鄭娟善，丁考仁青，李新圃，梁澤毅，張劍搏，杜梅，丁學(xué)智，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730050；3.甘南藏族自治州畜牧工作站，甘肅 合作747000）

木質(zhì)纖維素是自然界最豐富的可再生生物質(zhì)資源，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物纖維約2000億t［1］，其中尚有89%未被利用，相當(dāng)大的一部分按廢棄物處理。農(nóng)作物廢棄原料（如秸稈）大多數(shù)被浪費(fèi)或者露天焚燒，這不僅使大量的生物質(zhì)資源無法價(jià)值化利用，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。為緩解人為溫室氣體（greenhouse gases，GHG）排放量增加造成的全球氣候問題，如何妥善處理農(nóng)作物廢棄原料和農(nóng)業(yè)工業(yè)廢棄物成為實(shí)施新時(shí)代鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略亟待解決的問題［2－3］。近年來隨著世界環(huán)境污染的日益嚴(yán)重和能源危機(jī)的不斷加劇，木質(zhì)纖維素價(jià)值化利用和資源化開發(fā)諸如發(fā)酵生產(chǎn)乙醇和沼氣（甲烷）等潛在再生能源物質(zhì)逐漸成為研究的重點(diǎn)［4－5］。同時(shí)，瘤胃微生物在生物燃料生產(chǎn)中高效降解木質(zhì)纖維素的能力得到廣泛的關(guān)注，以取代不可再生的化石燃料。然而，由于木質(zhì)纖維素在組成和結(jié)構(gòu)上異常的復(fù)雜，其降解需要多種微生物的協(xié)同互作，且微生物的分類和代謝的多樣性以及各種纖維素酶間的協(xié)同降解機(jī)制尚不清晰，在一定程度上嚴(yán)重制約了木質(zhì)纖維素資源的價(jià)值化開發(fā)和利用［6－8］。

反芻動(dòng)物的肉和奶為人類提供高質(zhì)量蛋白質(zhì)、必需礦物元素和脂溶性維生素，同時(shí)也是人類飲食結(jié)構(gòu)中飽和脂肪酸和反式脂肪酸的主要來源［9］，據(jù)統(tǒng)計(jì)，反芻動(dòng)物飼養(yǎng)量約占全球家養(yǎng)動(dòng)物的76%。中國(guó)工程院院士、著名草業(yè)科學(xué)家任繼周等［10］認(rèn)為，未來我國(guó)糧食的壓力并非來自人的口糧，而是飼料用糧，今后應(yīng)以草食家畜代替耗糧型家畜來緩解飼料用糧的壓力。我國(guó)擁有大量的農(nóng)作物副產(chǎn)品（如秸稈），可以有效緩解畜牧業(yè)發(fā)展中糧食和牧草資源供求的矛盾。反芻動(dòng)物瘤胃是自然界高度演化且降解木質(zhì)纖維能力最強(qiáng)的生態(tài)系統(tǒng)之一，大量的微生物相互作用從而有效利用粗飼料中纖維素、半纖維素和非蛋白氮等成分，供機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需要及肉奶的產(chǎn)出［11］，研究表明，利用瘤胃液中分離的菌株接種進(jìn)行厭氧消化可提高玉米（Zea mays）秸稈［12］、小麥（Triticum aestivum）秸稈［13］和稻草的降解效率［14－15］。因此，反芻動(dòng)物瘤胃微生物在宿主營(yíng)養(yǎng)（為單胃動(dòng)物作為新型益生菌和后生元）和工業(yè)應(yīng)用（如在生物燃料生產(chǎn)、制漿造紙和紡織工業(yè)等方面的應(yīng)用）中具有潛在的利用價(jià)值。本研究通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的回顧和積累，將從以下4個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)綜述：1）瘤胃內(nèi)木質(zhì)纖維素降解的微生物基礎(chǔ)；2）降解木質(zhì)纖維素相關(guān)酶；3）瘤胃酶和微生物作為飼料添加劑的研究；4）瘤胃微生物在木質(zhì)纖維素價(jià)值化的研究，以期為瘤胃微生物在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料、化學(xué)品和其他生物制品價(jià)值化利用等方面的研究和應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 瘤胃內(nèi)木質(zhì)纖維素降解的微生物基礎(chǔ)

木質(zhì)纖維素主要由纖維素（35%～50%）、半纖維素（25%～30%）和木質(zhì)素（25%～30%）組成，并相互作用形成了具有高抗性和難降解的生物質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖1）［16］。隨著生物技術(shù)及微生物組學(xué)的發(fā)展，瘤胃微生物被視為宿主體細(xì)胞“第一基因組”之后的“第二基因組”［17］，不僅對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)的吸收利用和畜產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要，而且還為工業(yè)應(yīng)用提供了潛在的機(jī)會(huì)［18－19］。因此，研究瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的降解機(jī)理，提高木質(zhì)纖維素瘤胃利用率并促使其在工業(yè)價(jià)值化利用的研究基礎(chǔ)，是對(duì)瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)、功能和整體代謝途徑的系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)。

圖1 木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)Fig.1 Schematic of lignocellulose structure

木質(zhì)纖維素表面組分（蠟質(zhì)、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）具有不同的氧/碳原子比（oxygen/carbon，O/C）和相對(duì)的C1～C3峰面積［20］。因此，O/C和C1～C3相對(duì)峰度的變化可以很好地反映纖維素表面組分變化。木質(zhì)纖維素經(jīng)瘤胃液發(fā)酵后其表面組分，特別是蠟質(zhì)和木質(zhì)素含量顯著降低［21－22］。這意味著某些功能菌株（真菌和細(xì)菌）可以有效地去除蠟質(zhì)和木質(zhì)素的表面物質(zhì)，增加可降解纖維素和半纖維素的可觸性，從而實(shí)現(xiàn)瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的有效降解。由于纖維素表面主要被蠟質(zhì)和木質(zhì)素顆粒覆蓋，從而阻止了水解酶對(duì)木質(zhì)纖維素的降解。Hu等［21］將小麥秸稈用瘤胃微生物厭氧發(fā)酵5 d后，原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）清晰地顯示了秸稈表面的纖維孔和裂縫，同時(shí)直觀地觀察了瘤胃微生物去除覆蓋在秸稈表面蠟質(zhì)和木質(zhì)素顆粒的過程［21］。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過纖維孔擴(kuò)散至微生物，并將溶解的碳轉(zhuǎn)移到非纖維素分解微生物［23－24］，這暗示著隧穿效應(yīng)可能是瘤胃微生物降解秸稈的一種可能機(jī)制，同時(shí)瘤胃微生物并非完全降解纖維中所有蠟質(zhì)和木質(zhì)素組分。這為降解木質(zhì)素的真菌在瘤胃的初始階段占主導(dǎo)地位，但在隨后逐步下降提供了合理的解釋。同時(shí)，瘤胃厭氧真菌菌絲能夠穿透植物細(xì)胞壁并溶解木質(zhì)素成分，通過細(xì)胞分泌胞外游離的纖維素酶、半纖維素酶和酯酶等一系列高活性的酶，還可產(chǎn)生復(fù)合纖維小體降解木質(zhì)纖維素［25］。瘤胃細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解模式與真菌略有不同，瘤胃細(xì)菌通過產(chǎn)生各種功能蛋白，組裝成由催化區(qū)域、支架蛋白、碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate binding module，CBM）和黏連蛋白等構(gòu)成的復(fù)合纖維小體，附著于細(xì)胞表面進(jìn)而對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行分解［26］。

同時(shí)，反芻動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌、真菌和原蟲在木質(zhì)纖維素降解過程中形成一個(gè)復(fù)雜的共生系統(tǒng)，共同參與植物細(xì)胞壁的降解。細(xì)菌數(shù)量龐大，并且有多種代謝途徑［21，27］，因此，瘤胃細(xì)菌在纖維素降解過程中占主導(dǎo)地位。瘤胃真菌在大顆粒、大片段植物纖維降解過程中起著重要作用。由于瘤胃真菌能產(chǎn)生一系列具有高度活性的酶，厭氧菌在植物細(xì)胞壁中占有優(yōu)先地位，因此在降解植物細(xì)胞壁方面，真菌比其他微生物具有更大優(yōu)勢(shì)［28］。但由于瘤胃中真菌數(shù)量較少，對(duì)木質(zhì)纖維素的降解機(jī)理和纖維素分解總量的貢獻(xiàn)尚不明晰，在其生理生化特性、酶的結(jié)構(gòu)和代謝途徑等方面還需深入研究。高?。?9］發(fā)現(xiàn)，不同微生物區(qū)系的發(fā)酵速率和產(chǎn)氣速率具有顯著的變化，其中全瘤胃液的產(chǎn)氣率和降解率最高，其次是原蟲、細(xì)菌和真菌混合培養(yǎng)，而單獨(dú)培養(yǎng)的最低。這說明真菌、細(xì)菌和原蟲具有獨(dú)立降解纖維素的能力，但效率不高；因此，瘤胃微生物對(duì)木質(zhì)纖維素的降解不是某一種或者兩種微生物所能及的，而是一個(gè)非常復(fù)雜的相互協(xié)同作用過程。另有研究報(bào)道，只有甲烷菌在寄生菌體內(nèi)形成共生體，才能充分利用原生動(dòng)物代謝的氫和甲酸產(chǎn)生甲烷［30］。由于缺乏對(duì)瘤胃微生物相互作用的深入研究，這些理論都需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2 瘤胃微生物降解木質(zhì)纖維素相關(guān)酶的研究

瘤胃中纖維素類物質(zhì)的降解是多種不同類型纖維素酶共同作用的過程。瘤胃微生物可分泌種類繁多且數(shù)量龐大的木質(zhì)纖維素降解酶。真菌可附著于木質(zhì)纖維素端部，厭氧菌游動(dòng)的孢子和營(yíng)養(yǎng)體菌絲可分泌一系列與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的酶系，各種水解酶沿著假根進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行深度降解［31］；細(xì)菌首先吸附于木質(zhì)纖維素表面，然后從表面逐漸向內(nèi)部生長(zhǎng)，并將吸附在表面的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，從而降解木質(zhì)纖維素［32］。無論微生物以何種方式進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解，都以瘤胃微生物分泌的酶起主導(dǎo)作用，由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需多種木質(zhì)纖維素降解酶的相互作用才能使其降解。

2.1 纖維素酶

糖苷水解酶（glucoside hydrolase，GHs）是水解碳水化合物分子與碳水化合物和非碳水化合物分子之間糖苷鍵連接的酶。纖維素酶是GHs的一個(gè)亞型，可降解纖維素中存在的糖苷-β-1-4鍵［33］，纖維素酶由參與水解的三大類物質(zhì)組成（圖2）：內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（endo-β-1，4-glucanase），可降解纖維素中結(jié)晶度較低的區(qū)域，產(chǎn)生自由鏈末端；外切-β-1，4-葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase），可從自由鏈末端切除纖維二糖或纖維丁糖；β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-cellobiase），可將纖維二糖等纖維寡糖水解為葡萄糖［34－35］。研究顯示，主要的內(nèi)切葡聚糖酶來自細(xì)菌的GH5、GH8和GH9家族以及真菌的GH6、GH7和GH45家族［36］。厭氧真菌菌絲能夠穿透植物細(xì)胞壁并溶解木質(zhì)素分泌一系列高活性的纖維素酶，高效降解植物細(xì)胞壁。Youssef等［31］表明瘤胃壺菌屬（Piromyces）菌株CIA能夠產(chǎn)生GH5、GH8和GH9中的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶作用于纖維素分子鏈的非結(jié)晶區(qū)，水解β-1，4-糖苷鍵，且GH1和GH3家族中的β-1，4-葡萄糖苷酶，可有效降解纖維二糖、三糖和纖維素。Steenbakkers等［37］研究同樣發(fā)現(xiàn)瘤胃壺菌菌株E2可產(chǎn)生β-1，4-葡萄糖苷酶和內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，對(duì)纖維素的降解發(fā)揮著重要的作用。另外，也有研究表明瘤胃細(xì)菌如纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolven）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）也可分泌纖維素降解酶，在植物細(xì)胞壁的降解中發(fā)揮著一定的作用［38］。

圖2 纖維素酶催化機(jī)理Fig.2 Cellulase catalytic mechanism

2.2 半纖維素酶

半纖維素是非纖維素植物結(jié)構(gòu)多糖，其包含通過各種鍵連接的己糖和戊糖［30］。由于半纖維素在單糖組成上的多樣性和結(jié)構(gòu)上的高度分支化，半纖維素降解酶系從種類和數(shù)量上都要比纖維素酶更加豐富和復(fù)雜。半纖維素酶是半纖維素（木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖）降解酶的統(tǒng)稱，如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶和其他輔助酶［35］（圖3）。一般β-木糖苷酶（β-xylosidase）和β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase）水解木聚糖主鏈，具有木葡聚糖酶活性的β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosaccharase）和β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（β-1，4-endoglucanase）降解木聚糖，β-甘露糖苷酶（β-mannosidase）和β-1，4-內(nèi)切甘露聚糖酶（β-1，4-endomannanase）水解甘露聚糖（hydrolyze mannan）。而一些輔酶如香豆酸酯酶（p-coumaric acid esterases）、葡萄糖醛酸酶（glucuronidase）、阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase）、阿拉伯呋喃糖酶（arabinofuranosidase）等，主要負(fù)責(zé)降解木聚糖的支鏈部分［39－40］。Wang等［41］研究發(fā)現(xiàn)瘤胃厭氧真菌Neocallimastix patriciarumW5可分泌β-1，4-葡萄糖苷酶、β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶，有效降解半纖維素。已有研究表明，瘤胃厭氧真菌分泌的木質(zhì)纖維素酶比市場(chǎng)應(yīng)用的里氏木霉（Trichoderma reesei）和曲霉（Aspergillus nidulans）的活性更高，尤其是瘤胃壺菌屬的酶活性［42］。Avgustin等［43］研究發(fā)現(xiàn)棲瘤胃普氏菌屬（Prevotella ruminicola）和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）具有來自不同家族GH的酶系，它們不僅具有水解淀粉和半纖維素的能力，還能水解蛋白質(zhì)，并能同時(shí)發(fā)酵糖和氨基酸。Dodd等［44］研究也表明棲瘤胃普氏菌菌株能產(chǎn)生胞外木聚糖酶，可降解完整牧草中的半纖維素。同時(shí)，產(chǎn)琥珀酸纖維桿菌（Fibrobacter succinogenes）和黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）會(huì)產(chǎn)生半纖維素酶，在半纖維素降解過程中有非常重要的作用［45］。

圖3 具有不同取代基的木聚糖結(jié)構(gòu)和木聚糖酶作用位點(diǎn)Fig.3 Xylan structure with different substituents and sites of attack by xylanase

瘤胃微生物也可分泌阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、果膠酶。酯酶能夠打開細(xì)胞壁中酚酸和半纖維素形成的酯鍵，使半纖維素從木質(zhì)素和纖維素的復(fù)合體中釋放出來；果膠酶能夠降解植物細(xì)胞壁果膠成分，釋放出酸性果膠和甲醇，這些物質(zhì)可為其他降解酶的酶解提供反應(yīng)底物，在植物細(xì)胞壁降解的初始階段具有非常重要的意義［46］。

2.3 纖維小體

研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物還可合成高分子量和多功能的纖維小體［38］，纖維小體是由厭氧微生物（細(xì)菌和真菌）產(chǎn)生的自組裝蛋白質(zhì)復(fù)合物，由結(jié)構(gòu)蛋白和催化模塊組成，其中結(jié)構(gòu)蛋白包括支架蛋白、錨定蛋白等，催化模塊包括降解植物細(xì)胞壁所必需的纖維素酶、半纖維素酶等［47－48］。眾所周知，纖維小體對(duì)纖維降解具有很高的催化效率，這可能是由于催化亞基之間的鄰近性導(dǎo)致有序的底物隧穿效應(yīng)［26］。纖維小體能夠有效降解木質(zhì)纖維素，在植物細(xì)胞壁的黏附和降解中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但是有關(guān)纖維小體的組裝和作用機(jī)理并不清楚。

此外，很多水解酶都具有多模塊化的特點(diǎn)，即同時(shí)含有一個(gè)催化域（catalytic domain，CD）和一個(gè)無催化活性的碳水化合物結(jié)合模塊，它們通過一段柔性肽連接區(qū)（linker）連接［49］。CBM是碳水化合物活性酶內(nèi)的連續(xù)氨基酸序列，其離散折疊具有碳水化合物結(jié)合活性，CBM通過配置和增加糖基表面單個(gè)糖苷水解酶或多酶纖維素復(fù)合體的有效濃度來增強(qiáng)纖維素的水解，且CBM可以分解植物細(xì)胞壁的纖維素結(jié)構(gòu)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾☆w粒釋放出來，在結(jié)晶纖維素降解的最初階段起非常重要的作用［50－51］。真菌纖維素分解酶幾乎完全擁有家族1的碳水化合物結(jié)合模塊（CBM1）［36，52］。Liu等［53］研究發(fā)現(xiàn)瘤胃厭氧真菌Neocallimastix patriciarum含有家族1的碳水化合物結(jié)合模塊，具有相對(duì)簡(jiǎn)單的分子結(jié)構(gòu)，CBM1使催化域定位到木聚糖附近，增加木聚糖表面有效酶濃度，促進(jìn)對(duì)木聚糖的吸附與水解；但隨著真菌的菌絲生長(zhǎng)到細(xì)胞壁時(shí)，分泌的酶向目標(biāo)底物的傳遞可能不需要復(fù)雜的CBMs［54］。研究表明厭氧細(xì)菌白色瘤胃球菌含有家族37的碳水化合物結(jié)合模塊（CBM37），該模塊能識(shí)別纖維素、木聚糖、幾丁質(zhì)等多種底物，在纖維素酶黏附過程中作為橋梁將細(xì)菌和多糖底物銜接，并幫助酶固定在細(xì)菌膜表面，實(shí)現(xiàn)高效率的纖維降解［55－56］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)瘤胃細(xì)菌Fibrobacter succinogenes的C-末端含有富含脯氨酸的連接區(qū)序列連接的家族6碳水化合物結(jié)合模塊（CBM6），在木聚糖酶與底物的相互作用中起關(guān)鍵作用［26，57］。CBM雖然能識(shí)別并能與纖維素和許多其他多糖特異性緊密結(jié)合，但由于CBM的種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得在纖維素酶中的確切作用仍然未知。

3 瘤胃微生物在木質(zhì)纖維素價(jià)值化的研究

對(duì)反芻動(dòng)物而言，瘤胃中木質(zhì)纖維素分解菌（木質(zhì)素、纖維素和半纖維素降解菌）和非纖維素分解菌緊密關(guān)聯(lián)，相互作用［39］。非纖維素分解細(xì)菌通過初級(jí)降解釋放可溶性多糖，并通過發(fā)酵將其轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸、二氧化碳和氫氣等，作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被家畜利用［73］。木質(zhì)纖維素因資源豐富，成本低廉，成為生產(chǎn)瘤胃酶、飼料添加劑、生物乙醇、有機(jī)酸和沼氣等生物制品的重要原料。因此，以木質(zhì)纖維素為原料，利用瘤胃中的微生物菌群或從瘤胃中獲得的酶生產(chǎn)飼料添加劑、生物燃料和化學(xué)用品，在應(yīng)對(duì)日益增長(zhǎng)的飼糧需求、能源需求和處理環(huán)境污染問題方面具有至關(guān)重要的作用。

3.1 瘤胃酶和微生物作為飼料添加劑的研究

谷物是動(dòng)物飼料的最大組成部分。通常動(dòng)物飼料中小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）和黑麥（Secale cereale）等含有較高的纖維量，其主要由非淀粉多糖（non-starch polysaccharides，NSP）組成，如小麥和黑麥中的阿拉伯木聚糖及大麥和燕麥（Avena fatua）中的β-葡聚糖，這些抗?fàn)I養(yǎng)化合物通過增加動(dòng)物小腸消化液的黏度來干擾消化，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率并誘發(fā)腸道功能紊亂［58］。研究表明利用多種酶如纖維素酶、葡聚糖酶和果膠酶可以減少飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)化合物。添加其他酶如木聚糖酶和β-葡聚糖酶，可水解NSP，降低谷物的黏度，并釋放蛋白質(zhì)和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［59］。因此，在動(dòng)物飼料中使用外源酶可以提高飼料利用率，使動(dòng)物的消化系統(tǒng)更健康。Bansal等［60］研究表明，在單胃動(dòng)物的飼料中添加外源性酶（如纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和葡聚糖酶），通過促進(jìn)各種植物細(xì)胞壁聚合物（如纖維素、木聚糖、果膠和葡聚糖）降解為單糖來提高飼料成分的消化率，從而提高飼料的利用效率［61］。Romero等［62］發(fā)現(xiàn)在荷斯坦奶牛中添加木聚糖酶的復(fù)合酶制劑可顯著提高奶牛干物質(zhì)采食量、泌乳量和牛奶中乳脂含量。國(guó)春艷［63］研究了木聚糖酶和纖維素酶對(duì)表觀消化性能的影響，發(fā)現(xiàn)在全混合日糧（total mixed ration，TMR）中添加木聚糖酶和纖維素酶不僅提高了3～7月齡后備牛干物質(zhì)的采食量和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）表觀消化率，且提高了后備牛的總能表觀消化率和日增重。綜上，瘤胃酶作為飼料添加劑，不僅改善了動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康狀況，提高了飼料的利用率，而且有利于減少“黏性糞便”，改善牲畜的生存環(huán)境。

反芻動(dòng)物因瘤胃微生物種群的存在，能夠降解植物中木質(zhì)纖維素。但是單胃動(dòng)物無法消化各種植物細(xì)胞壁聚合物，其他多種飼料成分也不能被家畜完全消化吸收。在過去的幾十年，科學(xué)家們一直試圖通過增加瘤胃中纖維降解來改善瘤胃的功能，利用飼料添加劑如化學(xué)制劑［64］或酶［65］以提高木質(zhì)纖維素的降解，但結(jié)果并不理想。近年來，使用活細(xì)菌作為益生菌實(shí)現(xiàn)纖維素的降解受到學(xué)者們極大的關(guān)注［66］。研究表明，從印度大羚羊中分離的瘤胃壺菌菌株FNG5添加在水牛的飼料中不僅提高了羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、微晶纖維素酶、乙酰酯酶、阿魏酸酯酶和蛋白酶的酶活性，而且顯著提高了干物質(zhì)（dry matter，DM）、有機(jī)物（organic matter，OM）、NDF和ADF的消化率和揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）的濃度，促進(jìn)了水牛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收［67］。Lee等［68］從山羊中分離的瘤胃壺菌菌株KNGF-2直接飼喂于綿羊，通過增加細(xì)菌和真菌的數(shù)量，從而增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率和氮的利用，進(jìn)而改變瘤胃中VFA的生成途徑；但研究發(fā)現(xiàn)，真菌酶未能顯著改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、氮的利用和瘤胃發(fā)酵參數(shù)，這可能是由于日糧中蛋白質(zhì)可能被瘤胃微生物迅速降解，以至于酶可能會(huì)降低瘤胃微生物的生長(zhǎng)或活性。Dey等［69］在犢牛飼料中添加瘤胃壺菌后發(fā)現(xiàn)，真菌的添加可顯著提高犢牛的平均日增重、飼料的轉(zhuǎn)化率和粗纖維（crude fiber，CF）、NDF和ADF的消化率。將山羊中分離的瘤胃壺菌菌株CN6添加在青貯飼料時(shí)，可提高發(fā)酵30 d青貯飼料的DM、NDF和ADF體外降解率［46］，這與Lee等［70］的研究結(jié)果一致。有研究在高粗料日糧條件下，直接灌服瘤胃真菌能夠提高育肥牛日增重、泌乳牛產(chǎn)奶量，同時(shí)能夠提高瘤胃內(nèi)VFA濃度、游動(dòng)孢子數(shù)量和飼料利用率［71－72］。以上研究表明，瘤胃真菌作為飼料添加劑可改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高粗飼料的利用率，進(jìn)而改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)。

3.2 在生物化學(xué)（有機(jī)酸）生產(chǎn)中的應(yīng)用

琥珀酸作為一種重要的有機(jī)酸，存在于動(dòng)植物、人和微生物體內(nèi)，在生物代謝中起著重要作用。琥珀酸來源于碳水化合物的發(fā)酵，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)食品、藥物、綠色溶劑和生物分解性塑膠等［74］。工業(yè)上重要的化合物是由木質(zhì)纖維素預(yù)處理后得到的可發(fā)酵糖產(chǎn)生，由細(xì)菌和真菌組成的不同類型微生物將木質(zhì)纖維素降解為葡萄糖單體［36］。研究表明，瘤胃細(xì)菌如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和溶淀粉性琥珀酸單胞菌（Amylolytic succinate）等進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸，這種細(xì)菌種類根據(jù)生產(chǎn)區(qū)域的不同，可以自由使用各種植物材料，如草或玉米，從而使琥珀酸的生產(chǎn)更可持續(xù)和更具成本效益［75］。利用瘤胃細(xì)菌埃氏巨球菌（Megasphaera elsdenii）可生產(chǎn)丁酸、己酸和戊酸等短鏈脂肪族有機(jī)酸，特別是利用生物方法生產(chǎn)己酸可能為尼龍開辟可持續(xù)生產(chǎn)的途徑。同時(shí)由于埃氏巨球菌對(duì)短鏈脂肪酸的抗性，可作為一種有效的微生物細(xì)胞工廠（microbial cell factories，MCF）［76］。但利用瘤胃微生物生產(chǎn)有機(jī)酸的生物技術(shù)尚不成熟，需進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，進(jìn)而開發(fā)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

3.3 在乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用

在所有的液體生物燃料中，生物乙醇由于具有替代不可再生石油的潛力而受到全球的廣泛關(guān)注。因此，利用不同的原料生產(chǎn)生物乙醇的各種技術(shù)實(shí)施已成為研究重點(diǎn)。生物燃料主要是從天然油脂中提取的生物柴油和從農(nóng)業(yè)剩余物發(fā)酵中提取的乙醇［4］。木質(zhì)纖維原料的殘?jiān)谑澜绶秶鷱V泛存在，是最有前途的可再生能源生產(chǎn)基質(zhì)之一?？稍偕Y源生產(chǎn)生物燃料的技術(shù)已得到應(yīng)用。微生物可分泌協(xié)同酶，將復(fù)雜的生物質(zhì)降解為單糖，并將其發(fā)酵生成乙醇［77］，在生物燃料生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)瘤胃微生物在木質(zhì)纖維素發(fā)酵中生產(chǎn)乙醇的研究在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，且有研究表明瘤胃細(xì)菌在厭氧條件下通過發(fā)酵木質(zhì)纖維素材料可產(chǎn)生乙醇和氫氣［78］。Pang等［79］從內(nèi)蒙古牛瘤胃中分離的大腸桿菌菌株ZH-4除了產(chǎn)生葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和纖維素酶有效降解玉米秸稈，還能產(chǎn)生乙醇和氫氣，這不僅為學(xué)者研究瘤胃微生物進(jìn)化機(jī)制提供了一個(gè)很好的機(jī)會(huì)，也為利用合并生物工藝直接從大腸桿菌中生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品提供新的方法與思路。Banerjee等［4］也研究表明，大腸桿菌因在基因上易于操作且能夠消耗大量的有機(jī)碳資源，從而用來生產(chǎn)包括生物乙醇在內(nèi)的多種化學(xué)物質(zhì)。同時(shí)，在厭氧條件下，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌主要的最終代謝產(chǎn)物為乙醇和氫氣［26］。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，學(xué)者們已經(jīng)開發(fā)出一種新的細(xì)胞循環(huán)分批發(fā)酵（cell recycle batch fermentation，CRBF）系統(tǒng)，可以利用植物生物質(zhì)中的各種碳水化合物以及農(nóng)業(yè)和工業(yè)產(chǎn)生的生物質(zhì)并將釋放出的糖發(fā)酵成乙醇［80］。因此，利用成熟的基因組工程構(gòu)建既能水解又能發(fā)酵的聯(lián)合生物加工菌株，是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要突破。但因瘤胃微生物的復(fù)雜性和技術(shù)的不成熟，還需進(jìn)一步研究關(guān)于宿主生物的生理和代謝、生物化學(xué)和酶的結(jié)構(gòu)、原料組成等。

3.4 在沼氣生產(chǎn)中的應(yīng)用

沼氣發(fā)酵是在厭氧條件下厭氧微生物將有機(jī)質(zhì)（如秸稈和糞便）轉(zhuǎn)化成沼氣的一種發(fā)酵方式，是利用生物質(zhì)能源的有效途徑。但因農(nóng)作物秸稈類生物質(zhì)富含纖維素和半纖維素等難以降解的成分，成為沼氣發(fā)酵的限速因素。研究發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)作物秸稈進(jìn)行沼氣發(fā)酵時(shí)添加瘤胃真菌可改善發(fā)酵品質(zhì)，提高生物質(zhì)降解率和沼氣產(chǎn)量［5，81］。Aydin等［82］在微藻中接種不同量的瘤胃真菌在促進(jìn)微藻發(fā)酵和降解的同時(shí)提高了甲烷的產(chǎn)量。李倩等［83］針對(duì)醋糟中木質(zhì)纖維素厭氧消化處置率低的問題，通過接種瘤胃微生物強(qiáng)化木質(zhì)纖維素水解，表明瘤胃微生物的參與可顯著提高底物產(chǎn)沼氣和甲烷的產(chǎn)量，說明瘤胃微生物的介入可有效強(qiáng)化體系底物的降解能力，進(jìn)而提升其產(chǎn)甲烷性能。Barragán-trinidad等［84］也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，他們利用瘤胃液作為水解微生物的來源對(duì)天然微藻的預(yù)處理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物和微藻的混合可提高水解率和甲烷的產(chǎn)量，這可能是由于瘤胃真菌更專注于微藻細(xì)胞壁的降解。Li等［85］利用連續(xù)攪拌槽厭氧反應(yīng)器以瘤胃液為接種菌在造紙剩余污泥的原料中生產(chǎn)沼氣，沼氣中CH4和CO2的含量分別為65.1%和34.2%。與以往研究結(jié)果相比，接種瘤胃微生物可顯著提高甲烷產(chǎn)量，表明在現(xiàn)有厭氧系統(tǒng)中加入?yún)捬鮿?，可有效地生產(chǎn)沼氣。魏亞琴［86］的研究表明，來自天祝放牧牦牛瘤胃真菌Neocallimastix frontalis和甲烷菌M.ruminantium共培養(yǎng)可高效將秸稈轉(zhuǎn)化為CH4和乙酸，說明厭氧真菌應(yīng)用在沼氣發(fā)酵時(shí)能促進(jìn)秸稈類生物質(zhì)的水解，提高發(fā)酵過程中甲烷菌的數(shù)量，加速秸稈的降解，增加沼氣的產(chǎn)量。

因此，瘤胃微生物在沼氣發(fā)酵工程領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，目前對(duì)瘤胃微生物的研究已經(jīng)從體外培養(yǎng)、反應(yīng)機(jī)制和性能、原始的反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)向?qū)嵱没嵌绒D(zhuǎn)變［87］。但大部分研究仍基于傳統(tǒng)思路，對(duì)瘤胃微生物在厭氧消化系統(tǒng)中還處于局部的纖維水解性能方面，忽略了瘤胃微生物菌群的復(fù)雜性，且利用瘤胃微生物將秸稈轉(zhuǎn)換為沼氣還處于可行性探索階段，對(duì)降解機(jī)理和協(xié)同代謝過程尚不明確。因此，如何利用好瘤胃微生物這一天然的發(fā)酵微生物菌群，并將其應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中是一個(gè)十分值得研究的問題。

4 展望

木質(zhì)纖維素在可再生替代能源方面起著至關(guān)重要的作用，并日益成為世界上最大的能源資源之一。盡管國(guó)內(nèi)外有關(guān)瘤胃微生物和瘤胃酶在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為沼氣、生物乙醇、有機(jī)酸及其他化學(xué)制品等相關(guān)的研究已取得了豐碩的成果，但由于缺乏對(duì)瘤胃微生物結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和各種木質(zhì)纖維素酶互作機(jī)制的詳細(xì)了解，且大多數(shù)瘤胃微生物無法在體外培養(yǎng)，從而阻礙了瘤胃微生物潛力的發(fā)揮。故對(duì)于瘤胃微生物在降解木質(zhì)纖維素及價(jià)值化利用方面還需進(jìn)行以下幾方面研究：

深入探討和研究瘤胃微生物降解木質(zhì)纖維素的作用機(jī)理及瘤胃微生物與降解木質(zhì)素相關(guān)酶間的相互作用機(jī)制，分離純化獲得低成本高效降解木質(zhì)纖維素的純化酶，為純化酶在制漿造紙、紡織工業(yè)、食品和動(dòng)物飼料等工業(yè)上的應(yīng)用提供理論支撐。

瘤胃作為有效降解木質(zhì)纖維素的微生態(tài)系統(tǒng)之一，不僅微生物多樣、酶資源豐富，且發(fā)酵體系獨(dú)特。因此，發(fā)現(xiàn)高效降解木質(zhì)纖維素的新型菌株，研究新培養(yǎng)條件，同時(shí)構(gòu)建分解木質(zhì)纖維素復(fù)合菌系，探明復(fù)合菌系形成的機(jī)制，進(jìn)一步了解復(fù)合菌系的機(jī)理和特點(diǎn)，并挖掘其應(yīng)用潛力，拓展復(fù)合菌系的應(yīng)用途徑，以期在乙醇、沼氣和有機(jī)酸等生物制品得到高效低成本生產(chǎn)。

通過綜合基因組技術(shù)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等）的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)厭氧發(fā)酵中木質(zhì)纖維素降解菌進(jìn)行深入研究，挖掘菌株信息，明晰代謝通路，找到編碼特定酶類的目標(biāo)基因，揭示微生物群落的遺傳潛力，以期利用基因工程獲得快速、廉價(jià)、高效降解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的微生物和酶類資源，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。