李瑞靜，楊威利，延興學(xué)，李紀同，王瀟娜，張耀東

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室/河南省兒童神經(jīng)發(fā)育工程研究中心，河南 鄭州 450018)

腦膠質(zhì)細胞瘤是成人中最常見的一種原發(fā)性惡性腦腫瘤，盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤非常罕見，卻是癌癥發(fā)病和死亡的重要原因，尤其是在兒童和年輕人癌癥死亡中，分別占約30%和20%[1]，其中膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是惡性程度及病死率最高的腦膠質(zhì)瘤病理類型，5年生存率不足10%，年發(fā)病率在世界范圍內(nèi)不超過3/10萬，無明顯的區(qū)域差異，男性發(fā)病率略高于女性[2-3]，是最具侵襲性的亞型，患者的中位生存期約18個月[2]。目前，GBM的標準治療方案包括手術(shù)治療、結(jié)合放療和化療[4]，對于GBM患者的治療策略是在安全范圍內(nèi)最大限度地進行手術(shù)切除與放療、替莫唑胺化療結(jié)合。

由于GBM腫瘤細胞浸潤性生長和受腫瘤部位的制約，手術(shù)難以完整地切除腫瘤。放化療無法特異性地識別腫瘤細胞，且容易產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)大腦通過腦膜淋巴管與外周免疫系統(tǒng)相連[5]，這一發(fā)現(xiàn)使得腫瘤免疫治療有望成為GBM最具前景的治療策略，為其治療提供了新的方案。GBM有絲分裂活性大、微血管增生壞死且對放化療具有排斥反應(yīng)。臨床上具有預(yù)后不良、合并癥多、治療方式單一等特點[6]。在所有實體腫瘤中，高級別膠質(zhì)瘤的血管化最為明顯，新生血管增生與缺氧誘導(dǎo)的壞死已成為GBM的重要特征，這兩項特征與預(yù)后不良相關(guān)。GBM的特征在于廣泛的組織缺氧，與周圍空氣相比，即使是非腫瘤組織也顯示出較低的氧氣濃度。成年人體組織的生理氧氣狀況為2%～9%，遠低于吸入的空氣中的氧氣(20.8%)[7]。缺氧在GBM微環(huán)境中，塑造癌癥干細胞的表型，細胞異質(zhì)性是該細胞的特征，并導(dǎo)致難以指定有效的治療方法。膠質(zhì)瘤干細胞類細胞已被確定為腫瘤細胞的亞群，被認為是導(dǎo)致耐藥性的主要原因[8]。組織缺氧在癌細胞生長，新血管形成，浸潤，對化療、放療的耐受性及在治療復(fù)發(fā)后都具有重要作用[9]。對缺氧的適應(yīng)使得癌癥在腫瘤缺氧環(huán)境中發(fā)展，介導(dǎo)對減少的氧氣的適應(yīng)性反應(yīng)的主要機制是缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的激活[10]。

缺氧是GBM的攻擊行為和抵抗機制的重要原因，GBM是研究癌癥中缺氧的重要模型，缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIFs)的上調(diào)是對缺氧環(huán)境的主要適應(yīng)性細胞反應(yīng)[11]。本研究通過分析GBM在慢性缺氧條件下DNA修復(fù)基因表達及信號通路變化，進一步明確慢性缺氧引起GBM的分子機制，為GBM惡性腦腫瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1基因表達數(shù)據(jù) 慢性缺氧培養(yǎng)的人GBM數(shù)據(jù)(GSE139250)從NCBI基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO database)中下載。本研究分析數(shù)據(jù)包含3組：21%氧氣(正常組)、1%氧氣和0.1%氧氣(缺氧組)，每組包含12個重復(fù)芯片。

1.2數(shù)據(jù)分析方法 使用limma R包對GEO芯片數(shù)據(jù)進行差異基因表達分析，使用ggplot包繪制火山圖，使用pheatmap包對基因表達數(shù)據(jù)進行熱圖繪制。通過對差異基因集進行富集分析，可以找到不同條件下的差異基因與哪些生物學(xué)功能或通路顯著性相關(guān)。使用Gene Oncology軟件對改變量≥2倍的基因進行生物過程、細胞組成和分子功能分析，使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析軟件分析差異基因主要改變通路，并用String與Cytoscape軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行差異基因表達分析，其他數(shù)據(jù)分析采用相應(yīng)軟件默認統(tǒng)計學(xué)方法進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GBM慢性缺氧時DNA修復(fù)差異表達基因的分析 為了明確慢性缺氧對GBM細胞DNA修復(fù)表達基因的影響，使用limma R包將慢性缺氧的GBM數(shù)據(jù)(GSE139250)分為正常組(12個樣品)和缺氧組(24個樣品)兩組，進行差異基因表達分析，設(shè)置參數(shù)P<0.05,foldchange>2(即|log2FC|>1),并使用ggplot包繪制火山圖。GSE139250數(shù)據(jù)庫中只有180個基因通過差異篩選，差異基因表達分析結(jié)果顯示慢性缺氧時GBM有3個基因表達升高，4個基因表達降低(圖1)。對DNA修復(fù)基因表達數(shù)據(jù)進行熱圖繪制(圖2)，慢性缺氧時GBM的7個基因有差異表達，其中表皮生長因子受體(EGFR)是表皮生長因子家族成員的受體，研究已證實GBM的發(fā)生、發(fā)展與EGFR信號通路密切相關(guān)。

紅色代表上調(diào)的基因，藍色代表下調(diào)的基因，黑色為差異不顯著的基因。

紅色代表基因高表達,綠色表達基因低表達,樣本分為兩個組：缺氧組和對照組。

2.2DNA修復(fù)差異表達基因的分子功能富集分析 為進一步明確DNA修復(fù)差異表達基因的主要分子生物學(xué)功能，對差異表達基因使用Gene Oncology進行主要的生物過程、細胞組分及分子功能富集分析。結(jié)果顯示差異表達基因主要參與了對紫外線輻射的反應(yīng)、對DNA損傷刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對光刺激的反應(yīng)、細胞對非生物刺激的反應(yīng)、細胞對環(huán)境刺激的反應(yīng)、對電離輻射的反應(yīng)、肽絲氨酸修飾等生物過程。主要的分子功能為蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、肌動蛋白絲結(jié)合、蛋白質(zhì)C末端結(jié)合、泛素蛋白連接酶和泛素類蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和蛋白質(zhì)異二聚體活性等。見圖3。

圖3 慢性缺氧GBM DNA修復(fù)差異表達基因的生物過程、細胞組分和分子功能富集分析

2.3差異表達基因的信號通路富集分析 KEGG通路富集以P<0.05作為顯著性富集的閾值，從KEGG富集的結(jié)果中選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖，分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要與P53信號通路、志賀氏菌、胃癌、結(jié)直腸癌、癌癥中microRNA等通路相關(guān)(圖4)。蛋白互作分析結(jié)果顯示，慢性缺氧的GBM DNA修復(fù)差異表達蛋白存在兩兩相互作用(圖5)，對差異表達基因蛋白相互作用的可信度分析結(jié)果見表1。使用Cytoscape軟件對蛋白相互作用進行可視化,使用Centiscape2.2插件分析基因在網(wǎng)絡(luò)中的degree,使用degree的高低顯示基因的node大小，表中PARP1和ATR代表的node degree最大,表示這兩個基因相互作用的基因比較多,屬于熱點基因(表2)。

圖4 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因KEGG信號通路富集分析

圖5 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 String數(shù)據(jù)庫中慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白互作可信度

表2 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析中的node

3 討 論

GBM是腦惡性腫瘤中病死率最高和最常見的一種，其腫瘤細胞常常呈浸潤性生長，其侵襲轉(zhuǎn)移的能力與臨床預(yù)后密切相關(guān)。GBM也被稱為多形性GBM，是一種起源于星形膠質(zhì)細胞快速發(fā)展的、致死性的大腦腫瘤。GBM的發(fā)生和發(fā)展與EGFR信號通路密切相關(guān)。EGFR最常見的突變類型EGFRvⅢ在GBM的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。射線照射對人GBM U87細胞侵襲性具有促進作用，Wnt/β-catenin通路激活和侵襲性相關(guān)基因表達的增加是其可能機制。上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶表達可以促進GBM細胞株的生長、遷移和侵襲[12]。GBM的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的過程，其中IDH1、MGMT和P53在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[13]。異常的表觀基因組是GBM的主要危險因素，是最惡性和致命性的人腦腫瘤[14]。DNA修復(fù)酶MGMT的甲基化過高，可防止異常甲基化修復(fù)，是GBM患者對烷基化劑(包括替莫唑胺)反應(yīng)的有力預(yù)后生物標志物[15]。

GBM大部分表現(xiàn)為PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK信號通路的激活，因此被認為是GBM中常見的致癌改變[16]。腫瘤基因通路的激活，如受體酪氨酸激酶(RTKs)的激活，是惡性膠質(zhì)瘤最常見的基因改變之一。在原發(fā)性GBM中，57.4%的患者出現(xiàn)EGFR基因的擴增，通常伴隨該蛋白的外結(jié)構(gòu)域的激活突變，而在繼發(fā)性GBM患者中占8%[17]。PDGFRA基因擴增是RTK通路中常見的基因組改變，對兒童GBM和彌漫性橋腦膠質(zhì)瘤有顯著影響[18-19]。在小鼠GBM模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白響應(yīng)相關(guān)蛋白IRE1控制血管生成、侵襲和間充質(zhì)分化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白響應(yīng)相關(guān)蛋白PERK可以刺激GBM的增長，但未折疊的蛋白相關(guān)響應(yīng)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生中的直接作用有待證明[20]。格列本脲下調(diào)MCT1蛋白表達，可能通過抑制MCT1的表達，削弱氫離子和乳酸的外向轉(zhuǎn)運，使得細胞內(nèi)的酸化趨勢形成[21]。ABL2在GBM組織中表達較正常腦組織高，沉默ABL2表達可能通過調(diào)節(jié)pY-421cortactin的水平來抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲[22]。

有關(guān)研究表明，在基因突變的共同作用下，可能導(dǎo)致了GBM的形成。經(jīng)過對小鼠基因突變組合分析發(fā)現(xiàn)，B2m-Nf1、Mll3-Nf1和Zc3h13-Rb1共同導(dǎo)致GBM。確定了兩個基因的突變Pten 和Zc3h13，改變了Rb1基因突變的表達，從而增加了對化療藥物替莫唑胺的抗性[23]。

綜上所述，GBM的發(fā)生與發(fā)展是多基因、多種信號通路參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，基因突變、表觀基因組異常等均會引起GBM的形成。本研究通過生物信息學(xué)分析顯示，慢性缺氧會引起GBM中部分DNA修復(fù)相關(guān)基因表達異常，導(dǎo)致GBM酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)磷酸化和肌動蛋白異常，引起細胞DNA復(fù)制等過程中DNA損傷及細胞增殖與凋亡等，靶向DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)酪氨酸激酶激活和磷酸化過程等分子及相關(guān)信號通路，深入研究慢性缺氧引起GBM的分子機制，尋找抑制GBM遷移和侵襲的靶點，可能是GBM的潛在治療手段。