李 瓊， 耿 臻， 楊青春， 舒文濤， 李金花， 常世豪， 張東輝， 張保亮

(周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 周口 466001)

大豆(Glycinemax)起源于中國(guó)，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是植物蛋白、脂肪的重要來(lái)源[1]。黃淮海地區(qū)是我國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)之一，種植面積占全國(guó)的三分之一。大豆種質(zhì)資源是大豆品種改良的前提和基礎(chǔ)。黃淮海區(qū)域大豆種質(zhì)資源的篩選對(duì)遺傳背景的探索和遺傳資源的充分利用具有積極影響[2-3]。本研究通過(guò)對(duì)50份黃淮海大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，為該片區(qū)大豆種質(zhì)資源的利用和開(kāi)發(fā)提供必要信息，為育種材料的選擇提供重要的理論依據(jù)。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好和突變率高等優(yōu)點(diǎn)，蘊(yùn)含著多樣的多態(tài)性信息，是研究遺傳多樣性的手段之一[4-5]。目前，SSR廣泛應(yīng)用于大豆遺傳多樣性的研究過(guò)程中。王帥等[6]用SSR標(biāo)記分析大豆疫霉根腐病抗原的遺傳多樣性，篩選出5對(duì)高多態(tài)性SSR引物，構(gòu)建出60份抗性材料的指紋圖譜。李志江等[7]用SSR標(biāo)記對(duì)黑龍江種植大豆品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并篩選出與性狀關(guān)聯(lián)的SSR引物。金尚昆等[8]用SSR標(biāo)記對(duì)黃淮海地區(qū)284份材料進(jìn)行基因型分析，檢測(cè)出北京、河北材料多樣性最高。本試驗(yàn)基于42對(duì)SSR引物對(duì)黃淮海50份大豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確南、北居群間的親緣關(guān)系，為黃淮海大豆種質(zhì)資源的選擇和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料主要來(lái)源于周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆原始材料收集庫(kù)。將表1中黃淮海大豆種質(zhì)資源根據(jù)地理位置分為兩大居群，如表2。居群1(POP-Ⅰ)為33份黃淮海南部大豆種質(zhì)資源，居群2(POP-Ⅱ)為17份黃淮海北部大豆種質(zhì)資源。

表1 黃淮海50份大豆種質(zhì)育種來(lái)源情況

表2 黃淮海50份大豆種質(zhì)資源在2個(gè)居群中的分布情況

1.2 方 法

1.2.1大豆DNA的提取

選取籽粒飽滿的種子種植在育苗盤(pán)中，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)(25 ℃，光照8 h·d-1)培育出2片復(fù)葉。采集鮮嫩葉片按照CTAB法[9]提取DNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度，并稀釋至60 ng·μL-1，放置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2引 物

采用《2019年大豆國(guó)家區(qū)試品種報(bào)告》中檢測(cè)參試品種遺傳關(guān)系所用的42對(duì)引物[10]，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增及電泳

采用10 μL PCR反應(yīng)體系，2×TransTaq?-T PCR SuperMix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水3 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃冰箱保存待用。PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電壓220 V，時(shí)長(zhǎng)2.5 h，印染法染色，拍照。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

采用人工讀帶方法，將電泳圖片上可重復(fù)、易分辨的條帶標(biāo)記為“1”，同一位置無(wú)帶標(biāo)記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGEN 32軟件對(duì)所選群體的觀測(cè)基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)(I)[11]、遺傳距離(GD)、遺傳一致度(GI)。計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)[12]、NTSYS-PC軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(Gs)，按照非加權(quán)配對(duì)法UPGMA和SHAN程序進(jìn)行聚類分析，Eigen程序進(jìn)行主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物標(biāo)記多態(tài)性分析

所用的42對(duì)引物(見(jiàn)表3)共擴(kuò)增出203條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在102～340 bp之間，每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為2～10個(gè)，平均為4.83個(gè)，多態(tài)性條帶為189個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)為97.54%。其中，satt 184、satt 194、satt 373和satt 590的多態(tài)位點(diǎn)百分率較低，分別為85.71%、75.0%、83.33%和60%。多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.115 9～0.989 4，平均為0.721 6。PIC是用來(lái)衡量基因變異程度的指標(biāo)。 Botstein等[13]認(rèn)為，PIC<0.25時(shí)，為低度動(dòng)態(tài)性信息引物；0.250.5時(shí)，為高度動(dòng)態(tài)信息引物。本研究所用的42對(duì)引物中81%的引物位點(diǎn)的PIC均大于0.5，因此有34對(duì)引物位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，本研究所選取的42對(duì)引物具有較高的多態(tài)性。

表3 SSR引物多態(tài)性信息

2.2 黃淮海2個(gè)大豆種質(zhì)居群的遺傳多樣性和遺傳變異分析

由表4可知，供試的50份大豆種質(zhì)平均等位基因數(shù)(Na)為1.975 4，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.417 2，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.267 2，平均Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.421 2，多態(tài)位點(diǎn)百分率為97.54%。黃淮海北部大豆種質(zhì)的有效等位基因數(shù)(Na)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)均大于黃淮海南部。黃淮海北部大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性較黃淮海南部高，表明黃淮海北部大豆種質(zhì)資源較為豐富。兩個(gè)大豆居群的總遺傳多樣度(Ht)為0.270 4，居群內(nèi)遺傳多樣度(Hs)為0.259 1。居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.141 7，基因流(Nm*)為3.03。由此可見(jiàn)，14.17%的遺傳變異在兩個(gè)居群之間，85.83%的遺傳變異在居群內(nèi)部。黃淮海兩個(gè)大豆居群間差異較小，但居群內(nèi)部個(gè)體差異較大，居群間基因從一個(gè)居群到另一個(gè)居群的基因運(yùn)動(dòng)十分豐富。

表4 不同地理來(lái)源的大豆種質(zhì)的遺傳多樣性分析

2.3 黃淮海2個(gè)大豆種質(zhì)居群間的遺傳距離

利用POPGEN軟件處理數(shù)據(jù)結(jié)果可知，黃淮海大豆種質(zhì)資源南、北兩個(gè)居群的遺傳相似度(GI)為0.869 6，遺傳距離(GD)為0.210 9。由此可見(jiàn)，兩個(gè)居群間遺傳相似性高，遺傳距離較近。總體來(lái)說(shuō)，黃淮海南、北兩個(gè)大豆居群遺傳背景較為相似，親緣關(guān)系較近。

2.4 黃淮海大豆種質(zhì)資源聚類分析和主成分分析

利用NTSYS軟件對(duì)42對(duì)SSR引物所檢測(cè)出的188個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算并建立遺傳相似度矩陣，進(jìn)行UPGMA聚類(圖1)。由圖1可知，50份黃淮海大豆種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)(GS)的變化范圍為0.62～1。遺傳相似系數(shù)(GS)在0.620處，50份材料被分為兩個(gè)類群。類群Ⅰ包括36份材料，類群Ⅱ包括14份材料。其中，POP-Ⅰ中33份材料中有2份材料：石豆7號(hào)(P 10)、南圣105(P 44)被聚到類群Ⅱ中。POP-Ⅱ中17份材料中有5份材料P9(寧豆5號(hào))、冀豆12(P 11)、邯豆5號(hào)(P 13)、安07109(P 21)、安豆5156(P 27)被聚到類群I中。其余的43份(占總體種質(zhì)資源的86%)大豆種質(zhì)材料所處類群與POP-Ⅰ、POP-Ⅱ的居群分類情況一致。結(jié)果表明，兩個(gè)居群(POP-Ⅰ、POP-Ⅱ)中的大部分材料與UPGMA聚類結(jié)果一致，僅存在7份材料在黃淮海南、北部之間互相交錯(cuò)。因此，可推測(cè)黃淮海大豆種質(zhì)資源與地理分布具有顯著的相關(guān)性的同時(shí)，一定程度上與育種來(lái)源遺傳背景有所關(guān)聯(lián)。

利用NTSYS軟件對(duì)42對(duì)SSR引物所檢測(cè)出的188個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)分析所得遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，得出二維點(diǎn)散圖(見(jiàn)圖2)和三維立體點(diǎn)散圖(見(jiàn)圖3)。由圖2、圖3可以看出，兩者中聚類結(jié)果與UPGMA聚類(圖1)結(jié)果完全一致。進(jìn)一步證明了上述分成兩個(gè)類群結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。

3 討 論

3.1 黃淮海大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系

遺傳多樣性評(píng)價(jià)參數(shù)能夠反映種內(nèi)不同居群之間及居群內(nèi)部不同個(gè)體之間的遺傳變異水平[14-15]。Shannon’s信息指數(shù)(I)是衡量種群或地區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)是通過(guò)計(jì)算遺傳距離來(lái)分析種質(zhì)遺傳多樣性。本研究從處在黃淮海南、北部不同地理位置的兩個(gè)居群中選擇50份種質(zhì)材料進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析。大豆總體種質(zhì)平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.267 2，平均Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.421 2。表明黃淮海大豆遺傳多樣性較為豐富，具有多樣的遺傳關(guān)系。50份種質(zhì)的平均等位基因數(shù)(Na)為1.975 4，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.417 2。其中，POP-Ⅰ中33份種質(zhì)的平均等位基因數(shù)(Na)為1.926 1，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.401 6；POP-Ⅱ中17份種質(zhì)的平均等位基因數(shù)(Na)為1.926 1，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.414 0。等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)可以反映等位基因分布的均勻程度，2個(gè)指標(biāo)越接近，說(shuō)明等位基因分布越均勻[16-18]。因此，供試的50份大豆種質(zhì)間和兩個(gè)居群內(nèi)部各個(gè)種質(zhì)間的等位基因分布都較為均勻，有利于基因多樣性的穩(wěn)定遺傳。

3.2 種質(zhì)資源的聚類與地理來(lái)源的關(guān)系

劉新星等[19]、魏苗等[20]、董俊麗等[21]的研究認(rèn)為，SSR聚類與地理來(lái)源之間具有較大的相關(guān)性，分類結(jié)果基本與地理來(lái)源相一致，只有部分不同來(lái)源的材料聚到其他分類中。

本研究結(jié)果表明，50份黃淮海大豆種質(zhì)資源中，兩個(gè)居群(POP-Ⅰ、POP-Ⅱ)中86%的材料與UPGMA聚類和主成分分析(PCA)結(jié)果一致。其中僅石豆7號(hào)、南圣105這2份材料被聚類到黃淮海北部類群中，寧豆5號(hào)、冀豆12、邯豆5號(hào)、安07109、安豆5156這5份材料被聚類到黃淮海南部類群中，共有7份材料在黃淮海南、北部2個(gè)片區(qū)間互相交錯(cuò)。推測(cè)可能由于這些種質(zhì)一定程度上與育種單位的遺傳背景有所關(guān)聯(lián)。比如：石豆7號(hào)的父母本(晉遺16/冀豆4號(hào))均來(lái)自黃淮海北部，因此石豆7號(hào)被聚類到黃淮海北部類群中；冀豆12的母本為油83-14、邯豆5號(hào)的母本為徐8313均來(lái)自黃淮海南部，因此，冀豆12、邯豆5號(hào)被聚類到黃淮海南部類群中；寧豆5號(hào)更適于黃淮海灌溉區(qū)域種植，因此，其具有特殊的氣候環(huán)境要求。

種質(zhì)材料來(lái)源地或地理位置是影響種質(zhì)材料遺傳關(guān)系的重要因素，一般來(lái)自同一地區(qū)或地理生態(tài)區(qū)的種質(zhì)材料具有相近的遺傳信息，在聚類分析中就具有更為相近的遺傳距離。本研究聚類結(jié)果也已經(jīng)證實(shí)大豆居群的形成與其起源地的地理位置和氣候環(huán)境有著密切的關(guān)系。

3.3 黃淮海不同居群種質(zhì)資源遺傳多樣性比較

蓋鈞鎰等[22]分析中國(guó)栽培大豆不同生態(tài)類型群體間遺傳演化關(guān)系，表明中國(guó)栽培大豆不同生態(tài)類型群體間地理生態(tài)分化明顯時(shí)，遺傳距離較大。遺傳分化系數(shù)(Gst)代表不同群體間的遺傳分化水平，群體間遺傳分化系數(shù)越大說(shuō)明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[23]?；蛄?Nm*)是指生物個(gè)體從其發(fā)生地分散出去導(dǎo)致不同群體之間基因交流的過(guò)程，基因流的基本作用是削弱群體間的遺傳差異[24]。

本研究可知，2個(gè)居群的總遺傳多樣度(Ht)為0.270 4，居群內(nèi)遺傳多樣度(Hs)為0.259 1。居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.141 7，基因流(Nm*)為3.03。通過(guò)對(duì)黃淮海大豆南部、北部?jī)蓚€(gè)群體的分化關(guān)系和相似系數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，黃淮海兩個(gè)大豆居群間差異較小，但居群內(nèi)部個(gè)體差異較大。黃淮海兩個(gè)大豆居群間存在中低度分化，居群間基因交流十分豐富。兩個(gè)居群間遺傳距離較小，相似系數(shù)較大。推測(cè)可能由于黃淮海南、北地區(qū)地理位置較近，氣候環(huán)境相似，造成兩者遺傳基礎(chǔ)極為相似。黃淮海北部大豆種質(zhì)的有效等位基因數(shù)(Na)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)均大于黃淮海南部。黃淮海北部大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性較黃淮海南部高，黃淮海北部大豆種質(zhì)資源較為豐富。這與金尚昆等[8]認(rèn)為黃淮海地區(qū)不同省區(qū)中，北京和河北材料多樣性最高的結(jié)論一致。

推測(cè)可能由于山東、安徽、河南和江蘇的部分地區(qū)大豆推廣面積可觀，黃淮海南部是大豆在黃淮海地區(qū)的主要種植區(qū)域[25]。因此，黃淮海北部的育種單位在新品種選育過(guò)程中會(huì)選擇黃淮海南部種質(zhì)資源作為親本資源，進(jìn)而培育出適于黃淮海南部推廣的新品種；或者把在黃淮海北部表現(xiàn)晚熟的品種在黃淮海南部進(jìn)行參試、審定并推廣，無(wú)形中促進(jìn)了黃淮海南、北兩個(gè)居群之間和黃淮海南部居群內(nèi)部種質(zhì)資源的頻繁交流。然而，如果對(duì)黃淮海地區(qū)南、北部種質(zhì)資源中可作為優(yōu)良親本的種質(zhì)材料進(jìn)行重復(fù)利用，就會(huì)造成黃淮海地區(qū)大豆種質(zhì)遺傳背景趨于單一、遺傳多樣性指數(shù)有所降低和大豆生產(chǎn)推廣風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高。

4 結(jié) 論

本研究所用42對(duì)SSR引物具有豐富的多態(tài)信息。根據(jù)50份黃淮海大豆種質(zhì)材料的遺傳相似度聚類分析后，分為2個(gè)類群，UPGMA聚類結(jié)果與2個(gè)居群結(jié)構(gòu)基本一致。居群間遺傳距離較小，相似系數(shù)較大，存在中低度遺傳分化。居群內(nèi)部個(gè)體差異較大，居群之間存在豐富的基因交流。黃淮海北部大豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性較黃淮海南部高，黃淮海北部大豆種質(zhì)資源較為豐富。

研究黃淮海大豆種質(zhì)遺傳多樣性能夠充分了解該地區(qū)種質(zhì)資源的遺傳背景，在育種過(guò)程中應(yīng)盡量避免優(yōu)良親本的重復(fù)利用，減少相似遺傳背景的干擾，拓寬遺傳基礎(chǔ)。應(yīng)注重跨地區(qū)引種，合理利用不同時(shí)期育成的品種，有利于保持大豆的遺傳多樣性。