吳 健 陳 嘉 顏 杰 張建明（通信作者） 廣州國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東，廣州，510635）

鄧卓暉 裴福全 林榮幸 廣東省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病研究所（廣東，廣州，511430）

瘧疾是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要寄生蟲(chóng)病，2020 年世界衛(wèi)生組織《瘧疾報(bào)告》［1］數(shù)據(jù)顯示2019年全球瘧疾感染病例2.29 億，死亡病例40.9 萬(wàn)。

瘧疾預(yù)防的關(guān)鍵在于病例早發(fā)現(xiàn)、早治療。 隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步， 新的瘧疾檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，但也存在一定的局限性，相對(duì)而言人工顯微鏡檢查法成本低、準(zhǔn)確度高，可以進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定，在瘧疾的診斷和治療中仍然有著不可替代的作用，一直是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［2］。但是，顯微鏡檢查需要技術(shù)人員經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)的訓(xùn)練，積累長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)，具備純熟的技能，而且人工顯微鏡檢勞動(dòng)強(qiáng)度大，技術(shù)人員易產(chǎn)生疲勞而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果受到影響。 本項(xiàng)目應(yīng)用人工智能技術(shù)，開(kāi)發(fā)可用于瘧原蟲(chóng)血涂片自動(dòng)掃描存儲(chǔ)圖像信息、自動(dòng)識(shí)別瘧原蟲(chóng)的自動(dòng)圖像掃描和識(shí)別系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲(chóng)自動(dòng)圖像掃描及識(shí)別系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)系統(tǒng)）

1.1.2 瘧原蟲(chóng)陰性及陽(yáng)性薄血膜涂片 收集2017-2020 年10 月期間廣東省疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病研究所保存的來(lái)源于廣東省內(nèi)瘧疾確診病例的薄血膜涂片434 張，包括陽(yáng)性薄血膜392 張，陰性薄血膜42 張。 陽(yáng)性薄血膜包含惡性瘧原蟲(chóng)252 例、卵形瘧原蟲(chóng)73 例、間日瘧原蟲(chóng)51 例、三日瘧原蟲(chóng)8例以及混合感染8 例。

1.2 方法

1.2.1 薄血膜涂片自動(dòng)圖像采集 推片染色制作好的薄血膜涂片放置到專(zhuān)用玻片架上，在掃描區(qū)域滴加鏡油，玻片架每次可放5 張，設(shè)置相應(yīng)的掃描視野數(shù)，放入玻片架，啟動(dòng)設(shè)備，自動(dòng)進(jìn)行圖像對(duì)焦、掃描和存儲(chǔ)。

1.2.2 薄血膜自動(dòng)識(shí)別 系統(tǒng)利用人工智能軟件對(duì)所掃描的圖像進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，對(duì)判斷為瘧原蟲(chóng)的圖像進(jìn)行標(biāo)注， 包括不同發(fā)育時(shí)期的瘧原蟲(chóng)形態(tài)（環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體），并根據(jù)判斷結(jié)果進(jìn)行如下提示：

1）目標(biāo)物少，需人工審閱；

2）可確定為pf；

3）pf 可能性較大；

4）pv 或po 可能性較大；

5）無(wú)提示。

其中，提示第2）至4）即可判斷為鏡檢陽(yáng)性。

（注：pf 指惡性瘧原蟲(chóng)，pv 指間日瘧原蟲(chóng)，po 指卵形瘧原蟲(chóng)，pm 指三日瘧原蟲(chóng)）

1.2.3 人工閱片

1.2.3.1 人工鏡下閱片： 由閱片經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員按照常規(guī)方法進(jìn)行人工鏡下閱片，判斷是否感染瘧原蟲(chóng)及所感染瘧原蟲(chóng)種類(lèi)。

1.2.3.2 圖像人工審閱 調(diào)取系統(tǒng)自動(dòng)采集的每個(gè)薄血膜視野的圖像信息進(jìn)行人工審閱，首先審閱系統(tǒng)標(biāo)注且顯示出的瘧原蟲(chóng)形態(tài)，其次逐個(gè)審閱系統(tǒng)拍攝的每個(gè)視野圖像信息，綜合驗(yàn)證系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 閱片數(shù)量及無(wú)效原因

人工及系統(tǒng)分別閱片434 張，其中有效薄血膜涂片308 張，無(wú)效薄血膜涂片126 張。 無(wú)效的原因主要為血涂片本身質(zhì)量問(wèn)題， 最多見(jiàn)的是溶血，其次是薄血膜厚薄不均勻、染色過(guò)深造成染料團(tuán)塊沉積或過(guò)淺細(xì)胞未著色、雜質(zhì)過(guò)多、甲醇不純，細(xì)胞固定不佳、樣本保存不當(dāng)，薄血膜劃痕較多等。

2.2 系統(tǒng)自動(dòng)掃描時(shí)間

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，系統(tǒng)自動(dòng)掃描時(shí)間為每張薄血膜涂片掃描500 個(gè)視野用時(shí)6min， 掃描1000 個(gè)視野用時(shí)9min。 系統(tǒng)自動(dòng)掃描時(shí)間包含了薄血膜涂片自動(dòng)圖像采集和薄血膜自動(dòng)識(shí)別時(shí)間。

人工鏡下閱片時(shí)間根據(jù)薄血膜中瘧原蟲(chóng)的密度、分布范圍、感染情況而有所不同，每張薄血膜涂片閱片時(shí)間可在3-30min 不等。

2.3 系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)識(shí)別的準(zhǔn)確性

以人工鏡下閱片的診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置系統(tǒng)每張薄血膜自動(dòng)掃描500 個(gè)視野，并對(duì)識(shí)別出的瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)體形態(tài)進(jìn)行標(biāo)注，人工審閱系統(tǒng)標(biāo)注的陽(yáng)性圖像，認(rèn)為所有的標(biāo)注中，只要出現(xiàn)一個(gè)標(biāo)注是瘧原蟲(chóng)即視為陽(yáng)性，比較人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片的結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片結(jié)果比較

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，人工鏡下閱片與系統(tǒng)閱片兩種方式對(duì)瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性涂片檢出結(jié)果一致，兩種閱片方式檢出結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Χ2=198.31，P=0.258），系統(tǒng)閱片對(duì)瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性涂片的檢出率為96.3%。

圖1 拍攝20×25 共500 個(gè)視野的總覽，“點(diǎn)擊獲取實(shí)時(shí)識(shí)別信息”可看到四種標(biāo)注形態(tài)。

圖1 鏡下標(biāo)記瘧原蟲(chóng)圖像

圖2 為惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體，系統(tǒng)對(duì)拍攝到的視野進(jìn)行識(shí)別，自動(dòng)標(biāo)注出環(huán)狀體形態(tài)，以左側(cè)小圖顯示，點(diǎn)擊小圖可顯示大圖，如右側(cè)圖，紅框處為該環(huán)狀體。 系統(tǒng)支持回到該視野功能，點(diǎn)擊“回到”可返回視野位置，通過(guò)顯微鏡人工觀察。

圖2 鏡下標(biāo)標(biāo)球狀體及放大圖

2.4 系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)種識(shí)別的準(zhǔn)確性

結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，系統(tǒng)對(duì)不同種類(lèi)瘧原蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （Χ2=14.328，P<0.001）， 其中對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的識(shí)別和蟲(chóng)種鑒定能力最強(qiáng)，鑒定正確率可達(dá)到90.9%。

表2 系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)種的識(shí)別結(jié)果

2.5 不同掃描視野數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

取低密度（密度小于1000/μL）瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性薄血膜22 張，陰性薄血膜10 張，分別進(jìn)行500 視野/片和1000 視野/片掃描，結(jié)果如表3。

表3 不同掃描視野數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)卡方檢驗(yàn)， 進(jìn)行500 和1000 視野/片兩種不同視野數(shù)的掃描時(shí)，瘧原蟲(chóng)的陽(yáng)性檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Χ2=54.824，P=0.657）。

3 討論

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，借助其快速、自動(dòng)的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合數(shù)字圖像處理和模式識(shí)別的自動(dòng)識(shí)別研究正成為病原學(xué)臨床輔助診斷的新興方向。 自動(dòng)圖像識(shí)別系統(tǒng)是將傳統(tǒng)的人工識(shí)別與計(jì)算機(jī)圖像處理及模式識(shí)別相結(jié)合的技術(shù)，通過(guò)采集大量圖像信息，對(duì)目標(biāo)圖像的顏色、紋理、形狀、染色特性等圖像特征進(jìn)行自動(dòng)提取和分析，根據(jù)人工智能算法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理形成的一套識(shí)別系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)各類(lèi)病原體鏡下圖像的自動(dòng)分類(lèi)識(shí)別。 在寄生蟲(chóng)卵、抗酸桿菌等的臨床輔助診斷方面已有初步應(yīng)用［3-4］。

瘧原蟲(chóng)的自動(dòng)圖像識(shí)別系統(tǒng)通過(guò)自動(dòng)而快速地識(shí)別被瘧原蟲(chóng)感染的細(xì)胞并鑒定所感染的瘧原蟲(chóng)種類(lèi)，在人力條件不允許的情況下，可以及時(shí)有效地檢出瘧疾病例，極大減少瘧疾診斷對(duì)技術(shù)人員的依賴(lài)，有利于有效控制瘧疾傳播，對(duì)瘧疾防控具有重要意義。 國(guó)外學(xué)者較早開(kāi)展了相關(guān)研究，其研究表明通過(guò)利用專(zhuān)門(mén)的圖像處理和模式識(shí)別算法對(duì)顯微圖像進(jìn)行自動(dòng)處理是一種可行的自動(dòng)化診斷方法［5-8］。 國(guó)內(nèi)，殷竹君等較早對(duì)100 張瘧原蟲(chóng)血液涂片進(jìn)行識(shí)別簽定，總體識(shí)別率達(dá)90%［9］。

本研究通過(guò)對(duì)大量即往瘧疾病例的薄血膜圖像掃描，分析提取其不同蟲(chóng)種、蟲(chóng)種不同生活周期的形態(tài)特征，應(yīng)用人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自我學(xué)習(xí)功能，建立起一套瘧原蟲(chóng)自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)。

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)可以較為準(zhǔn)確地抓取到瘧原蟲(chóng)的各類(lèi)圖像，其陽(yáng)性檢出率可達(dá)到96.3%；從瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)種識(shí)別情況看，系統(tǒng)對(duì)各種瘧原蟲(chóng)的辨識(shí)能力各不相同，其中以對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定能力最強(qiáng)，可以達(dá)到90%左右，但是對(duì)于間日瘧、卵形瘧、三日瘧、混合感染的鑒定能力不足，分析原因可能因?yàn)椋簮盒辕懺x(chóng)感染在全球范圍內(nèi)都占絕大多數(shù)（90%以上），卵形瘧、間日瘧及三日瘧感染病例數(shù)占比很少，尤其三日瘧，因此能夠獲得的陽(yáng)性涂片數(shù)量不足，可供系統(tǒng)學(xué)習(xí)的圖像數(shù)量有限。

因?yàn)楸⊙ぶ械寞懺x(chóng)蟲(chóng)體形態(tài)特征明顯，易于識(shí)別和分辨， 而在厚血膜中形態(tài)特征不明顯，且因溶血而缺少了血細(xì)胞的參照， 更給識(shí)別增加難度，因此本研究主要針對(duì)薄血膜進(jìn)行，國(guó)內(nèi)外的研究也多是如此。 但Kaewkamnerd 等［10］也曾報(bào)道針對(duì)厚血膜開(kāi)發(fā)的瘧原蟲(chóng)自動(dòng)識(shí)別軟件，主要利用惡性瘧原蟲(chóng)與間日瘧原蟲(chóng)染色質(zhì)的大小進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果其間日瘧鑒定準(zhǔn)確性為75%，惡性瘧鑒定準(zhǔn)確性則可達(dá)到90%。

如何減少因薄血膜靈敏度低而造成的假陰性，尤其是血涂片中瘧原蟲(chóng)密度低時(shí)（<1000/μL），是需要思考和解決的問(wèn)題。 我們選取部分密度較低的血涂片，分別進(jìn)行500 視野與1000 視野的掃描，結(jié)果表明在增加掃描視野后， 檢出陽(yáng)性率略有提高，但是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果不具有顯著性差異，但不排除掃描視野數(shù)再增加后可能發(fā)生的變化。

在對(duì)大量血涂片的圖像掃描研究中發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)室的血涂片質(zhì)量參差不齊，所采用的染色方法也存在瑞氏染色和姬姆薩染色兩種不同，為圖像自動(dòng)識(shí)別帶來(lái)不便。 前期血涂片制備的標(biāo)準(zhǔn)化可明顯改善圖像的質(zhì)量，提高圖像識(shí)別的敏感性、準(zhǔn)確性，因此集合制片、染片和圖像掃描于一體的自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備是本項(xiàng)目后續(xù)的研究方向。