徐一仟，楊其穆，蔣丹丹，厲 梅，王衛(wèi)國，陳 創(chuàng)，李海洋

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，分離分析化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

離子遷移譜(IMS)是一種在電場作用下通過離子在中性氣體中遷移，從而實現(xiàn)離子分離與檢測的技術(shù)[1]。自20世紀30年代首次提出測量離子遷移率的方法后[2]，在20世紀60年代中葉，F(xiàn)ranklin GNO公司開發(fā)出第一臺商品化的IMS儀器，并應(yīng)用于軍工化學(xué)品的監(jiān)測[3-4]。此后一直到20世紀70年代，對IMS的理論研究、儀器結(jié)構(gòu)以及化學(xué)檢測能力的大量開創(chuàng)性研究為現(xiàn)代化的IMS儀器奠定了基礎(chǔ)[3,5-6]。自20世紀80年代中葉以來，通過改進樣品進樣方式、電離方法、離子注入技術(shù)以及離子分離技術(shù)，大大提高了IMS的分析性能[1]。IMS發(fā)展至今已具有三大技術(shù)優(yōu)勢[7]：1) IMS可與電離效率較高的大氣壓化學(xué)電離源聯(lián)用，獲得10-12量級的檢測限；2) IMS分析可在毫秒量級內(nèi)完成，且與色譜、質(zhì)譜分離相正交；3) 離子遷移率K與離子形狀、尺寸等結(jié)構(gòu)信息直接相關(guān)?；谇?種優(yōu)勢，IMS被廣泛用于化學(xué)戰(zhàn)劑、爆炸物、毒品及?；返默F(xiàn)場快速檢測，并發(fā)展成為一種主流核心技術(shù)[8-11]。如今，在世界各地的機場中，均可見到IMS儀器的身影[12]。配備預(yù)分離氣相色譜的IMS開始用于復(fù)雜樣品分析，如食品藥品質(zhì)量控制、工業(yè)過程控制、呼出氣分析等[13-17]。近年來，得益于后2種技術(shù)優(yōu)勢的結(jié)合，IMS在生物樣品分析中獲得了廣泛應(yīng)用[18-20]。一方面，IMS具有毫秒級分析速度，適合與色譜、質(zhì)譜聯(lián)用[21]，構(gòu)筑三維甚至四維分離系統(tǒng)[22]，滿足復(fù)雜樣品對高選擇性檢測的需求；另一方面，IMS通過離子遷移率K能夠獲得離子結(jié)構(gòu)信息，有助于生物分子異構(gòu)體及不同折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)分識別[23-24]。

在IMS中，主要依據(jù)離子與中性分子發(fā)生頻繁碰撞所表現(xiàn)出離子遷移率K的差異進行離子分離[1]。離子遷移率K是反映離子自身物理化學(xué)屬性的綜合常數(shù)，其不僅與離子的質(zhì)量m、價態(tài)z有關(guān)，還與離子碰撞截面ΩD(CCS)有關(guān)，示于式(1)。這使得IMS能夠在較寬氣壓范圍(約102～105Pa)內(nèi)工作。

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根據(jù)離子分離的實現(xiàn)方式[25]，IMS可分為遷移時間離子遷移譜(DTIMS)[26]、行波場離子遷移譜(TWIMS)[27]、阱離子遷移譜(TIMS)[28]、非對稱場離子遷移譜(FAIMS)[29]、吸入式離子遷移譜(AIMS)[30]等類型。與色譜類似，IMS的分辨率定義為2個離子峰的分離程度[31]。但在實際應(yīng)用中，為了便于對比不同IMS的分離性能，通常采用離子峰位置與其半高全寬的比值所定義的分辨能力作為替代[1]。DTIMS中，離子在均勻靜電場的驅(qū)動下線性遷移，離子遷移時間td、離子遷移率倒數(shù)1/K及離子碰撞截面ΩD互成比例關(guān)系。選擇任一尺度進行計算，均可得到一致的分辨能力和分辨率。對于具有非線性離子遷移機制的IMS，如TWIMS、TIMS等，由于1/K、ΩD與td不成線性關(guān)系，只有使用1/K或ΩD計算得到的分辨能力才能反映儀器的真實分離性能。目前，生物大分子構(gòu)象分析領(lǐng)域普遍采用基于離子碰撞截面ΩD計算得到的分辨能力比對不同儀器的性能，示于式(2)[32]。

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根據(jù)Shvartsburg等[29]定義，分辨能力超過80即為高分辨IMS，這是目前大多數(shù)商品化單機IMS所能達到的最高分辨能力。分辨能力超過200則為超高分辨IMS，可以使峰高相同、碰撞截面ΩD相差僅1%的2個譜峰實現(xiàn)基線分離[33]。目前，IMS技術(shù)中僅DTIMS、TWIMS、TIMS能夠?qū)崿F(xiàn)超高分辨。

本文將從超高分辨離子遷移譜的原理及技術(shù)，分辨能力的決定因素，優(yōu)缺點，以及在生物分子構(gòu)象分析中的應(yīng)用及存在的問題和未來的發(fā)展趨勢進行綜述。

1 超高分辨離子遷移譜技術(shù)

1.1 遷移時間離子遷移譜(DTIMS)

DTIMS是最早出現(xiàn)的IMS技術(shù)。1930年，Tyndall與Powell[34]以及Bradbury與Nielsen[2]采用DTIMS研究氣相離子遷移率K。1970年出現(xiàn)的世界首款軍用化學(xué)戰(zhàn)劑檢測儀(CAM)[12]和離子遷移譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(IMS-MS)[3]也基于DTIMS。樣品氣體進入DTIMS后，形成的連續(xù)離子流會被周期開啟的離子門斬切成離子團并注入長度L、電場E均勻的離子遷移區(qū)內(nèi)，遷移率K不同的離子先后到達離子檢測極，最終形成離子信號強度I對應(yīng)離子遷移時間td的譜圖，示于圖1。其中，離子遷移率K可以通過測量離子遷移時間td直接得到，示于公式(3)。結(jié)合公式(1)，可進一步獲得離子碰撞截面ΩD，無需任何標定。目前，特殊設(shè)計的DTIMS可以將標準物離子遷移率K的測量精度控制在±0.1%以內(nèi)，作為常規(guī)儀器中目標物離子遷移率K測量的參考標準[35]。

圖1 遷移時間離子遷移譜結(jié)構(gòu)(a)及離子分離原理圖(b)Fig.1 Structure of drift time ion mobility spectrum (a) and the principle of ion separation (b)

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DTIMS通過單次測量(約10 ms)可獲得離子遷移率K全譜，并可通過多譜圖平均提高信噪比進而降低檢測限。但當DTIMS檢測離子遷移率K差異較大的不同離子時，要求離子門具有極低的離子歧視效應(yīng)，以消除離子遷移率K對離子團的初始時域?qū)挾鹊挠绊慬26,36]。

影響DTIMS分辨能力的因素有很多，如1) 離子團的擴散展寬；2) 離子團注入的初始時間寬度；3) 放大器響應(yīng)畸變；4) 離子團之間的庫侖斥力等。目前，已有較完善的理論模型對上述因素進行綜合分析[37]。其中，普遍認為1)和2)是主要的影響因素，由離子遷移時間td、離子團注入的初始時間寬度tg、擴散系數(shù)D以及離子遷移速度vd，可以計算得到條件分辨率Rp，示于式(4)[38]。由于其他類型IMS僅考慮離子運動對分辨能力的影響，因此，其分辨能力的理論模型將僅考慮離子團擴散展寬的制約。

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DTIMS既可以在大氣壓條件下工作(AP-DTIMS)，也可以在低氣壓條件下工作(LP-DTIMS)。在大氣壓條件下，AP-DTIMS可與高效大氣壓化學(xué)電離源直接聯(lián)用以獲得高離子產(chǎn)率和靈敏度。另外，由于中性分子數(shù)密度N很高，即使施加較高的遷移區(qū)電壓U，AP-DTIMS內(nèi)約化遷移電場E/N仍很低(小于5 Td)，并且遠低于擊穿極限。從式(4)可以看出，通過優(yōu)化離子團注入效果可以提高分辨能力。Du等[39]通過建立BN型離子門的三區(qū)理論，示于圖2，發(fā)現(xiàn)增加離子門的關(guān)門電壓可以增大BNG后的電場強度，對注入離子團的空間壓縮效應(yīng)隨之增強，即離子有效注入寬度t′g減小，對Cl-的分辨能力Rp由18增至33。在此基礎(chǔ)上，Du等[40]通過在BN型離子門后放置1片金屬柵網(wǎng)，使關(guān)門電壓對門后電壓的影響局限于BNG和該柵網(wǎng)之間，從而達到進一步增強BNG后電場的目的，使分辨能力進一步提高至60。但在BNG中，隨著離子門的關(guān)門電壓升高，離子團壓縮效應(yīng)增強，清空區(qū)也會增大，對離子遷移率的歧視效應(yīng)增強。

Chen等[26]基于TP型離子門，通過提高2個柵網(wǎng)之間的電勢差，提高了TPG的離子注入效率，從而在極窄的tg內(nèi)保證極低的遷移率歧視效應(yīng)，示于圖3。在長9.65 cm的AP-DTIMS中通過提高關(guān)門電勢差，將DMMP的分辨能力提升至100左右，并實現(xiàn)2個遷移率極相近(ΔK=0.04 cm2/(V·s))譜峰的基線分離。

注：a.BN型離子門的SIMION模型；b.BN門后的三區(qū)劃分示意圖；c.圖a中x1=20 mm及x2=21 mm處的三區(qū)Ey特征線圖2 BN型離子門周圍的電場分布特征及離子門關(guān)門時的三區(qū)電場劃分[39]Fig.2 Characteristics of electric field distribution around BN type ion gate and the three-zone division when ion gate was closed[39]

圖3 通過增強TPG柵網(wǎng)之間電勢差實現(xiàn)丙酮離子峰的分離[26]Fig.3 Separation of acetone ion peaks by enhancing potential difference between TPG grids[26]

在此基礎(chǔ)上，Chen等[41]繼續(xù)發(fā)展了一種離子雙場時空壓縮技術(shù)，通過在TPG后4 mm處放置1片金屬柵網(wǎng)，改變離子門的控制模式，將注入的離子團進行連續(xù)兩級壓縮，從而將離子門性能提升至2倍左右，保證較高靈敏度的同時實現(xiàn)較寬遷移率范圍(0.644～2.032 cm2/(V·s))內(nèi)的高分辨，示于圖4。

圖4 雙場壓縮離子門模式下，各個時間段內(nèi)離子的注入及壓縮過程示意圖[41]Fig.4 Elelctric potential in each state and the schemetic of the ion injection and compression process under dual-compression ion gate mode[41]

在保證離子門控注入和離子檢測極具超快響應(yīng)速度的前提下，可以通過提高遷移區(qū)電壓U來優(yōu)化AP-DTIMS的分辨能力。電壓U與遷移區(qū)電場E、長度L直接相關(guān)，即U=EL，僅受電源實際輸出能力的限制。Kirk等[33]通過在遷移區(qū)長15 cm的AP-DTIMS上施加25 kV高壓，將單電荷小離子(如DMMP、苯、甲苯、丙酮)的分辨能力提升至250～260，是目前報道的DTIMS所能達到的最高分辨能力。另外，遷移區(qū)電壓U較低時，增大離子價態(tài)z可以提高分辨能力。Clemmer等[42]通過在遷移區(qū)長63 cm的AP-DTIMS上施加10 kV高壓，對單電荷C60團簇離子的分辨能力達到172，而負4價有機六聚體離子的分辨能力則達到240。

LP-DTIMS與質(zhì)譜聯(lián)用，可簡化離子傳輸區(qū)域的匹配設(shè)計，還可以使用前置離子漏斗或離子阱進行離子預(yù)存儲或選質(zhì)。雖然二者聯(lián)用有諸多優(yōu)勢，但仍無法獲得類似AP-DTIMS的超高分辨能力，因為在幾Torr氣壓范圍內(nèi)，中性分子數(shù)密度N極低，遷移區(qū)電壓U不能無限制的提高。一方面，受到實驗過程可容許E/N最大值的約束；另一方面，受到遷移區(qū)擊穿極限E/N值的約束。此時，遷移區(qū)電壓U可表示為遷移區(qū)最大場強Emax與遷移區(qū)長度L的乘積，即U=EmaxL。在不超過遷移區(qū)擊穿極限的前提下提高E/N值，既可以獲得更高的分辨能力，還可以對離子進行加熱，進而研究離子遷移率K隨E/N的變化規(guī)律。Kirk等[36]將LP-DTIMS與三態(tài)離子門控注入技術(shù)相結(jié)合，達到了消除遷移率歧視的效果，在長度30 cm、工作氣壓20 mbar的遷移區(qū)內(nèi)施加120 Td的E/N，對水楊酸甲酯單價離子的分辨能力可達到140。基于此，Maria等[43]進一步研究了E/N在20～115 Td之間變化時，H3O+(H2O)n、NO+(H2O)n、O2+(H2O)n等離子遷移率K的變化規(guī)律。當實驗測試要求較低的E/N值時，LP-DTIMS普遍采用長度1 m以上的遷移區(qū)來獲得高分辨能力。Bowers等[44]發(fā)展了一種IMS-MS，采用遷移區(qū)長2 m、工作氣壓為15～20 mbar的LP-DTIMS，在5 kV遷移區(qū)電壓下對血管緊張素Ⅱ正二價離子的分辨能力達到109。

目前，AP-DTIMS和LP-DTIMS均已經(jīng)用于商品化IMS-MS中。例如，美國Agilent公司[45]推出的IM-QTOF 6560采用工作氣壓5 mbar、遷移區(qū)長80 cm的LP-DTIMS，其分辨能力僅80左右；瑞士Tofwerk公司[46]推出的IMS-TOF采用氣壓可調(diào)的AP-DTIMS，在離子復(fù)用模式下，可以實現(xiàn)約200的分辨能力；美國Excellims公司[47]推出基于AP-DTIMS的MA3100，其可與商品化超高分辨質(zhì)譜儀(如LTQ-Orbitrap等)直接聯(lián)用。

1.2 行波場離子遷移譜(TWIMS)

DTIMS的分離性能受到遷移區(qū)可施加最高電壓U的限制，為了克服LP-DTIMS因這一限制無法獲得超高分辨能力的問題，開始出現(xiàn)低氣壓條件下通過延長離子飛行距離來獲得超高分辨的技術(shù)。

首先出現(xiàn)的是TWIMS，由Giles等[27]于2004年提出。美國Waters公司于2006年推出了首款商品化TWIMS儀器[27](Synapt HDMS Systems)，后于2011年和2013年又推出了2款第二代TWIMS儀器[48](Synapt G2-S和Synapt G2-Si)。TWIMS遷移區(qū)由環(huán)狀電極同軸疊合構(gòu)成，在mbar氣壓范圍內(nèi)工作，示于圖5。一方面，遷移區(qū)內(nèi)相鄰環(huán)狀電極按照周期交替方式分別施加正、負射頻電壓[49]，對遷移區(qū)內(nèi)軸向遷移的離子進行徑向約束聚焦；另一方面，遷移區(qū)內(nèi)僅一小部分環(huán)狀電極上施加沿遷移區(qū)軸向逐環(huán)向前推進的脈沖電壓，于遷移區(qū)內(nèi)形成幅度和波速可控的行波電場，驅(qū)動離子在行波電場中不斷翻越波峰和波谷做沖浪運動。遷移率K越小，離子跟隨行波電場前進的能力越差，遷移時間越長。由于離子在行波電場中做沖浪運動，離子遷移速度與遷移率K不再呈線性相關(guān)，并會受到行波電場類型及其電場強度分布特征的影響[50]。在理想的三角波行波電場中，離子遷移速度與遷移率K2相關(guān)；假定電場的波速正好能夠驅(qū)動最大遷移率Kmax的離子隨波遷移，離子遷移時間td,TW可由式(5)得到[50]。進一步由碰撞截面ΩD計算得到的分辨能力Rp,TW可表示為式(6)[50-51]，其中e/16ln(2)kB是常量，可表示為C。

圖5 行波場離子遷移譜中離子分離原理[27]Fig.5 Ion separation principle of traveling wave ion mobility spectrum[27]

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在Emax、L等參數(shù)相同時，TWIMS分辨能力可以達到DTIMS的2倍。不同于DTIMS，TWIMS遷移區(qū)電壓UTW與遷移區(qū)內(nèi)行波場的波數(shù)m有關(guān)，即UTW=EmaxL/2m。當行波寬度固定時，UTW與遷移區(qū)長度L無關(guān)，因此，TWIMS可以在固定遷移區(qū)電壓UTW下任意改變遷移區(qū)長度L，從而獲得超高分辨能力。

對于第一代和第二代商品化TWIMS儀器，其分辨能力通常較低，約10[27]～40[48]。近幾年，出現(xiàn)了2種通過延長離子飛行路徑獲得超高分辨TWIMS的技術(shù)。第1種技術(shù)采用循環(huán)路徑的環(huán)形離子遷移譜(Cyclic-IMS)，由Giles等[52]于2014年首次提出，Waters公司于2019年推出了基于該技術(shù)的最新款Select Series Cyclic IMS儀器[53]。Cyclic-IMS在mbar氣壓條件下工作，環(huán)形軌道上離子輸入和輸出共用1個端口。離子進入Cyclic-IMS后，可以在行波電場的驅(qū)動下進行多圈飛行，離子飛行路徑正比于離子飛行圈數(shù)n，即nL，因此Cyclic-IMS的分辨能力隨著n1/2增大而增大。根據(jù)Giles等[53]最近的報道，當離子飛行圈數(shù)達到100圈時，離子的飛行路徑可達98 m，單電荷肽SDGRG和GRGDS的分辨能力可達750。射頻聚焦電場可以使離子在較長的飛行距離下仍保持10%以上的離子傳輸效率。在Cyclic-IMS中，遷移率K分布較寬時，速度快的離子會與速度慢的離子譜圖重疊。因此，通?？s減遷移率K的范圍來保證離子具有相同的飛行圈數(shù)。

第2種技術(shù)被稱為無損離子傳輸結(jié)構(gòu)(SLIM)，由Smith等[54]于2014年首次報道。最近，該技術(shù)已被MOBILion公司商品化。SLIM由蝕刻在PCB板上的平板條狀電極構(gòu)成，加工方便。SLIM在mbar氣壓下工作，通過射頻聚焦電場的輔助，離子可以在SLIM中穩(wěn)定存儲數(shù)小時以上[55]，并且能夠在長達1 km的距離上進行近似無損傳輸[56]。SLIM內(nèi)還可以設(shè)置離子操控結(jié)構(gòu)，控制離子進行90°折彎傳輸[57]、同分離層內(nèi)不同傳輸路徑間切換[57]、不同分離層間切換[58]等，在有限的結(jié)構(gòu)尺寸內(nèi)構(gòu)筑超長的離子飛行通道。例如，單分離層SLIM的離子飛行通道已從最初的44 cm[59]延長到13.5 m[56]。Smiths等[56]通過控制離子在SLIM中13.5 m長的分離通道內(nèi)進行40圈往復(fù)飛行，將離子有效飛行距離延長至540 m，獲得離子的分辨能力高達1 860，是已有報道的最高水平。但是，由于行波電場強度有限，離子飛行時間的延長會造成譜峰展寬、信噪比降低，因此，SLIM需通過基于SLIM的離子漏斗注入[60]、SLIM內(nèi)離子捕集[61]、SLIM內(nèi)離子團壓縮[61]等技術(shù)增大離子數(shù)密度，提高信噪比。

1.3 阱離子遷移譜(TIMS)

TIMS是一種通過利用對向施加的高速氣流和直流電場對離子的共同作用，從而增長離子有效遷移距離的IMS技術(shù)，由Fernandez-Lima等[62]于2011年首次報道。最近，Bruker公司基于該技術(shù)推出了商品化儀器timsTOF fleX。TIMS的離子分離區(qū)內(nèi)通過施加流速為vg的高速氣流推動離子向著接收極運動，同時施加強度隨分離區(qū)軸線位置線性變化、方向與氣流相反的位置電場阻止離子的遷移，示于圖6[63-64]。離子進入TIMS后，當電場驅(qū)動離子的遷移速度與氣流速度達到平衡時，即vg=KE，離子停止運動。如此，遷移率K不同的離子將會靜止在TIMS分離區(qū)軸線的不同位置，被分離和富集。緩慢降低位置電場平臺區(qū)的強度(洗脫電場)Ee，分離區(qū)中的離子將按照遷移率K由小到大的順序依次洗脫，進入離子檢測極或質(zhì)譜中進行檢測。類似TWIMS，TIMS也在mbar氣壓范圍工作，需要使用射頻電場對分離區(qū)內(nèi)的離子進行徑向約束。不同的是，TIMS采用四等分結(jié)構(gòu)的電極環(huán)，施加射頻后形成的離子聚焦電場為四極場。

圖6 阱離子遷移譜的結(jié)構(gòu)(a)及離子分離原理圖(b)Fig.6 Structure of trap ion mobility spectrum (a) and the diagram of ion separation principle (b)

TIMS的分析時間tmeas,TIMS與洗脫電場的掃描速度β及離子遷移率K的分布范圍有關(guān)，示于式(7)[51]。相對于DTIMS和TWIMS，TIMS可以省去從離子注入至遷移率K最大離子到達檢測極的這段死時間。在實際分析中，tmeas,TIMS還與離子洗脫傳輸過程中的非線性項有關(guān)，導(dǎo)致離子遷移率K和碰撞截面ΩD無法直接計算求得[65]。因此，TIMS通常需要標定才能獲得準確的遷移率K及碰撞截面ΩD數(shù)值[66]。

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TIMS的分辨能力Rp,TIMS可表示為式(8)，增大vg或者降低β均可以提高Rp,TIMS。Park等[64,67]使用β=3 356 V/(m·s)的掃描速度對泛素蛋白7價離子的分辨能力達到295，而使用β=2 691 V/(m·s)的掃描速度對m/z1 822單價離子的分辨能力僅為228。然而，增大vg的同時需要保證Emax條件下Kmin的離子仍能夠被捕集于離子分離區(qū)內(nèi)，即vg=KminEmax；降低β的同時會造成tmeas,TIMS的延長及譜峰的展寬，進而引起譜峰信噪比的降低。為解決這些問題，一方面，可以在TIMS離子分離區(qū)的前端設(shè)置前級離子漏斗對離子源中的離子進行預(yù)存儲，以提高離子利用效率[68]；另一方面，可以采用非線性洗脫電場掃描的方法，僅對感興趣的遷移率K范圍進行高分辨掃描，從而降低分析時間。這種非線性掃描方法有助于TIMS與速度較慢的質(zhì)譜(如FT-ICR)進行配接[69]。

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2 超高分辨離子遷移譜的應(yīng)用

對天然大分子進行結(jié)構(gòu)解析以了解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，一直是質(zhì)譜學(xué)中備受關(guān)注的領(lǐng)域之一。由于IMS可以在毫秒內(nèi)通過質(zhì)量m、價態(tài)z以及碰撞截面ΩD等因素的差異實現(xiàn)離子分離，因此IMS與質(zhì)譜聯(lián)用(IM-MS)可以使離子在m/z分離的基礎(chǔ)上，根據(jù)CCS的差異進行二維分離，可用于分析脂質(zhì)[70]、聚糖[71-72]以及蛋白質(zhì)[73-75]等生物大分子的結(jié)構(gòu)，以及分離質(zhì)譜無法分離的異構(gòu)體[76-77]，在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析以及異構(gòu)體分離等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。隨著目標樣品復(fù)雜性的增加，分辨率較低(R約70)的IMS已經(jīng)無法滿足分離構(gòu)象差異(ΔCCS%約0.5%)生物大分子的需求[32]，而超高分辨IMS可以幫助解決這一難題。此外，通過超高分辨IMS有助于獲取高精確度的CCS值，以建立CCS標準數(shù)據(jù)庫。

由于DTIMS中的離子處于低場(E/N<2 Td)環(huán)境中，并在均勻恒定的靜電場驅(qū)動下進行線性遷移，離子的CCS值可以直接通過式(1)與式(3)中的遷移時間td轉(zhuǎn)換得出。理論上，通過精準測量實驗參數(shù)并控制測量誤差，DTIM-MS無需標準物的校準即可得到最精確的CCS值[78]。而當DTIM-MS進行在線分析時(例如與LC或GC聯(lián)用)，則需通過已知CCS值的目標離子進行標定。Stow等[79]通過對比3個使用Agilent IM-QTOF 6560儀器的實驗室檢測氮氣氣氛下120種離子DTCCSN2結(jié)果的重現(xiàn)性，其相對標準偏差(RSD)僅為0.29%。Tim等[80]依據(jù)EURACHEM通過蒙特卡洛模擬得到步進場和固定場2種CCS值測量方法得出的實驗結(jié)果，相對理論值的偏差分別為2.7%～4.6%、4.7%～9.1%。DTIM-MS可用于多類生物大分子的結(jié)構(gòu)分離及其CCS值的精準測定。May等[81]通過分辨率約為60的IM-Q-TOF MS測定出季銨鹽、脂質(zhì)、多肽以及聚糖等4類大分子的CCS值，從而對比不同類別分子之間的結(jié)構(gòu)差異，具有較高的檢測精度(±0.5%)。Groessl等[82]通過分辨率為250的Tofwerk IMS-TOF分離CCS值不同的脂質(zhì)異構(gòu)體，并且測量了130個大分子的K及CCS值，測量精確度約為1.3%，有助于建立相應(yīng)的CCS標準數(shù)據(jù)庫。但目前DTIMS-MS無法實現(xiàn)分離構(gòu)象更接近的生物大分子。

隨著TWIMS中超高分辨cIM以及SLIM等技術(shù)的發(fā)展，TWIM-MS已經(jīng)可以實現(xiàn)約1 860的分辨能力[56]，這使其在構(gòu)象分離領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。David等[83]通過增大cIM-MS的飛行圈數(shù)(n=4)，使分辨率達到約240，根據(jù)CCS以及m/z對紅藻細胞壁中提取的天然低聚糖混合物進行分離并推斷其具體結(jié)構(gòu)，進一步增大飛行圈數(shù)(n=58)，分辨率可達約920，能夠分離開2個K極為接近(ΔCCS%約0.05%)的同分異構(gòu)體。Hollerbach等[84]通過總長約為43 m的多級TW-SLIM-TOF MS，實現(xiàn)2個反向肽離子(ΔCCS%約1.5%)的分辨率由190增至560，更重要的是，這種儀器結(jié)構(gòu)可以在較大的遷移率檢測范圍(3.0～1.2 cm2/(V·s))內(nèi)仍具有超高分辨的能力。由于TWIMS中施加的射頻行波電壓使其電場非線性，因此無法通過td直接得出CCS，需通過已知CCS值的標準物對目標離子進行校準標定[85]，即TWCCS=DTCCS*μ1/2/z。一些影響因素將導(dǎo)致TWIM-MS測定CCS值的精確度較低[82]，如校定CCS時使用與目標物結(jié)構(gòu)相差較大的標準物[86]，不同平臺間漂氣溫度的差異以及TW振幅可能引起的離子過熱等。Hinnenkamp等[87]分別通過DTIM-MS及TWIM-MS對120種小分子離子的CCS值進行測定，發(fā)現(xiàn)二者檢測部分化合物CCS值的結(jié)果相差6.2%。Li等[88]通過TW-SLIM-TOF MS檢測不同類大分子的CCS值，相對DTIMS的檢測結(jié)果偏差為1%～2%。

正如1.3節(jié)所述，TIMS可以通過增大vg或降低β來實現(xiàn)超高分辨能力[89]，其分辨率可達到DTIMS分辨率的3～8倍，并且由于TIMS具有優(yōu)異的占空比，更易與MS正交[68]。TIMS-MS主要用于研究蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)表征，Park等[90]通過增加vg至100 m/s，減小洗脫電壓的掃描速度δ至10 V/m，對多肽離子的分辨率可增至約250。為擴大TIMS檢測的遷移率范圍，F(xiàn)ouque等[91]通過對TIMS的電極環(huán)進行重新設(shè)計，以增強對較小遷移率離子(約0.524 cm2/(V·s))的捕集效果，通過增大vg以及降低β使分辨率達到約400，從而實現(xiàn)對幾類蛋白質(zhì)大分子(約924 kDa)異構(gòu)體的分離分析，并建立了22種蛋白質(zhì)CCS標準數(shù)據(jù)庫，其CCS測量結(jié)果的重復(fù)性以及與DTIMS的檢測結(jié)果相關(guān)性(R2=0.998 9)均較高。與TWIM-MS相似，TIMS-MS要獲得準確的CCS值，同樣需要標準物對目標離子進行校準標定，而標定的過程不可避免的會帶來一定的誤差。Naylor等[92]通過將雙柵PCBIMS與TIMS-TOF耦合，從而可以在同一平臺上直接測定離子精確的CCS值，避免了因標定過程引起的測量偏差，二者測定標準物K0的偏差約為1%，與文獻中K0的偏差約為5%。

3 總結(jié)與展望

近年來，伴隨著分辨能力超過200的超高分辨IMS技術(shù)的快速發(fā)展，出現(xiàn)了多種高性能商品化IMS-MS儀器，這為復(fù)雜樣品(特別是生物樣品)中分子構(gòu)象的分析提供了重要的方法和工具。目前，不同的超高分辨IMS技術(shù)仍具有自身的局限性。例如，盡管TIMS和SLIM技術(shù)能夠?qū)MS的分辨力提高到接近1 000的水平，但其面臨著分析時間長、遷移率K窗口窄、需要特殊標定、離子熱化效應(yīng)影響測量精度等問題。在未來發(fā)展中，基于不同超高分辨IMS技術(shù)串聯(lián)實現(xiàn)各自優(yōu)缺點互補，將成為超高分辨IMS技術(shù)的一個重要發(fā)展方向。