反應等)，提高了鑒定結(jié)果的準確性。

3.2 病原菌的毒力結(jié)果分析

試驗組與對照組死亡率較高，均出現(xiàn)無結(jié)節(jié)癥狀死亡情況，這可能是由于其他應激反應導致的非正常死亡，不能直接判定為病原菌導致的死亡。但是隨著菌液密度的升高，試驗組中大黃魚出現(xiàn)結(jié)節(jié)癥狀的比例顯著增加，結(jié)節(jié)出現(xiàn)率與菌液密度呈顯著正相關。因此即使存在非病原菌導致的死亡現(xiàn)象，仍能說明攻毒用菌是大黃魚內(nèi)臟白點病的病原菌。本試驗通過計算結(jié)節(jié)出現(xiàn)率代替死亡率作為細菌致病性判定標準，避免了系統(tǒng)誤差，增加了數(shù)據(jù)的可信度。值得注意的是，大黃魚內(nèi)臟白點病發(fā)病時間隨著菌液密度的升高逐步縮短，高密度組在早期就出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，1×106cfu/mL和1×107cfu/mL試驗組中大黃魚分別在攻毒的第4天和第5天開始出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，且結(jié)節(jié)出現(xiàn)率高于50.0%。而104cfu/mL試驗組在攻毒第9天時才出現(xiàn)大規(guī)模死亡情況，低密度試驗組(1×103cfu/mL)出現(xiàn)死亡情況不明顯，說明病原菌密度是影響大黃魚內(nèi)臟白點病的關鍵，隨著時間推移，魚體內(nèi)病原菌大量繁殖，密度增加，病原菌突破宿主防線，病魚內(nèi)臟出現(xiàn)肉芽腫結(jié)節(jié)，致病性得到體現(xiàn)。

本試驗對照組中出現(xiàn)零星白色結(jié)節(jié)癥狀病魚，與低密度試驗組(1×103cfu/mL)的結(jié)節(jié)出現(xiàn)率相當，由此推測部分攻毒試驗所用的健康大黃魚體內(nèi)攜帶有低密度(不表現(xiàn)致病性)的變形假單胞菌，此推測與宏基因組測序結(jié)果相吻合。宏基因組測序結(jié)果顯示，自然海水與健康大黃魚體內(nèi)也有變形假單胞菌分布，進一步推測變形假單胞菌為條件致病菌，廣泛分布于自然海水和健康大黃魚內(nèi)臟中。在一定條件下，當魚體免疫力下降，菌群失衡，變形假單胞菌大量暴發(fā)，在密度達到1×104cfu/mL以上時，毒力增強，內(nèi)臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)，致病性得到體現(xiàn)，而當病原菌密度較低時，不表現(xiàn)出致病性，可以同宿主共生。從試驗前期采集樣本和數(shù)據(jù)情況看，大黃魚內(nèi)臟白點病多暴發(fā)于冬末春初，由于養(yǎng)殖海域水溫低(14～18 ℃)[2]，大黃魚攝食能力降低，魚體免疫力減弱，導致變形假單胞菌大量生長，通過血液循環(huán)進入脾臟、腎臟和肝臟等器官，組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，受病原菌入侵的靶器官組織結(jié)構(gòu)病變嚴重，組織崩解，含鐵血黃素沉積，大量變形假單胞菌在細胞間積聚，入侵細胞內(nèi)部，造成魚體生理代謝紊亂，最終導致魚體無法維持正常生命活動而死亡，該結(jié)論與張丹楓等[19]的研究結(jié)論一致。

3.3 病原菌的理化特性與耐藥性結(jié)果分析

本試驗分離的變形假單胞ND2018與近年來不同學者分離的病原菌相似[10-15]，但在理化特性與耐藥性上存在差異。理化特性上與許斌福等[8]分離的變形假單胞菌H2013032002相比，變形假單胞ND2018多了一個羥基丁酮產(chǎn)生乙酰甲基甲醇指標呈陽性，與劉年鋒等[15]分離的變形假單胞菌dhy201308不同的是葡萄糖氧化呈陰性，說明同一種屬細菌內(nèi)的不同菌株在不同生長環(huán)境中存在一定差異。這可能導致病原菌代謝情況出現(xiàn)突變，從而加速病原菌正向或者反向進化。病原菌獲取和重組外源DNA通常會引起菌株產(chǎn)生耐藥性。胡嬌等[12]從寧德漁排分離的變形假單胞菌對慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、強力霉素、鏈霉素、四環(huán)素等7種藥物敏感；劉年鋒等[15]從福州養(yǎng)殖網(wǎng)箱分離的變形假單胞菌對強力霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、奧氟沙星與四環(huán)素敏感；相比之下，變形假單胞ND2018耐藥譜最廣，對強力霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素以及大部分氟喹諾酮類不敏感，其中最為顯著的是氟喹諾酮類抗生素。與已有研究不同，本試驗分離的菌株ND2018除了對環(huán)丙沙星敏感，對氧氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星等氟喹諾酮類抗生素均不敏感，這說明變形假單胞菌ND2018對氟喹諾酮類抗生素產(chǎn)生了耐藥性。原因可能為：2017年之前，氧氟沙星、諾氟沙星等氟喹諾酮類抗生素不屬于水產(chǎn)禁用藥，生產(chǎn)過程中大量使用致使病原菌產(chǎn)生耐藥性。變形假單胞菌ND2018對新霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、環(huán)丙沙星、復方磺胺以及多黏菌素B敏感，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2019年1號》以及NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準則》文件，呋喃唑酮、環(huán)丙沙星屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖禁藥；根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2019年2號》批準水產(chǎn)用藥名單，國務院獸醫(yī)行政部門已批準的水產(chǎn)用藥總共5類12種，而變形假單胞ND2018對其中的氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星均不敏感，而變形假單胞菌ND2018敏感的多黏菌素B和卡那霉素又非常用水產(chǎn)養(yǎng)殖獸用藥。病原菌的耐藥性以及水產(chǎn)用藥抗生素的局限性使得水產(chǎn)養(yǎng)殖動物在疾病暴發(fā)過程中用藥無效，無藥可用，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)，因此尋求能夠代替抗生素治療大黃魚內(nèi)臟白點病的健康藥物迫在眉睫。

4 結(jié) 論

本試驗首次通過宏基因組測序技術對患病大黃魚內(nèi)臟組織中菌落變化進行比較，并對病原菌進行全基因組序列分析，最終確定內(nèi)臟白點病病原菌為變形假單胞菌。變形假單胞菌為條件病原菌，其菌液密度是導致大黃魚內(nèi)臟白點病的關鍵，當密度高于1×104cfu/mL時，病原菌突破宿主防線，病魚內(nèi)臟出現(xiàn)肉芽腫白色結(jié)節(jié)，即患內(nèi)臟白點病。定期對大黃魚體內(nèi)變形假單胞菌進行定量分析，適時對細菌增長進行干預，可為大黃魚內(nèi)臟白點病早期預防提供新方案。藥敏試驗結(jié)果顯示，變形假單胞菌ND2018對水產(chǎn)常用藥氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星等產(chǎn)生耐藥性，依賴抗生素對內(nèi)臟白點病進行防控效果不佳，同時抗生素藥物殘留影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應注重科學防范，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高魚體免疫力，同時要深入開發(fā)新藥物，減少病害治療中抗生素的使用，走健康可持續(xù)養(yǎng)殖道路。