伍曉麗， 韓 娟， 劉 飛， 莫讓瑜， 潘 媛， 陳大霞*， 王 鈺

(1.重慶市中藥研究院 種植研究所，重慶 400065；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3. 中藥資源學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；4.重慶市中藥研究院 大健康中心，重慶 400065；5.重慶科技學(xué)院，重慶 401331)

黃連(CoptischinensisFranch)又稱味連，以根莖入藥，是我國大宗、重要的藥用植物。具清熱瀉火，燥濕解毒等多種功效，在很多中藥配方中均有使用[1]。根腐病是近年來黃連生產(chǎn)中的重要病害之一，在四川、重慶、湖北等主要產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。連農(nóng)曾經(jīng)使用多菌靈、百菌清等多種化學(xué)農(nóng)藥對(duì)該病進(jìn)行防治，但效果不佳。深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes，DSE)是定居在植物根部與植物形成共生關(guān)系的一類真菌，在根內(nèi)形成顏色深，有明顯隔膜的菌絲和微菌核，這是DSE區(qū)別于其他內(nèi)生真菌的重要特征。DSE菌落顏色多樣，有淺灰、灰綠、褐色、深棕色、黑色等，有的菌株分泌深色色素[2-3]。DSE在植物中普遍存在，114科320屬約600多種植物根部均發(fā)現(xiàn)DSE定殖，這些植物在高山、荒漠、極地、寒帶、溫帶、熱帶等不同生境及極端環(huán)境地區(qū)均有廣泛分布[4]。DSE的功能類似菌根，可以增強(qiáng)植物抗逆境能力，提高其對(duì)病蟲害的防御能力，促進(jìn)植物吸收和利用養(yǎng)分等，是目前研究的熱點(diǎn)菌群[5-6]。因此，DSE被廣泛應(yīng)用于多種植物的抗病研究，張曉蓉等[7]發(fā)現(xiàn)DSE甘瓶霉Phialophoramustea可以顯著緩解尖孢鐮刀菌抑制番茄生長(zhǎng)的癥狀；農(nóng)倩等[8]篩選到1株DSE L-14，對(duì)香蕉枯萎病的防效達(dá)到72.4%；胡麗杰[9]從寧夏枸杞根部分離到鐮刀菌屬DSE菌株NQ8GII4，其發(fā)酵液對(duì)葡萄灰霉病的防效高達(dá)82.05%，與化學(xué)藥劑腐霉利的效果相當(dāng)。目前尚無黃連DSE的相關(guān)研究報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃連根條中DSE菌株Cadophoraorchidicola的分離頻率與根腐病有明顯關(guān)系，健康根條中該菌分離頻率高達(dá)20%，明顯高于根腐病根條中該菌的分離頻率1.52%。因此，本研究對(duì)健康/根腐病植株中DSE分離頻率及多樣性進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并對(duì)重慶、四川、湖北等黃連主產(chǎn)區(qū)不同年生健康黃連DSE定殖情況進(jìn)行了調(diào)查，以揭示DSE定殖與根腐病發(fā)生的關(guān)系及DSE的定殖情況，為利用DSE促進(jìn)黃連生長(zhǎng)發(fā)育，提高黃連抗逆抗病能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 ①DSE分離材料來源: 2018年9月在重慶石柱四個(gè)黃連主產(chǎn)地沙子鎮(zhèn)、冷水鎮(zhèn)、黃水鎮(zhèn)、楓木鎮(zhèn)，每地點(diǎn)選采樣地2塊(二年生、三年生黃連各1塊)，每個(gè)地塊按五點(diǎn)法分別采集二年生、三年生健康/根腐病黃連，每點(diǎn)1株，每個(gè)地塊10株，每個(gè)地點(diǎn)20株，每個(gè)地點(diǎn)二、三年生的健康株10株混合成一個(gè)樣品，病株10株混合成一個(gè)樣品，共計(jì)8個(gè)樣品。取回后立即進(jìn)行DSE的分離和鑒定。采樣點(diǎn)詳細(xì)地理信息見表1。②DSE定殖情況調(diào)查材料來源:2019年6月在重慶、四川、湖北等黃連主產(chǎn)地區(qū)采集健康黃連進(jìn)行DSE定殖情況調(diào)查統(tǒng)計(jì)。每個(gè)地區(qū)選擇1塊樣地，按五點(diǎn)法采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)4株，共計(jì)20株/樣地。采樣點(diǎn)詳細(xì)地理信息見表2。

表1 石柱采樣點(diǎn)地理信息

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋)。

1.1.3 試劑與儀器 B518259 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工Sangon Biontech)；RR178 Fungi Identification PCR Kit (Takara)；FAA固定液[10]。超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)；水平電泳儀(DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)； PCR儀(PTC-100，Bio-rad)；凝膠成像儀(Gel Doc XR，Bio-rad)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-75KB，上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)[10]。

1.2 方法

1.2.1 深色內(nèi)生真菌分離純化 取健康和患根腐病的黃連須根，清水漂洗去泥土，洗衣粉水洗1 min，流水沖洗1 h,75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗1 min,無菌水漂洗1次，無菌濾紙吸干，0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))升汞滅菌2 min,無菌水清洗4次，無菌濾紙吸干，剪小段，接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20 ℃黑暗培養(yǎng)[10]3 d后，每天觀察，挑取組織周圍長(zhǎng)出的真菌菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，長(zhǎng)成深色菌絲純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 采樣點(diǎn)地理信息

1.2.2 深色內(nèi)生真菌分子鑒定 ①真菌基因組DNA提取：采用柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒，按照說明書操作提取基因組DNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。②ITS 序列PCR擴(kuò)增：用RR178試劑盒擴(kuò)增真菌ITS 序列。擴(kuò)增體系(50 μL)：ddH2O 20 μL，PCR premix 25 μL，真菌DNA模板 4 μL，ITS1和ITS4 Primer 各0.5 μL。引物序列：ITS1為TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4為TCCTCCGCTTATTGAT-ATGCPCR。擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)39次；72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送華大基因公司測(cè)序[10]。

1.2.3 深色內(nèi)生真菌離體回接 所有分離到的深色真菌，根據(jù)分子鑒定結(jié)果，同種的選1～2株菌進(jìn)行離體回接，菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)10～15 d至菌絲長(zhǎng)滿平皿。剪取健康黃連根條(長(zhǎng)約3～4 cm)，無菌水清洗數(shù)次，無菌濾紙吸干水分，置于菌絲上共培養(yǎng)，4條根/皿，3皿/菌株，25 ℃黑暗培養(yǎng)10～15 d后觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。以水瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的健康黃連根條作為對(duì)照[11]。

1.2.4 DSE顯微觀察 插片法對(duì)經(jīng)過離體回接篩選出的疑似DSE菌絲進(jìn)行顯微觀察是否有隔。

1.2.5 黃連根部DSE定殖情況調(diào)查 每塊樣地取黃連20株，每株上剪取1 cm長(zhǎng)根條10條，于FAA固定液保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前清水漂洗3～4次，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH 90 ℃離解60 min，清水漂洗4～5次，乳酸中和后鏡檢。根樣上滴清水1～2滴制片，電子顯微鏡下觀察并拍照，每條根觀察5個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中微菌核和DSE菌絲的定殖情況。使用SPSS 20 軟件對(duì)黃連DSE定殖率和定殖強(qiáng)度進(jìn)行比較。定殖率(%)=(定殖根段數(shù)/鏡檢根段總數(shù))×100%，定殖強(qiáng)度(%)=(DSE感染視野數(shù)/總視野數(shù))×100%[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連根部深色內(nèi)生真菌種屬、離體回接結(jié)果及形態(tài)特征

經(jīng)分子鑒定，從健康和患根腐病的黃連根部共計(jì)分離出深色內(nèi)生真菌16株，屬于10個(gè)屬。其中6株離體回接表現(xiàn)致病性，不屬于DSE。其余10株不致病，屬于6個(gè)屬，顯微觀察有隔，確認(rèn)屬于DSE(表3，圖1、2)。

表3 黃連根部深色內(nèi)生真菌分子鑒定結(jié)果和離體回接結(jié)果及形態(tài)特征

圖1 深色內(nèi)生真菌離體回接Fig.1 In vitro infection of dark endophytic fungiA、B：離體回接不致病的菌株 ；C、D：離體回接致病的菌株A，B：The non-pathogenic fungi； C，D：The pathogenic fungi

圖2 部分DSE菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig.2 Morphology of DSEA、B、C、D：DSE菌落；E、F：類似微菌核結(jié)構(gòu)；G、H：糖葫蘆串結(jié)構(gòu)；I、J、K、L：菌絲A，B，C，D：DSE colony；E，F(xiàn)：Structure similar tomicrosclerotia；G，H：String structure； I，J，K，L：Mycelium

2.2 健康/根腐病黃連根部DSE分離頻率比較

無論是不同地方分別統(tǒng)計(jì)還是4個(gè)地點(diǎn)的總體統(tǒng)計(jì)，DSE的分離頻率健康植株均高于根腐病植株。且二者的優(yōu)勢(shì)菌種不同。健康植株根部C.orchidicola為優(yōu)勢(shì)菌種。根腐病植株根部Ceratobasidiumsp. G3為優(yōu)勢(shì)菌種(表4)。

2.3 DSE菌核顯微觀察

黃連根部觀察到大量DSE存在，DSE在黃連根內(nèi)形成顏色深且有明顯隔膜的菌絲和微菌核等典型結(jié)構(gòu)。菌絲為淺褐至深棕色，微菌核由細(xì)胞壁增厚的膨大細(xì)胞聚集形成，且形態(tài)特征、發(fā)育程度不同。有的充滿了整個(gè)細(xì)胞腔，有的尚在發(fā)育之中；有的深色或淺色；成串、成簇或單生。較多微菌核萌發(fā),有的微菌核在根部表面萌發(fā)(圖3)。

表4 健康/根腐病黃連根部DSE分離頻率比較

圖3 黃連根條中定殖的DSEFig.3 DSE colonizing in C. chinensis root A：淺色顆粒狀微菌核；B：深色顆粒狀微菌核； C：萌發(fā)的微菌核；D、E：菌絲形成的特殊結(jié)構(gòu)；F：菌絲；G：不同形態(tài)的微菌核；H：根表面萌發(fā)的微菌核；I：串狀微菌核A：Light-colored and grainy microsclerotia；B：Deep-colored and grainy microsclerotia； C：Germinating microsclerotia；D，E：Special structure of mycelium； F：Mycelium； G：Microsclerotia of different morphology； H：Microsclerotia germinating at root surface；I：Microsclerotia string

2.4 不同產(chǎn)地和年生黃連DSE定殖情況

不同產(chǎn)地的黃連DSE定殖率和定殖強(qiáng)度具有顯著差異(P<0.05)，定殖率高的為重慶石柱橫店村、石柱臥龍村、石柱河園村、開州姚程村、四川彭州春芽村，定殖率低的為四川洪雅黑林村、大邑江源村、什邡天橋村、湖北恩施太山廟村。定殖強(qiáng)度最高的為開州姚程村，最低為恩施太山廟村。不同年生的定殖率和定殖強(qiáng)度差異顯著(P<0.05)，但定殖情況和年生沒有明顯關(guān)系(表5)。

表5 不同產(chǎn)地和年生黃連DSE定殖情況

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)黃連根部DSE普遍、大量存在，且菌核形態(tài)和發(fā)育程度具有多種類型，推測(cè)為不同種類真菌形成的菌核。分離結(jié)果也表明，黃連中DSE具有多樣性。同種植物中DSE菌核形態(tài)和種類的多樣性在其他植物中也很普遍，如蒙古沙東青[13]。

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，有的DSE幼嫩菌絲膨大形成大量糖葫蘆串狀結(jié)構(gòu)，顏色淺，隨著菌齡增加，糖葫蘆串狀結(jié)構(gòu)顏色變深，推測(cè)其聚集形成微菌核。有的DSE在PDA上已開始發(fā)育出微菌核結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)基上出現(xiàn)微菌核的現(xiàn)象其他文獻(xiàn)也有報(bào)道[14]。本研究分離到的DSE在其他植物中也有定殖：Cadophorasp.是水生蘆竹、野棉花等多種植物的DSE[15-16]；Leptodontidiumsp.是馬耳草、銀穗草等的DSE[16]。

DSE的分離頻率，無論是不同地點(diǎn)的分離頻率還是總的分離頻率，健康根條均高于根腐病根條。且二者DSE種類和優(yōu)勢(shì)菌群均有差異。說明根腐病對(duì)DSE的定殖是有明顯影響的。對(duì)健康和根腐病植物的有益內(nèi)生真菌定殖情況的比較研究很少，張智慧等[17]發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)浸染率健康三七明顯高于根腐病三七，但二者根部DSE侵染率沒有明顯差別。是病原菌的入侵破壞了黃連DSE的定殖，還是根部DSE的失衡導(dǎo)致了病原菌的入侵，其因果關(guān)系有待深入研究。

很多文獻(xiàn)把從健康根條中分離出的顏色深、有隔膜的內(nèi)生真菌定義為DSE。本研究表明，即使在健康植株中，也能分離到病原真菌，如本研究從健康根條中分離到的Phomaherbarum、Phomasp. Sigrf24。前期研究從健康黃連根條中也分離到了Fusariumoxysporum，其分離頻率達(dá)5.33%，但該菌是黃連根腐病重要致病菌之一，具有強(qiáng)致病性[11]。因此，本研究對(duì)健康根條分離出的深色有隔真菌均進(jìn)行了離體回接，以篩除病原真菌。

不同年生和產(chǎn)地的黃連均有DSE定殖，但同樣年生不同產(chǎn)地，同一產(chǎn)地不同年生黃連DSE定殖強(qiáng)度和定殖率有差異，且定殖率與年生沒有明顯的關(guān)系。這種現(xiàn)象在其他植物中也很普遍[18-19]，說明DSE的定殖受土壤肥力、耕作措施、氣候環(huán)境等多種生態(tài)、人為因素的影響。

DSE對(duì)宿主的養(yǎng)分吸收、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗蟲、逆境耐受、抗重金屬能力均有促進(jìn)作用[20-22]。黃連中DSE普遍大量存在，其對(duì)宿主抗逆抗病性影響及促生作用等均值得深入研究，可為DSE開發(fā)生產(chǎn)黃連微生物肥料提供參考。

很多DSE難以產(chǎn)生孢子，不能通過形態(tài)準(zhǔn)確鑒定其種類[23]，因此，本研究未做形態(tài)鑒定。分子鑒定技術(shù)應(yīng)用于 DSE可以對(duì)其進(jìn)行大致的分類。