竇 勇，吳 琳，閆永芳，任虹燁，陳家宇，喬之怡，翟勝利，周文禮

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384； 2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)，天津 301802 )

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞微藻，在分類學(xué)上屬綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬[1]。其生活史主要分為游動(dòng)細(xì)胞階段和不動(dòng)細(xì)胞階段。在外界環(huán)境條件適宜時(shí)，微藻以游動(dòng)狀態(tài)存在，依靠?jī)蓷l頂生、等長(zhǎng)的鞭毛運(yùn)動(dòng)，這一階段的細(xì)胞大多呈綠色，此時(shí)微藻生長(zhǎng)旺盛，生物量積累迅速[2]。當(dāng)雨生紅球藻處于高光照度、高鹽度及營(yíng)養(yǎng)缺乏的脅迫條件時(shí)，細(xì)胞以紅色厚壁孢子形式存在，此階段細(xì)胞鞭毛脫落，運(yùn)動(dòng)能力喪失，開始逐漸合成并積累蝦青素[3]。

蝦青素是一種脂溶性的次級(jí)類胡蘿卜素，屬于萜烯類的不飽和化合物[4]。蝦青素是目前為止在自然界有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強(qiáng)的物質(zhì)，它清除自由基和單線態(tài)氧淬滅的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維生素E，比玉米黃質(zhì)、番茄紅素及β胡蘿卜素等常見(jiàn)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力高10倍以上，此外蝦青素還具有抑制腫瘤、提高免疫力的作用，目前被用作保健品輔料和食品添加劑[5-7]。蝦青素還有良好的著色效果，可以進(jìn)入生物體并貯存在組織中，農(nóng)業(yè)部2003年[318]號(hào)公告中指定天然蝦青素為水產(chǎn)動(dòng)物唯一著色劑[8-9]。雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量占細(xì)胞干質(zhì)量的1.5%～4.0%，而且全部是高生物活性的3S，3′S形態(tài)，因此被公認(rèn)為是自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳“生物反應(yīng)器”[10]。深入了解雨生紅球藻合成、積累蝦青素的分子基礎(chǔ)，探索人工誘導(dǎo)雨生紅球藻合成蝦青素的技術(shù)手段，對(duì)于利用雨生紅球藻這一“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)天然蝦青素具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 雨生紅球藻積累蝦青素的分子基礎(chǔ)

雨生紅球藻在脅迫作用下合成蝦青素的生物化學(xué)途徑雖已得到充分認(rèn)識(shí)，但該過(guò)程同時(shí)伴隨著細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變以及生理生化、遺傳網(wǎng)絡(luò)、代謝通路層面的變化，而且這些變化穿插發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，并受到基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾等不同層次的調(diào)節(jié)[11-14]。有文獻(xiàn)指出，通過(guò)蝦青素關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控及酶蛋白翻譯后的活性調(diào)控是實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻蝦青素誘導(dǎo)合成的主要機(jī)制[15]。由此看來(lái)，雨生紅球藻合成蝦青素的生理代謝過(guò)程是極其復(fù)雜的，許多研究人員對(duì)此進(jìn)行了深入研究，逐漸對(duì)該過(guò)程的代謝、遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有了較為清晰的認(rèn)識(shí)，但其中還有許多問(wèn)題目前仍無(wú)法清晰解釋[16-20]。

1.1 與雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的基因、調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄因子

1.1.1 雨生紅球藻全基因組分析

有機(jī)體的所有生命活動(dòng)均可以從基因中得到答案，因此高質(zhì)量的生物全基因組數(shù)據(jù)是探索有機(jī)體生命活動(dòng)規(guī)律最重要的資料。深圳大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)[21]首次完成了雨生紅球藻全基因組測(cè)序、組裝和注釋工作，生成了一份669.0 Mb規(guī)模的基因組草圖(scaffold N50為288.6 kb)，并預(yù)測(cè)了18 545個(gè)基因。研究者還從14個(gè)代表性藻類中建立了穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)育樹種類，并借助轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了雨生紅球藻中一些涉及合成、積累和調(diào)節(jié)蝦青素生產(chǎn)的新型潛在基因，還在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生了高可信度的包含18 483個(gè)轉(zhuǎn)錄本的同工型水平參考轉(zhuǎn)錄組，并通過(guò)選擇性剪接分析證實(shí)內(nèi)含子保留是最普遍的模式，該基因組以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為理論研究和商業(yè)生產(chǎn)提供了可靠的基礎(chǔ)資料。

1.1.2 雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子

全基因組數(shù)據(jù)為厘清雨生紅球藻合成蝦青素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了最基礎(chǔ)的資料，而對(duì)基因組精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析為詳細(xì)描摹該過(guò)程提供了更多的細(xì)節(jié)信息，該方面的工作主要集中于對(duì)關(guān)鍵酶基因非編碼DNA序列(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)等順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子等反式作用元件的研究。Wei等[22]利用凝膠阻滯的方法研究了雨生紅球藻中bkt基因309 bp啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了特異性的核蛋白結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步的分析證實(shí)該位點(diǎn)區(qū)域存在響應(yīng)環(huán)境脅迫因子、對(duì)香豆酸及激素反應(yīng)的G-box。孟春曉[23]借助基因組上游步移技術(shù)克隆了雨生紅球藻bkt基因兩個(gè)不同的5′上游側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)其類似于高等植物脅迫誘導(dǎo)基因中的順式作用元件；定點(diǎn)突變結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APE-like(藍(lán)光調(diào)控元件)對(duì)于bkt基因自身的轉(zhuǎn)錄可能存在影響。進(jìn)一步分別針對(duì)這兩個(gè)不同的5′上游側(cè)翼序列構(gòu)建了一系列缺失突變體，驗(yàn)證了其中可能包含的增強(qiáng)子區(qū)或抑制子區(qū)，同時(shí)證明了1.5 kb大小的5′上游側(cè)翼序列對(duì)應(yīng)ATG下游的第一個(gè)內(nèi)含子可能是控制bkt基因轉(zhuǎn)錄的抑制子。Gao等[24]克隆了雨生紅球藻中crtO基因的3個(gè)不同大小的5′上游側(cè)翼序列(1.1、1.9 kb和2.2 kb)，并利用生物信息學(xué)方法分別預(yù)測(cè)并比較了這3段序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者具有與高等植物相類似的順式作用元件，如脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)、干燥或低溫反應(yīng)元件(DRE/C-repeat)、幾種光反應(yīng)元件(G1-box，GAG-motif，l-boxand ATC-motif)、熱激反應(yīng)元件(HSE)、機(jī)械傷害反應(yīng)元件(WUN-motif)、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件(TGA-element)、茉莉酸甲酯反應(yīng)元件(TGACG-element)和反式作用因子MYB蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(MBS和MRE)等，但三者均不具有典型的TATA和CCAAT框，結(jié)果預(yù)示了雨生紅球藻蝦青素合成過(guò)程中crtO基因調(diào)控方式的多樣化。寧晶晶[25]通過(guò)對(duì)小RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，研究了雨生紅球藻蝦青素合成中的miRNA-TF共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNA和9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素和油脂合成調(diào)控，并進(jìn)一步證實(shí)蝦青素和油脂合成途徑的酶基因既受轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控，也受miRNA的負(fù)調(diào)控，參與兩個(gè)途徑的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA既有相對(duì)獨(dú)立性，還存在著一定的交互作用。脅迫條件下雨生紅球藻積累蝦青素的過(guò)程十分復(fù)雜，除了代謝途徑和遺傳網(wǎng)絡(luò)方面的改變，表觀遺傳學(xué)層面的變化也起了重要作用。張克亞等[26]對(duì)缺氮脅迫0、24、72 h的雨生紅球藻基因組DNA進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析，共得到了291個(gè)甲基化多態(tài)性位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)基因組甲基化率伴隨蝦青素合成發(fā)生顯著變化，這表明DNA甲基化調(diào)節(jié)方式的改變是蝦青素積累過(guò)程中的一種重要調(diào)控模式。

1.2 與雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的重要蛋白質(zhì)

根據(jù)中心法則，有機(jī)體生命活動(dòng)的最終體現(xiàn)者是基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，因此對(duì)生命過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的解析是探求生命活動(dòng)規(guī)律的重要方法。光是環(huán)境中重要的信號(hào)因子，對(duì)真核微藻的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，光不僅提供光合作用所需要的能量，自身也蘊(yùn)含光質(zhì)、光強(qiáng)和光周期等信息[27]。真核微藻通過(guò)光受體感知光照信號(hào)，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控多種生理過(guò)程，包括形態(tài)建成、生物節(jié)律、趨光性以及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成與積累等。有學(xué)者利用同源克隆和RACE技術(shù)結(jié)合的方法獲得了藍(lán)光受體向光素PHOT的cDNA全長(zhǎng)，并借助生物信息學(xué)工具進(jìn)行了其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面的分析研究[28-29]。近年來(lái)研究人員開發(fā)出一系列光遺傳學(xué)元件，通過(guò)光敏蛋白響應(yīng)特定波長(zhǎng)的光，經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)象改變、蛋白間可逆結(jié)合以及聚合反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)特異性生理反應(yīng)，包括(去)激活特異性蛋白活動(dòng)、激活或抑制轉(zhuǎn)錄、亞細(xì)胞定位、局部活性氧生產(chǎn)和其他功能，為研究雨生紅球藻的光響應(yīng)生理及機(jī)制提供了潛在的工具[30]。顧文輝[31]通過(guò)比較雨生紅球藻和鹽藻強(qiáng)光響應(yīng)下類囊體膜蛋白組的變化，發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻對(duì)強(qiáng)光脅迫的適應(yīng)性更強(qiáng)，并推測(cè)雨生紅球藻可能在適應(yīng)強(qiáng)光的過(guò)程中重新調(diào)整了碳流向，并通過(guò)多種機(jī)制參與光保護(hù)以及蝦青素的生物合成。范勇等[32]通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻的質(zhì)體內(nèi)確實(shí)存在質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)——plastoglobules，并通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，從雨生紅球藻cDNA文庫(kù)中克隆到與編碼plastoglobules的結(jié)構(gòu)蛋白Plastoglobulin具有高度同源性的Hpgp基因序列全長(zhǎng)，并進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)將該編碼基因進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，然后用His-Tag蛋白分離純化得到了目標(biāo)蛋白。王坤鵬[33]對(duì)脅迫早期的雨生紅球藻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)高響應(yīng)強(qiáng)光和醋酸鈉脅迫的HpGNAT-1基因進(jìn)行分子克隆及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框長(zhǎng)度為493 bp，同源性分析表明，HpGNAT-1基因的表達(dá)產(chǎn)物可能為N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶，該基因可翻譯成含163個(gè)氨基酸且可能定位于細(xì)胞質(zhì)的蛋白，并推測(cè)該蛋白可能存在4個(gè)α-螺旋和7個(gè)β-折疊，具有N-乙?；D(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域和Rim Ⅰ結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)，并可能通過(guò)與輔酶A結(jié)合作用于核糖體蛋白S18亞基對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。

類泛素化蛋白修飾分子(SUMO)化修飾是一種蛋白翻譯后的修飾方式，其在蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子LBD30通過(guò)SIZ1介導(dǎo)的類泛素化蛋白修飾分子化修飾作用于擬南芥纖維細(xì)胞次生細(xì)胞壁加厚過(guò)程，證實(shí)LBD30的類泛素化蛋白修飾分子化修飾直接對(duì)纖維細(xì)胞壁加厚的轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行調(diào)控，類泛素化蛋白修飾分子化的LBD30促進(jìn)細(xì)胞壁加厚的轉(zhuǎn)錄程序啟動(dòng)[34]。該研究首次發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)類泛素化蛋白修飾分子化修飾在調(diào)控次生細(xì)胞壁形成中的重要功能，揭示了次生細(xì)胞壁形成多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)新途徑。雖然是以高等植物擬南芥為材料，但是該信號(hào)通路具有較高的跨物種保守性，因此為解釋雨生紅球藻響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞壁加厚的生理過(guò)程提供了線索和方向。

2 雨生紅球藻積累蝦青素的人工誘導(dǎo)調(diào)控研究

發(fā)生在雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素生物合成途徑雖然已經(jīng)得到充分認(rèn)識(shí)，但是該途徑的自然合成效率以及底物、能源的利用率均很低，是制約蝦青素規(guī)模化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的“瓶頸”問(wèn)題，因此培養(yǎng)環(huán)境脅迫因子調(diào)控、通過(guò)物理和化學(xué)手段進(jìn)行人工誘變育種、無(wú)機(jī)和有機(jī)碳源加富以及外源刺激物誘導(dǎo)成為提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素能力的常用方法[35-37]。

2.1 培養(yǎng)環(huán)境調(diào)控對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.1.1 光照對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

光照是微藻生命活動(dòng)不可缺少的環(huán)境因子，對(duì)光照條件進(jìn)行有效控制可以促進(jìn)雨生紅球藻合成、積累蝦青素。有研究證實(shí)，不同光質(zhì)對(duì)雨生紅球藻的誘導(dǎo)效果不同[38]，紅光有利于雨生紅球藻生長(zhǎng)，藍(lán)光有助于雨生紅球藻積累蝦青素，此外連續(xù)光照較光暗交替更利于蝦青素積累[7]。江紅霞等[39]研究了不同光強(qiáng)和光周期對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響，發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量隨光強(qiáng)上升而提高，在270 μmol/(m2·s)的光強(qiáng)條件下連續(xù)照射10 d雨生紅球藻內(nèi)的蝦青素水平和抗氧化能力最高。Ma等[40]使用150 μmol/(m2·s)的白光LED和70 μmol/(m2·s)的藍(lán)光LED對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行脅迫，結(jié)果表明，兩種光照條件下微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素和總脂肪酸含量顯著上升，與色素合成及脂質(zhì)積累相關(guān)的基因psy、crtO、bkt2、lcy、crtR-B、fata和dgat表達(dá)量明顯上調(diào)。

2.1.2 鹽度對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

有研究表明，高鹽度脅迫是刺激雨生紅球藻積累蝦青素的有效手段[41-43]。黃水英等[44]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不大于10 g/L的NaCl可以顯著促進(jìn)雨生紅球藻合成并積累蝦青素。Boussiba等[45]證實(shí)，將雨生紅球藻培養(yǎng)基中的NaCl含量提高3倍時(shí)，微藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素水平較原來(lái)提升了121%。江紅霞等[46]發(fā)現(xiàn)，使用0.12 mol/L的NaCl處理雨生紅球藻，可以使其細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量、非特異性免疫活力以及與蝦青素合成相關(guān)的lcy、crtR-B和bkt基因表達(dá)量顯著提高，證實(shí)了雨生紅球藻在高鹽脅迫下主要是通過(guò)提高蝦青素合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)促進(jìn)蝦青素合成，并與非特異性免疫系統(tǒng)中的抗氧化酶互相協(xié)作，降低細(xì)胞遭受高鹽脅迫引起的損傷。雖然高鹽度會(huì)促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素，但是鹽度過(guò)高會(huì)影響微藻正常的生命活動(dòng)，因此在實(shí)際操作中需要在雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累之間權(quán)衡選擇合適的處理鹽度。

2.1.3 營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

營(yíng)養(yǎng)缺乏作為環(huán)境脅迫因子，可以誘導(dǎo)雨生紅球藻合成與積累蝦青素，而缺素培養(yǎng)在天然蝦青素生產(chǎn)過(guò)程中也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。楊瑾等[47]發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻CG-06株細(xì)胞內(nèi)的色素積累量和積累速率均與初始硝態(tài)氮含量呈反比，缺氮條件下雨生紅球藻CG-06積累蝦青素的峰值時(shí)間較對(duì)照組提前6 d，峰值水平較對(duì)照組提高0.78 μg/mg。莊惠如等[48]將BBM培養(yǎng)基中的氮源NaNO3質(zhì)量濃度減半時(shí)(0.13 g/L)，發(fā)現(xiàn)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞增殖和蝦青素累積均有利，在高光強(qiáng)下進(jìn)一步進(jìn)行氮、磷饑餓脅迫時(shí)，微藻細(xì)胞分裂明顯受到抑制，但細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量分別較對(duì)照組提高141.0%和60.5%，色素累積高峰也提前2～4 d，顯示了營(yíng)養(yǎng)虧缺對(duì)蝦青素合成與積累的促進(jìn)作用。雖然營(yíng)養(yǎng)虧缺有利于雨生紅球藻積累蝦青素，但有學(xué)者證實(shí)，當(dāng)培養(yǎng)體系中同時(shí)缺少磷、鎂和鐵元素時(shí)，雨生紅球藻細(xì)胞光化學(xué)效率下降，光系統(tǒng)能量分配發(fā)生改變，生長(zhǎng)受到抑制[49]。由此看來(lái)，不同元素在雨生紅球藻生命活動(dòng)中的作用不同，缺氮培養(yǎng)是誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素的適宜途徑，而磷與金屬元素在雨生紅球藻培養(yǎng)中是不可缺少的。

2.1.4 雨生紅球藻積累蝦青素的培養(yǎng)工藝優(yōu)化

培養(yǎng)條件下影響雨生紅球藻積累蝦青素的環(huán)境因子很多，許多學(xué)者對(duì)雨生紅球藻的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在確定最有利于蝦青素積累的培養(yǎng)條件組合。李嘉儀等[50]研究了光照強(qiáng)度、NaNO3濃度和NaCl濃度對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的作用，發(fā)現(xiàn)脅迫因子的影響能力為NaCl濃度>光照強(qiáng)度>NaNO3濃度，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到積累蝦青素的最佳條件，此時(shí)蝦青素產(chǎn)量為6.8 mg/L。Su等[51]評(píng)估了乙酸鹽、Fe2+和強(qiáng)光3種脅迫條件的各種組合對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響，并基于GC-MS的代謝組測(cè)定和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)構(gòu)建了代謝網(wǎng)絡(luò)，為人工誘導(dǎo)雨生紅球藻合成與積累蝦青素提供了一定的數(shù)據(jù)支持。陶云瑩[52]研究了多種環(huán)境因子對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)、蝦青素及內(nèi)源激素積累的影響，結(jié)果表明，“23 ℃+200 μmol/(m2·s)”的培養(yǎng)條件最適合雨生紅球藻生長(zhǎng)，而“27 ℃+200 μmol/(m2·s)”最適合蝦青素和內(nèi)源脫落酸合成，此外酸堿脅迫都能促進(jìn)雨生紅球藻中脫落酸的積累，但是弱堿性環(huán)境適合微藻生長(zhǎng)，而堿性環(huán)境適合蝦青素的積累。Wan等[53]創(chuàng)造性地提出了“異養(yǎng)—稀釋—光誘導(dǎo)”的串聯(lián)培養(yǎng)模式，首先通過(guò)異養(yǎng)培養(yǎng)提高雨生紅球藻細(xì)胞密度，然后稀釋至合適密度并切換至微藻適應(yīng)的環(huán)境，最后使用高光照誘導(dǎo)微藻積累蝦青素，通過(guò)此種策略每升培養(yǎng)液中的雨生紅球藻細(xì)胞干質(zhì)量可以達(dá)26 g，在異養(yǎng)期微藻生產(chǎn)力高達(dá)64.1 mg/(L·h)，此時(shí)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的4.6%。

2.2 人工誘變對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.2.1 物理誘變因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

在實(shí)際操作中常用高能射線、激光、紫外線和低溫等離子體對(duì)雨生紅球藻基礎(chǔ)藻株進(jìn)行誘變育種，以獲得高積累蝦青素和油脂等次級(jí)代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)藻株。李珂[54]使用60Co-γ射線核誘變顯著提高了雨生紅球藻的生長(zhǎng)固碳速率和蝦青素含量，突變?cè)逯甑纳L(zhǎng)速率較野生株提高了28.6%，而蝦青素質(zhì)量濃度和油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別由19.5 mg/L和36.1%提高至46.0 mg/L和45.9%。劉京華[55]采用大氣壓介質(zhì)阻擋放電(DBD)對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變以獲得髙產(chǎn)蝦青素的突變?cè)逯?，并建立了基于紅外和拉曼顯微光譜成像技術(shù)的高產(chǎn)蝦青素突變?cè)逯昕鞕z方法，能夠在微觀尺度上對(duì)蝦青素等次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速定量分析。田燕[56]采用Nd：YAP激光為誘變劑，獲得了生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、目標(biāo)產(chǎn)物含量高的優(yōu)良雨生紅球藻藻株。劉峰[57]采用紫外線誘變的方法，獲得了兩株生物量和蝦青素含量均較高的突變?cè)逯?，與出發(fā)藻株比，突變株的生長(zhǎng)速度與蝦青素含量提高了4.5%～18.9%。Chen等[58]使用低溫等離子體處理得到高積累蝦青素的雨生紅球藻突變株M3，M3具備更高的CO2同化率，而qRT-PCR結(jié)果顯示，M3通過(guò)調(diào)節(jié)葉綠體呼吸途徑和提高非光合色素(葉黃素、β胡蘿卜素和蝦青素)含量有效地緩解了光氧化損傷。韓國(guó)研究人員使用100 mA(25 V電壓)的電流對(duì)培養(yǎng)瓶中的雨生紅球藻進(jìn)行持續(xù)刺激，發(fā)現(xiàn)處理組的微藻細(xì)胞密度較對(duì)照組提高1.2倍，蝦青素產(chǎn)量提高10%，最高可達(dá)32.6 mg/L[59]。

2.2.2 化學(xué)誘變因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

化學(xué)誘變相比于物理誘變，能耗和成本較低，是改善微藻品系經(jīng)濟(jì)性狀的理想手段，常用的誘變劑有烷化劑和疊氮化物等。沈國(guó)明等[60]用不同質(zhì)量濃度的烷化劑——亞硝基胍對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)2.5 g/L的亞硝基胍誘導(dǎo)下，雨生紅球藻的增長(zhǎng)速率和細(xì)胞內(nèi)積累的蝦青素質(zhì)量濃度最高，分別為(0.381±0.0289) mg/L和(2.9±0.29) mg/L，而3.5 g/L的亞硝基胍會(huì)嚴(yán)重影響雨生紅球藻的葉綠素合成，造成藻體脫色，由此可見(jiàn)選擇適宜的質(zhì)量濃度是進(jìn)行化學(xué)誘變的關(guān)鍵步驟。孫延紅[61]用甲基磺酸乙酯和疊氮鈉對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.02%甲基磺酸乙酯誘變10 d后，分離得到的誘變株的蝦青素水平較出發(fā)株提高40%，而經(jīng)200 mg/L 疊氮鈉誘變24 h后，分離得到的誘變株的生物總量較出發(fā)株提高43%，而蝦青素產(chǎn)量未顯著提升，這說(shuō)明不同的誘變劑可能具有不同的作用機(jī)制，其對(duì)雨生紅球藻的影響也表現(xiàn)出明顯的差異。

2.3 外加CO2或其他有機(jī)碳源物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.3.1 外加CO2對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻除了可以進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)之外，還能在外加CO2的條件下提高光合速率和能量生產(chǎn)，從而加快生物量和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累。Cheng等[62]在雨生紅球藻培養(yǎng)體系中外加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CO2處理，發(fā)現(xiàn)在添加6% CO2的條件下，雨生紅球藻的生物量和積累蝦青素的水平最高。Christian等[63]在雨生紅球藻紅色細(xì)胞階段將CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至5%和15%，改變了培養(yǎng)體系的C、N平衡，此時(shí)雨生紅球藻積累了較對(duì)照組高2～3倍的蝦青素。李珂[54]發(fā)現(xiàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% CO2誘導(dǎo)時(shí)，雨生紅球藻代謝通路中的碳固定、糖酵解、丙酮酸代謝、脂肪酸和類胡蘿卜素合成途徑比空氣條件下明顯增強(qiáng)，與油脂代謝和蝦青素合成相關(guān)的酶表達(dá)量上調(diào)2.9～18.4倍，而最終收獲的蝦青素和油脂含量分別達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的3.6%和31.8%。以上研究結(jié)果反映了不同雨生紅球藻株對(duì)CO2耐受性的差異，也提示研究者在實(shí)際操作中要根據(jù)研究對(duì)象自身生理特性的差異選擇適宜的CO2添加水平。

2.3.2 外加其他有機(jī)碳源物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻在外源有機(jī)碳源存在的情況下可以進(jìn)行異養(yǎng)生活，提高自身生物量和產(chǎn)物積累，因此添加外源碳源是促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和積累蝦青素的有效手段。陳俊琳[64]以乙酸鈉和丙酮酸鈉作為外加碳源，并設(shè)計(jì)不同的添加策略，結(jié)果表明，同時(shí)添加兩種碳源時(shí)，雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素質(zhì)量濃度為10.836 mg/L，而首先添加丙酮酸鈉作為轉(zhuǎn)化碳源，轉(zhuǎn)化8 d后更換乙酸鈉為轉(zhuǎn)化碳源時(shí)，雨生紅球藻蝦青素質(zhì)量濃度為10.887 mg/L。有研究表明，添加外源葡萄糖有助于促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和積累蝦青素，同時(shí)還可以提高微藻細(xì)胞中內(nèi)源激素如脫落酸、赤霉素和吲哚乙酸的合成[52]。

2.4 外源刺激物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.4.1 外源有機(jī)物對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

使用小分子有機(jī)物作為外源刺激物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而改變微藻的代謝途徑以促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成，是獲得蝦青素和脂質(zhì)等次級(jí)代謝產(chǎn)物的常用手段。尚敏敏等[65]研究證實(shí)，添加外源黃腐酸可以顯著影響雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累；當(dāng)黃腐酸質(zhì)量濃度為5 mg/L，藻細(xì)胞生物量達(dá)到了79.39 mg/(L·d)，蝦青素質(zhì)量濃度達(dá)20.82 mg/L，分別較對(duì)照提高4.25%和86.89%；當(dāng)黃腐酸質(zhì)量濃度為10 mg/L，藻細(xì)胞的生物量產(chǎn)率和蝦青素產(chǎn)量分別較對(duì)照提高5.44%和9.78%。岳陳陳等[66]發(fā)現(xiàn)，在高光照度和缺氮脅迫條件下，外源添加10 μmol/L褪黑素可有效提高雨生紅球藻LUGU中蝦青素的含量，最高可達(dá)31.32 mg/g，是對(duì)照組的2.36倍，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平受到抑制，而信號(hào)分子一氧化氮和水楊酸含量顯著上調(diào)，此外dxs基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯提高，說(shuō)明在非生物脅迫條件下，雨生紅球藻中蝦青素的大量積累可能與外源褪黑素調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧、信號(hào)分子及基因表達(dá)有關(guān)。Ding等[67]發(fā)現(xiàn)，叔丁基羥基茴香醚處理可以使雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素的含量較對(duì)照提高2.17倍，脂質(zhì)含量提高1.22倍，叔丁基羥基茴香醚處理可同時(shí)降低微藻碳水化合物和蛋白質(zhì)合成，并延遲葉綠素降解；后續(xù)的代謝組學(xué)分析表明，叔丁基羥基茴香醚上調(diào)并激活了涉及細(xì)胞基礎(chǔ)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的生物過(guò)程(如糖酵解、三羧酸循環(huán)，氨基酸代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng))，從而增強(qiáng)了微藻的蝦青素和脂質(zhì)積累能力。Liu等[68]發(fā)現(xiàn)，0.4%的乙醇通過(guò)誘導(dǎo)雨生紅球藻的茉莉酸甲酯通路，引發(fā)微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和生理屬性改變，同時(shí)顯著提高細(xì)胞內(nèi)蝦青素積累，進(jìn)一步的研究證實(shí)蝦青素的積累抵消了乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫。Lu等[69]用外源植物激素甲基茉莉酮酸酯和赤霉素處理雨生紅球WB-1藻株，發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素水平顯著提高；通過(guò)分子生物學(xué)手段在bkt1基因的5′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了典型的赤霉素A3響應(yīng)順式元件；結(jié)果表明，雨生紅球藻合成蝦青素的過(guò)程可能受到內(nèi)、外源激素的調(diào)控。

2.4.2 外源無(wú)機(jī)物對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

近年來(lái)的研究表明，一些無(wú)機(jī)小分子可以作為雨生紅球藻合成蝦青素的誘導(dǎo)因子，起到顯著促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的作用。有研究表明，F(xiàn)e2+和二鹽酸鹽可以分別為蝦青素合成提供氧化誘導(dǎo)劑HO·和AO2·，從而提高雨生紅球藻積累蝦青素的水平[70]。于馨恒[71]發(fā)現(xiàn)，H2O2和Mg2+處理可以顯著提高雨生紅球藻的生物量和蝦青素積累。Li等[72]證實(shí)，3.0 mmol/L的Na2WO4是促進(jìn)雨生紅球藻積累青蝦素的最適濃度，此時(shí)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量為(49.41±0.13) pg/細(xì)胞，而與蝦青素合成相關(guān)的ipi、psy和bkt基因表達(dá)量也顯著提高。外源無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)大多是雨生紅球藻氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，它們?cè)谟|發(fā)雨生紅球藻抗逆反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)其合成和積累蝦青素，抵御氧化脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害。

3 展 望

目前雖然已經(jīng)掌握了關(guān)于雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素生物合成與積累的大量信息，但仍有許多具體問(wèn)題處于探索階段。如對(duì)蝦青素生物合成過(guò)程中所推測(cè)的某些中間代謝物仍未完全分離和測(cè)定；對(duì)蝦青素生物合成途徑中相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的識(shí)別尚未達(dá)到足夠的分辨率，脅迫誘導(dǎo)引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、級(jí)聯(lián)傳遞途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分還沒(méi)有完全判明。

活性氧和質(zhì)體末端氧化酶參與蝦青素合成的誘導(dǎo)調(diào)控通路的直接證據(jù)目前仍然缺乏。蝦青素生物合成與光合作用之間的關(guān)系一直是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)，但是蝦青素與光系統(tǒng)以及光合電子傳遞鏈各組分之間的相互作用，至今仍未得到完全解析。另外，對(duì)那些發(fā)生在蝦青素大量積累和其他類胡蘿卜素合成之前的早期事件了解甚少，而且對(duì)該過(guò)程中參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子研究也相對(duì)薄弱。

針對(duì)以上問(wèn)題，近年來(lái)在微藻研究領(lǐng)域得到較好應(yīng)用的多組學(xué)meta分析和“轉(zhuǎn)錄因子工程”分析技術(shù)為克服以往的困難提供了強(qiáng)有力的武器，而高性能計(jì)算技術(shù)的發(fā)展也為詳細(xì)破解雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素代謝網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)了希望。而另外一個(gè)值得關(guān)注的方向就是通過(guò)基因工程手段將微藻細(xì)胞內(nèi)涉及蝦青素生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因進(jìn)行克隆和人工改造，然后借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建具有高積累蝦青素能力的高等植物植株，該領(lǐng)域雖然已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但是轉(zhuǎn)基因植株的生物安全性問(wèn)題目前仍然處于爭(zhēng)議之中。