李 苗

（中國(guó)機(jī)械進(jìn)出口（集團(tuán)）有限公司，北京 100037）

0 引言

2009年10月28日，中機(jī)公司與圭亞那電力照明公司成功簽訂了圭亞那輸變電項(xiàng)目的EPC總承包合同，該項(xiàng)目?jī)?nèi)容主要包括：架設(shè)110公里輸電線(xiàn)路、新建7個(gè)變電站、擴(kuò)建和改造原有3個(gè)變電站、鋪設(shè)2.1公里海纜、架設(shè)95公里69千伏高壓輸電線(xiàn)路和154公里的ADSS通訊光纜，項(xiàng)目總工期為912天。

南美洲圭亞那國(guó)地處熱濕的赤道地區(qū)，常年濕度高、溫度變化小，平均氣溫在24～32°C之間，全年有兩個(gè)雨季，常年濕熱多雨，年均降水量超過(guò)1600～3000mm，相對(duì)濕度為70%～100%，高溫多濕的環(huán)境條件有利于輸變電金屬設(shè)備材料表面的微生物生長(zhǎng)，容易促進(jìn)金屬銹蝕。此外，由于變電站和輸電線(xiàn)路的所使用的設(shè)備和材料，常常會(huì)安裝在戶(hù)外，會(huì)經(jīng)受長(zhǎng)年累月的自然環(huán)境侵蝕，包括風(fēng)吹、日曬和雨淋，這些都促進(jìn)了設(shè)備和材料的表面微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致金屬銹蝕。

通常情況下，微生物腐蝕（Microbiologically Influenced Corrosion，MIC）導(dǎo)致的金屬腐蝕，是因腐蝕微生物在金屬表面繁衍和新陳代謝，進(jìn)而改變了金屬理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，從而引起金屬電化學(xué)腐蝕[1]。微生物腐蝕對(duì)工農(nóng)業(yè)眾多部門(mén)造成了巨大影響和經(jīng)濟(jì)損失，全球因微生物腐蝕造成的經(jīng)濟(jì)損失約占總腐蝕的20%[2]。因此，微生物腐蝕的有效防治迫在眉睫，而對(duì)金屬銹蝕相關(guān)微生物的研究也具有非常重要的意義。

與金屬銹蝕相關(guān)的微生物在生理上是多樣的，其中細(xì)菌廣泛參與鋼、鐵、銅、鋁及其合金腐蝕過(guò)程，如硫酸鹽還原菌、硫氧化菌、鐵氧化及還原菌、錳氧化菌和有機(jī)酸分泌菌[2,3]。目前，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)金屬銹蝕材料中細(xì)菌物種多樣性及其作用已有相關(guān)報(bào)道，但研究多基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，并根據(jù)其形態(tài)、生理、生化等實(shí)驗(yàn)來(lái)確定細(xì)菌種類(lèi)，例如，對(duì)銹蝕樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)以鑒定其種類(lèi)[4]，其局限性在于培養(yǎng)條件的限制導(dǎo)致許多細(xì)菌種類(lèi)無(wú)法培養(yǎng)，也有采用克隆文庫(kù)的方法進(jìn)行金屬腐蝕材料中細(xì)菌多樣性研究[5,6]，但僅僅分析序列的通量低，從而無(wú)法完全反映樣本中的細(xì)菌群落情況。

目前，基于DNA測(cè)序的高通量技術(shù)廣泛地運(yùn)用到環(huán)境樣本中微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)研究[7,8]，其可以深度揭示環(huán)境中豐富的微生物多樣性，包括大量可培養(yǎng)及未培養(yǎng)的微生物類(lèi)群。目前為止，利用高通量測(cè)序來(lái)分析金屬銹蝕材料中細(xì)菌物種多樣性及其群落組成的研究報(bào)道較少。

圭亞那輸變電項(xiàng)目已經(jīng)順利建成和移交，而設(shè)備在服役過(guò)程中的銹蝕與防護(hù)問(wèn)題是今后關(guān)注的重點(diǎn)。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)圭亞那輸變電周?chē)鷧^(qū)域金屬銹蝕樣品中細(xì)菌物種多樣性及其群落組成進(jìn)行研究，揭示了該區(qū)域具腐蝕作用的微生物種類(lèi)，這將為設(shè)備供貨商的研發(fā)人員提供在設(shè)備防銹蝕策略方面的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究地點(diǎn)和樣品采集

采樣地點(diǎn)位于南美洲圭亞那輸變電項(xiàng)目工程沿線(xiàn)周?chē)鷧^(qū)域（如圖1所示），6份金屬銹蝕樣品均使用表面消毒（75%乙醇）的采樣鏟采集，將采集的金屬銹蝕樣品直接放入TWIRL’EM無(wú)菌采樣袋（Labplas Inc., Sainte-Julie, QC, Canada）。采樣時(shí)間為2015年4月，總共采集6個(gè)金屬銹蝕樣品（如表1所示）。在圭亞那期間，采集后的銹蝕樣品置于-20°C冰箱中，直至空運(yùn)帶回國(guó)。

表1 圭亞那輸變電周?chē)鷧^(qū)域金屬銹蝕樣品的數(shù)據(jù)信息

圖1 圭亞那輸變電周?chē)鷧^(qū)域金屬銹蝕樣品采集地點(diǎn)

1.2 微生物DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

每個(gè)銹蝕樣品約0.25g通過(guò)PowerSoil DNA提取試劑盒（MO BIO Laboratories，San Diego，CA，USA）進(jìn)行微生物總DNA的提取。對(duì)DNA樣品中16S rRNA 基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為338F（5'-條碼-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R （5'-條碼-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）[9]。PCR反應(yīng)體系（50μL）：5×PCR buffer（with Mg2+）4μL；2.5mmol/L dNTP 2μL；5μmol/L P1 （338F）0.8μL；5μmol/L P2（806R）0.8μL；5U/μL Taq 酶0.4μL；DNA模板2μL；ddH2O10μL。PCR反應(yīng)條件：95°C 3min；95°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，30個(gè)循環(huán)；72°C 1min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后回收產(chǎn)物條帶，Qubit 測(cè)定濃度并連接接頭完成文庫(kù)構(gòu)建。其中，PCR實(shí)驗(yàn)及其定量、純化、文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序，均由華大基因有限公司完成，測(cè)序使用Illumina Miseq PE300測(cè)序平臺(tái)，產(chǎn)生300 bp配對(duì)雙端序列。原始序列數(shù)據(jù)存入NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA347281）。

1.3 序列處理及數(shù)據(jù)分析

配對(duì)末端讀取原始的DNA片段使用Flash軟件[10]合并配對(duì)序列，配對(duì)序列根據(jù)分配給每個(gè)樣本的獨(dú)特條碼來(lái)識(shí)別，合并時(shí)配對(duì)序列需要具有部分重疊區(qū)域。原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量使用QIIME 1.8.0軟件處理[11]（Caporaso et al.，2010），不能組裝的序列被丟棄。操作分類(lèi)單元（OTU）使用UPARSE軟件按照97%序列相似性進(jìn)行聚類(lèi)[12]；使用UCHIME進(jìn)行嵌合序列的識(shí)別和刪除[13]。單克隆序列被刪除。16S rRNA基因序列的分類(lèi)是通過(guò)RDP[14]對(duì)Silva rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://www.arb-silva.de/）進(jìn)行比對(duì)確定（80%的置信度閾值）。利用MicrobiomeAnalyst（Marker Data profiling，MDP，https://www.microbioeanalyst.ca/）在線(xiàn)分析平臺(tái)[15]分析細(xì)菌群落的物種豐富度（Chao1指數(shù)）、多樣性（香濃指數(shù)，H）、在門(mén)、綱、目、屬水平上的群落組成、聚類(lèi)及熱力圖分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌群落物種豐富度及多樣性

對(duì)6份銹蝕樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析，總共發(fā)現(xiàn)139626個(gè)序列，可劃分為522個(gè)可操作分類(lèi)單元。每個(gè)銹蝕樣品中OTU數(shù)量在91～303之間（如表1所示）。測(cè)序覆蓋率為99.83%～99.91%（如圖2所示），表明數(shù)據(jù)有效可靠。利用Chao1指數(shù)和香濃指數(shù)比較不同樣品中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性（如圖3所示），結(jié)果顯示6份不同銹蝕樣品中細(xì)菌群落在物種豐富度及多樣性指數(shù)方面存在一定差異，其中樣品G2細(xì)菌群落的物種豐富度及多樣性指數(shù)最低，而樣品G6細(xì)菌群落的物種豐富度及多樣性最高。

圖2 6份金屬銹蝕樣品中細(xì)菌群落的稀釋度曲線(xiàn)

圖3 6份金屬銹蝕樣品中細(xì)菌群落豐富度及多樣性

2.2 細(xì)菌群落組成

將高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，6份銹蝕樣品中總共獲得分類(lèi)學(xué)地位明確的細(xì)菌有13門(mén)、24綱、64目、166屬，此外，還存在部分未指定分類(lèi)的細(xì)菌種類(lèi)?？傮w而言，優(yōu)勢(shì)門(mén)為放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、奇異球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chlor of lexi）。同時(shí)不同銹蝕樣品在優(yōu)勢(shì)門(mén)也存在一定差異，例如放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）在樣品G2和G4中最為優(yōu)勢(shì)，而變形菌門(mén)（Proteobacteria） 在樣品G1和G6中最為優(yōu)勢(shì)，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在樣品G3中最為優(yōu)勢(shì)，綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）在樣品G5中最為豐富。

6份銹蝕樣品總體統(tǒng)計(jì)，優(yōu)勢(shì)綱包括放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、噬纖維菌綱（Cytophagia）、酸桿菌綱（Acidobacteria）、β-變形菌綱（ Betaproteobacteria）、異常球菌綱（Deinococci）；優(yōu)勢(shì)目包括噬纖維菌目（Cytophagales）、紅色桿菌目（Rubrobacterales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、異常球菌目（Deinococcales）等；優(yōu)勢(shì)屬包括 囊胚菌屬（Blastocatella）、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、螺狀菌屬（ Spirosoma）、甲基桿菌屬（Methylobacterium） 、放線(xiàn)孢菌屬（Actinomycetospora）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等（如圖4所示）。

圖4 6份金屬銹蝕樣品中細(xì)菌門(mén)、綱、目、屬水平的組成柱狀圖

此外，根據(jù)不同細(xì)菌目在6份銹蝕樣品中的豐度進(jìn)行聚類(lèi)分析，從而反映6份銹蝕樣品間在細(xì)菌群落相似性、差異性及聚類(lèi)關(guān)系。熱圖（如圖5所示）結(jié)果顯示，不同的銹蝕樣品在目水平上存在差異，其中樣品G1，G5和G6聚在一起，樣品G2、G3和G4聚在一起。

圖5 6份金屬銹蝕樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)在目水平的熱圖分析

3 討論

微生物腐蝕依賴(lài)于組成生物膜的微生物種類(lèi)及其生物膜生長(zhǎng)的因素[16]。目前為止，人們還未能完全了解微生物參與金屬腐蝕過(guò)程的機(jī)理，其重要原因在于，人們對(duì)組成生物膜的微生物仍然知之甚少，本研究采用Illumina高通量測(cè)序方法對(duì)圭亞那輸變電周?chē)鷧^(qū)域金屬銹層中細(xì)菌群落進(jìn)行分析，有利于了解該區(qū)域金屬銹蝕過(guò)程中細(xì)菌群落組成情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，圭亞那6份金屬銹蝕樣品中，優(yōu)勢(shì)門(mén)為放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、奇異球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi），其中變形菌門(mén)中優(yōu)勢(shì)菌綱α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。上述研究與前期他人研究有所不同，例如，欒鑫等[5]通過(guò)分子克隆測(cè)序，研究海水環(huán)境中Q235碳鋼銹層中微生物群落的多樣性，發(fā)現(xiàn)13個(gè)已知的菌門(mén)，包括變形菌門(mén)；擬桿菌門(mén)；硅藻門(mén)；酸桿菌門(mén)；浮霉菌門(mén)；硝化螺旋菌門(mén)；厚壁菌門(mén)；綠彎菌門(mén)；疣微菌門(mén)；綠菌門(mén)；放線(xiàn)菌門(mén)；紅藻門(mén)以及螺旋體門(mén)。內(nèi)外銹層的優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門(mén)。

根據(jù)種類(lèi)及功能的不同，腐蝕微生物可以分為硫酸鹽還原菌、硫氧化菌、產(chǎn)酸菌、鐵氧化細(xì)菌、鐵還原細(xì)菌、硝酸鹽還原菌以及產(chǎn)粘液細(xì)菌等[2,3]。但本研究中，高通量測(cè)序并未發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的硫酸鹽還原菌（例如，Desulfovibrio）、硫氧化菌（例如，Thiobacillus）、產(chǎn)酸菌（例如，Acetobacter）、鐵氧化細(xì)菌（例如，Aciditiobacillus）、鐵還原細(xì)菌（例如，Geobacter）、硝酸鹽還原菌（例如，Klebsiellamobilis），僅僅發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)粘液細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬（Bacillus）及假單孢菌屬（Pseudononas），它們?cè)诮饘俦砻婺墚a(chǎn)生大量胞外多聚物，這在微生物腐蝕中起著重要作用，是形成的生物膜的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，能使周?chē)h(huán)境在有氧與無(wú)氧之間轉(zhuǎn)化，形成適宜其他腐蝕相關(guān)微生物生長(zhǎng)的微環(huán)境[17]。本研究揭示了圭亞那輸變電周?chē)鷧^(qū)域金屬銹層中細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果表明其細(xì)菌群落豐富多樣，但由于許多細(xì)菌種屬金屬銹蝕作用尚未明確，所以在本研究中高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種屬還需后續(xù)深入功能研究。

目前，對(duì)于微生物腐蝕的防治只能延緩腐蝕，其中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)是防治金屬微生物腐蝕的重要措施，對(duì)腐蝕過(guò)程中微生物群落多樣性、群落組成及生物膜的厚度等進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有助于我們采取控制措施，高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可以用于早期監(jiān)控，通過(guò)早期監(jiān)測(cè)來(lái)采取控制措施從而減緩銹蝕，避免事故發(fā)生。

如果能阻止微生物接觸到金屬，或者微生物在金屬表層是處于非活性狀態(tài)，或者使金屬表面維持電化學(xué)穩(wěn)定，那么腐蝕相關(guān)微生物的活動(dòng)是不會(huì)影響金屬銹蝕?；谏鲜鲈恚⑸锓栏胧┛煞譃槲锢矸椒ǎㄗ贤饩€(xiàn)、超聲波、電離輻射、機(jī)械清除法）、化學(xué)方法（亞硝酸鹽和硝酸鹽等殺菌劑或抑菌劑）、電化學(xué)保護(hù)（陰極保護(hù)電位）、表面改性法（表面添加防護(hù)涂層，包括鍍鉻、鍍鋅、油漆、塑料、有機(jī)涂層等）[18-20]?？紤]到圭亞那輸變電工程后續(xù)維修成本，建議對(duì)輸變電設(shè)備進(jìn)行防護(hù)涂層處理，同時(shí)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)金屬表層微生物群落進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，對(duì)發(fā)現(xiàn)的早期金屬銹蝕進(jìn)行有效防護(hù)處理，如采用物理或化學(xué)方法進(jìn)行除菌或抑菌處理。比如，對(duì)剛剛出現(xiàn)起泡現(xiàn)象的設(shè)備金屬外殼進(jìn)行去銹、打磨、刷涂冷鍍鋅油漆等。另外，建議相關(guān)研發(fā)部門(mén)在設(shè)備表面的涂層中添加某些可以抑制或者殺滅該地區(qū)相關(guān)微生物的某些藥品，以便在更大程度上減少金屬銹蝕現(xiàn)象。