郭艷霞，李孟偉，唐振華，彭麗娟，彭開屏，謝芳，謝華德，楊承劍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境是瘤胃正常發(fā)酵的重要保障，瘤胃內(nèi)復(fù)雜的微生物發(fā)酵系統(tǒng)共同作用，協(xié)助機(jī)體對(duì)纖維素、非蛋白氮等物質(zhì)的利用。此過程會(huì)以甲烷形式損失掉5%的飼料能量［1］，另外，甲烷作為生物溫室氣體也會(huì)污染環(huán)境。很多研究者致力于抑制甲烷生成的研究，通過添加耗氫化合物是減少甲烷排放的主要方法之一［2］。硝酸鹽可作為耗氫化合物降低甲烷產(chǎn)量，并且作為非蛋白氮還可為瘤胃微生物提供氮源［3］。Huyen等［4］將硝酸鹽作為唯一非蛋白氮源添加到低蛋白質(zhì)飼糧中，并給動(dòng)物4周左右的適應(yīng)期，并未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用。Li等［5］在羔羊日糧中添加硝酸鈣，發(fā)現(xiàn)每千克增重甲烷排放量降低17.3%，每千克干物質(zhì)日糧甲烷排放量降低35.4%。然而，反芻動(dòng)物瘤胃微生物還原硝酸鹽的過程中產(chǎn)生一種中間產(chǎn)物亞硝酸鹽，若未經(jīng)硝酸鹽適應(yīng)的動(dòng)物突然攝入大量硝酸鹽會(huì)造成瘤胃內(nèi)亞硝酸鹽中毒，因此控制硝酸鹽的添加量和適應(yīng)性對(duì)于硝酸鹽在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用至關(guān)重要。

亞油酸是指含18碳原子2個(gè)雙鍵的ω-6系多不飽和脂肪酸，在反芻動(dòng)物瘤胃微生物作用下，第一步cis-11雙鍵被異構(gòu)化為trans-12雙鍵，產(chǎn)生亞油酸的異構(gòu)體共軛亞油酸cis-9，trans-11CLA；第二步經(jīng)過微生物加氫作用，先被還原成反式油酸（t11-C18：1），再進(jìn)一步還原生成硬脂酸（C18：0）［6］。共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）具有抗癌、減輕動(dòng)脈硬化、降低體脂、增強(qiáng)免疫力等作用［7］，是維持機(jī)體細(xì)胞構(gòu)成所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，提高動(dòng)物產(chǎn)品CLA含量具有重要意義。亞油酸的氫化過程和甲烷生成過程均存在氫轉(zhuǎn)移，并且需要瘤胃微生物的作用，添加硝酸鹽對(duì)氫轉(zhuǎn)移過程和瘤胃微生物的影響的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究添加亞油酸條件下不同劑量硝酸鈉對(duì)水牛瘤胃體外發(fā)酵脂肪酸組成及相關(guān)微生物數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

試驗(yàn)時(shí)間為2019年3－5月。選擇3頭體重約為（650±50）kg安裝永久性瘤胃瘺管的母水牛作為瘤胃液供體動(dòng)物。瘺管牛的飼糧水平參照廣西水牛研究所的日常飼料配方配制，精粗比40∶60，每天飼喂2次，自由飲水。在晨飼前采集3只瘺管牛的瘤胃內(nèi)容物，混合后經(jīng)2層紗布過濾2次至預(yù)熱處理過和提前通入CO2的收集瓶中，39℃下連續(xù)通入CO2。

發(fā)酵底物豆粕、玉米（Zea mays）、象草（Elephantes herba）均采自廣西水牛研究所水牛場(chǎng)，經(jīng)65℃烘干制成風(fēng)干樣后，粉碎過0.425 mm孔徑篩網(wǎng)用于體外發(fā)酵。硝酸鈉（分析純）購于天津市百世化工有限公司；亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）購于美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)硝酸鈉添加量的不同分為4組，硝酸鈉的添加量分別為0（對(duì)照）、1、2、3 mg·mL－1，每組5個(gè)重復(fù)，每組都添加0.25 mg·mL－1的亞油酸。

1.3 培養(yǎng)方法

采用體外批次培養(yǎng)法（重復(fù)試驗(yàn)2次，2次對(duì)照組產(chǎn)氣量相對(duì)偏差小于10%），體外發(fā)酵底物的精粗比為40∶60（風(fēng)干基礎(chǔ)），底物飼料分為精飼料（豆粕25%，玉米15%）和粗飼料（象草60%），其營養(yǎng)成分見表1。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確稱取發(fā)酵底物300 mg象草粉，125 mg豆粕粉，75 mg玉米粉置入180 mL厭 氧 培養(yǎng)瓶中，分別添加不同劑量的硝酸鈉。人工瘤胃緩沖液的配制參照Menke等［8］的方法，持續(xù)通入CO2氣體，緩沖液由粉色變?yōu)闊o色。將乳化后的亞油酸液按相應(yīng)設(shè)定比例加入培養(yǎng)瓶中，人工瘤胃緩沖液和瘤胃液體積2∶1混合均勻，抽取60 mL混合液加入培養(yǎng)瓶中，然后用橡膠塞和鋁蓋密閉，整個(gè)過程通入CO2氣體保持厭氧環(huán)境，盡快完成。將培養(yǎng)瓶置于恒溫水浴搖床中，水浴溫度（39.0±0.5）℃，振蕩頻率50 r·min－1。

表1 底物組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of the substrate

1.4 樣品采集及分析

在培養(yǎng)3、6、9、12、24 h時(shí)，分別測(cè)定發(fā)酵瓶的產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。取一帶軟細(xì)短管的注射器針頭，與100 mL潤滑的玻璃注射器連接，將針頭插入發(fā)酵瓶塞子，讀取注射器上的刻度并記錄數(shù)據(jù)。培養(yǎng)瓶凈產(chǎn)氣量（mL）=時(shí)間段產(chǎn)氣量（mL）－對(duì)應(yīng)時(shí)間段空白均產(chǎn)氣量（mL），24 h累積總產(chǎn)氣量即各時(shí)間段培養(yǎng)瓶凈產(chǎn)氣量之和。用注射器測(cè)完產(chǎn)氣量，旋轉(zhuǎn)管塞排出管內(nèi)氣體，然后用手動(dòng)進(jìn)樣針從發(fā)酵瓶抽取10 μL氣體測(cè)定甲烷含量，直接進(jìn)樣至氣相色譜儀（Agilent 7890A，美國安捷倫科技公司），色譜柱為HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm，參照胡偉蓮等［9］的測(cè)定方法，測(cè)定條件為：柱溫80℃；氣化室溫度100℃；檢測(cè)室溫度120℃；載氣為高純氮?dú)猓瑝毫?79.5 Pa，總流量46.2 mL·min－1，柱流量2.7 mL·min－1，分流比15∶1，吹掃流量3 mL·min－1，循環(huán)流量100 mL·min－1；氫氣流量40 mL·min－1，空氣流量400 mL·min－1。24 h累積甲烷產(chǎn)量即各時(shí)間段培養(yǎng)瓶甲烷實(shí)際產(chǎn)量之和。

在培養(yǎng)24 h結(jié)束時(shí)，終止發(fā)酵。收集培養(yǎng)液，分別測(cè)定pH、氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N）、微生物蛋白（microbial protein，MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）、中長鏈脂肪酸和微生物數(shù)量等指標(biāo)。用pH計(jì)（HANNA HI 8424，上海何亦儀器儀表有限公司）測(cè)定培養(yǎng)液pH值，測(cè)定前pH計(jì)先用緩沖液進(jìn)行校正；采用苯酚－次氯酸鈉比色法［10］測(cè)定NH3-N含量；采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定MCP含量；參照Li等［11］的方法測(cè)定VFA含量；采用氣相色譜儀（Agilent 7890A，美國安捷倫科技公司）測(cè)定巴豆酸作內(nèi)標(biāo)物，色譜柱為HPINNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，自動(dòng)進(jìn)樣器（Agilent G4513A，美國安捷倫科技公司），測(cè)定條件：氣化室溫度200℃；檢測(cè)室溫度220℃；柱溫采用程序升溫：80℃持續(xù)1 min，以15℃·min－1升溫至170℃后維持1.5 min；載氣為高純N2，壓力100 kPa，總流量63.8 mL·min－1，柱流量1.19 mL·min－1，分流比50∶1，吹掃流量3 mL·min－1，循環(huán)流量30 mL·min－1；氫氣流量40 mL·min－1，空氣流量400 mL·min－1；進(jìn)樣量2.0 μL；采用氯仿/甲醇/BHT提取法測(cè)定瘤胃液中長鏈脂肪酸；采用硫酸甲醇酯化法測(cè)定甲酯化；利用氣相色譜儀（Agilent 7890B，美國安捷倫科技公司）測(cè)定中長鏈脂肪酸含量；參照Xu等［12］的方法，用毛細(xì)管氣相色譜－氫火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）和HP-88脂肪酸甲酯測(cè)定專用毛細(xì)管柱；用C17：0內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)中長鏈脂肪酸含量，測(cè)定條件：載氣為高純He，流量1.1 mL·min－1；氫氣流量40 mL·min－1；空氣流量450 mL·min－1，分流比20∶1，進(jìn)樣量1.0 μL。進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為250℃；柱箱程序升溫：初始溫度為150℃，持續(xù)5 min，以2℃·min－1的速率升至175℃，持續(xù)15 min，再以7℃·min－1的速率升至200℃，持續(xù)20 min，最后以5℃·min－1的速率升至220℃，持續(xù)25 min；參照Denman等［13］的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取微生物總DNA，采用高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler 480，美國）測(cè)定微生物數(shù)量，具體參照Shingfield等［14］的方法。瘤胃液微生物的引物由上海生工生物工程公司合成，具體引物序列見表2。

表2 Real-time PCR引物序列Table 2 Primers sequence of real-time PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件整理數(shù)據(jù)，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差（One-way ANOVA）分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，差異顯著性以P＜0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量硝酸鈉對(duì)產(chǎn)氣參數(shù)及瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

與對(duì)照相比，添加硝酸鈉顯著降低了瘤胃培養(yǎng)液24 h累積總產(chǎn)氣量和總甲烷含量（P＜0.05），并隨著硝酸鈉濃度的增加，甲烷含量顯著降低（P＜0.05），1、2和3 mg·mL－1硝酸鈉處理，甲烷含量分別降低了68.62%、74.04%、77.31%。添加硝酸鈉培養(yǎng)液的pH值、NH3-N含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），對(duì)MCP含量影響差異不顯著（P＞0.05）。添加硝酸鈉的異丁酸濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），1、2 mg·mL－1硝酸鈉組的異戊酸濃度顯著低于對(duì)照組和3 mg·mL－1硝酸鈉組（P＜0.05），而添加硝酸鈉對(duì)其他VFA含量和乙酸/丙酸影響差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

表3 體外發(fā)酵24 h后的累積總產(chǎn)氣量、總甲烷量、pH值、氨態(tài)氮、微生物蛋白和揮發(fā)性脂肪酸含量Table 3 The cumulative total gas production，total methane production，pH value，NH3-N，MCP and volatile fatty acid content after 24 h in vitro fermentation

2.2 添加不同劑量硝酸鈉對(duì)瘤胃液中長鏈脂肪酸組成的影響

添加3 mg·mL－1硝酸鈉組C6：0含量顯著高于其他組（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝酸鈉組C10：0含量顯著高于其他組（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸鈉組t11-C18：1含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；1 mg·mL－1硝酸鈉組C18：2cis-9，trans-11、C18：2trans-10，cis-12含量和UFA/SFA顯著高于其他組（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸鈉組C19：0含量顯著高于其他組（P＜0.05）；3 mg·mL－1硝酸鈉組C21：0含量顯著低于對(duì)照組和2 mg·mL－1硝酸鈉組（P＜0.05）；1 mg·mL－1硝酸鈉組C20：5n3（EPA）含量顯著高于3 mg·mL－1硝酸鈉組（P＜0.05）；2 mg·mL－1硝酸鈉組C22：6n3（DHA）含量顯著高于其他組（P＜0.05）；2 mg·mL－1硝酸鈉組C22：1n9含量顯著低于對(duì)照組和3 mg·mL－1硝 酸 鈉 組（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝 酸 鈉 組C22：2n6、PUFA、UFA含 量 顯 著 低 于 其 他 組（P＜0.05）（表4）。

表4 添加不同劑量硝酸鈉對(duì)體外發(fā)酵瘤胃液脂肪酸濃度的影響Table 4 Effect of adding sodium nitrate of different doses on fatty acid concentration of rumen fluid in vitro（μg·mL-1）

2.3 添加不同劑量硝酸鈉對(duì)瘤胃微生物數(shù)量的影響

1 mg·mL－1硝酸鈉組瘤胃液的總細(xì)菌、真菌、溶纖維丁酸弧菌、蛋白分解丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）；2、3 mg·mL－1硝酸鈉瘤胃液的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著低于1 mg·mL－1硝酸鈉組（P＜0.05）；添加硝酸鈉瘤胃液的原蟲數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（表5）。

表5 添加不同劑量硝酸鈉對(duì)瘤胃微生物數(shù)量的影響Table 5 Effects of adding sodium nitrate of different doses on the number of rumen microorganisms（copies·mL-1）

3 討論

瘤胃微生物發(fā)酵碳水化合物所產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸是反芻動(dòng)物能量的重要來源，其產(chǎn)量及比例可影響反芻動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用。硝酸鹽類物質(zhì)在瘤胃內(nèi)的代謝途徑與尿素等非蛋白氮相似，可作為非蛋白氮為反芻動(dòng)物提供氮源。硝酸鹽在瘤胃中先被還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽再進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為氨，此過程消耗氫氣，理論上可降低瘤胃甲烷生成量，并且氨和瘤胃中的有機(jī)酸作為營養(yǎng)物質(zhì)能促進(jìn)瘤胃微生物菌體蛋白的合成。本試驗(yàn)中添加1、2、3 mg·mL－1硝酸鈉均顯著降低了甲烷產(chǎn)量，與Nguyen等［18］和Sar等［19］硝酸鹽抑制甲烷產(chǎn)生的結(jié)果一致，表明與甲烷菌CO2-H2的還原途徑相比，硝酸根離子較強(qiáng)的氧化性更有利于被氫氣還原。瘤胃液pH值和NH3-N含量顯著升高，TVFA含量沒有顯著變化，各培養(yǎng)液pH值（6.71～6.82）均處在正常范圍內(nèi)（5.6～7.5），而穩(wěn)定的pH值是瘤胃內(nèi)環(huán)境和飼料消化的關(guān)鍵。瘤胃液pH值主要受到TVFA含量和氨濃度的影響，Sar等［19］報(bào)道硝酸鹽的氨化作用提高了氨濃度，pH值隨之升高，本試驗(yàn)也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。Zhou等［20］研究發(fā)現(xiàn)添加硝酸鹽使丙酸濃度和TVFA含量顯著下降，乙丙酸比例卻隨之增加，而本試驗(yàn)結(jié)果與之不同，原因可能是硝酸鹽的添加量和試驗(yàn)動(dòng)物有所不同。硝酸鹽還原過程所需的氫原子同時(shí)來自甲烷和丙酸的生成過程［21］，所以會(huì)存在氫原子競爭，硝酸鈉還原過程可能對(duì)甲烷和乙丙酸的利用具有選擇性，該推測(cè)有待驗(yàn)證。

不飽和游離脂肪酸在瘤胃內(nèi)壽命很短暫，會(huì)被瘤胃微生物迅速加氫生成飽和產(chǎn)物，此為生物氫化過程。丁酸弧菌屬細(xì)菌在亞油酸氫化過程中起重要作用，有研究報(bào)道［22］，亞油酸將c12-鍵異構(gòu)為t11-鍵生成共軛亞油酸C18：2cis-9，trans－11，再氫化成t11-C18：1，溶纖維丁酸弧菌在這兩個(gè)過程中起主要作用；而蛋白分解丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌可以實(shí)現(xiàn)t11-C18：1氫化為C18：0［23－24］。最后一步氫化過程比之前的步驟慢得多，造成了t11-C18：1在瘤胃中的累積。因此當(dāng)多種微生物共同作用時(shí)，t11-C18：1氫化就成為限速步驟，它控制著整個(gè)生物氫化過程的速率。在本試驗(yàn)中添加硝酸鈉后t11-C18：1含量顯著升高，添加1 mg·mL－1硝酸鈉后瘤胃內(nèi)C18：2cis-9，trans-11、C18：2trans-10，cis-12、UFA/SFA和丁酸弧菌屬含量顯著升高，表明硝酸鈉作為耗氫化合物可以影響亞油酸氫化途徑，使t11-C18：1形成增多，促進(jìn)了CLA的增加，低劑量硝酸鈉利于丁酸弧菌的生長和UFA/SFA的提高。這證明溶纖維丁酸弧菌有利于t11-C18：1和CLA的形成，而蛋白分解丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌對(duì)t11-C18：1氫化為C18：0的過程沒有影響。也有研究者［25］認(rèn)為丁酸弧菌不影響脂肪酸生物氫化反應(yīng)的進(jìn)行。有研究［26］報(bào)道在添加α-亞麻酸條件下，1 mg·mL－1硝酸鈉在抑制甲烷產(chǎn)生的同時(shí)能夠降低不飽和脂肪酸的生物氫化程度，提高CLA含量，本試驗(yàn)結(jié)果與之相類似。瘤胃微生物的組成、數(shù)量和生物氫化過程受到很多因素的影響，各個(gè)過程的氫轉(zhuǎn)移機(jī)制及相互關(guān)聯(lián)可做進(jìn)一步探究。

硝酸鈉在瘤胃的還原途徑以異化還原為主，如果反芻動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)攝入大量硝酸鈉，轉(zhuǎn)化過程中如亞硝酸鈉含量不能被及時(shí)分解利用，超過了微生物將其轉(zhuǎn)化為氨的能力時(shí)，就會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成毒害作用，所以必須嚴(yán)格控制使用劑量。有研究［27］表明硝酸鈉能降低甲烷產(chǎn)生的主要原因有兩個(gè)：競爭氫原子和對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷微生物的抑制。事實(shí)上，原蟲也是除產(chǎn)甲烷菌以外產(chǎn)生甲烷的主要來源［28］。硝酸鹽通過還原產(chǎn)物亞硝酸鹽對(duì)包括原蟲在內(nèi)的瘤胃微生物產(chǎn)生毒害作用，從而抑制原蟲［29］。在本試驗(yàn)中添加硝酸鈉后甲烷產(chǎn)量和原蟲數(shù)量顯著降低，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量在添加2、3 mg·mL－1硝酸鈉水平下顯著降低，非典型丁酸弧菌和亨氏丁酸弧菌數(shù)量在3 mg·mL－1硝酸鈉水平下顯著降低，也證實(shí)了硝酸鈉可以通過抑制產(chǎn)甲烷微生物來降低甲烷產(chǎn)量，并且高劑量硝酸鈉可能對(duì)瘤胃微生物產(chǎn)生了不利影響。孫雨坤［30］從肉羊體外試驗(yàn)得出隨著硝酸鹽濃度的增加，原蟲數(shù)量減少，甲烷濃度也隨之降低，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。添加1 mg·mL－1硝酸鈉后瘤胃總細(xì)菌、真菌及丁酸弧菌屬細(xì)菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組，可以看出低劑量硝酸鈉可以促進(jìn)瘤胃大多微生物的增加。硝酸鹽有降低甲烷排放和抑制亞油酸氫化的潛力，但需要結(jié)合更多的體內(nèi)試驗(yàn)總結(jié)出硝酸鹽的適宜添加量。

4 結(jié)論

體外添加0.25 mg·mL－1亞油酸條件下，1～3 mg·mL－1硝酸鈉均能抑制水牛瘤胃甲烷產(chǎn)生，并不影響TVFA含量。并且1 mg·mL－1硝酸鈉能促進(jìn)亞油酸生成CLA，升高EPA含量和UFA/SFA，優(yōu)化脂肪酸組成，并能增加總細(xì)菌、真菌、丁酸弧菌等大多數(shù)瘤胃微生物的數(shù)量。